Introduction
الرئتين على اتصال مستمر مع البيئة الخارجية ويتعرضون للغاية لكلا جزيئات غير ضارة والميكروبات مع القدرة على التسبب في المرض. لذلك، من المهم جدا لجهاز المناعة لتركيب الاستجابات المناعية فعالة ضد الجراثيم الغازية، ولكن من المهم أيضا للحفاظ على التسامح لمستضدات استنشاقه التي لا تسبب المرض. لتوفير المراقبة المناعة قوية، واصطف الجهاز التنفسي مع وجود شبكة من الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية (DCS). البلدان النامية هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد مع قدرة فريدة على تنشيط خلايا T ساذجة. في الرئتين الإنسان، البلدان النامية المقيمين تواجه مستضد ومن ثم معالجة ونقل ذلك إلى الغدد الليمفاوية استنزاف الرئة لعرضها على وتنشيط خلايا T 1، 2، 3.
في نظام المناعة البشري، البلدان النامية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية، مع ديستانط م ولكن تداخل وظائف: CD1c + وCD141 + البلدان النامية الدم النخاعي (MDCs) وCD123 + البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS) 4، 5. في حين أن معظم المعرفة التفصيلية على البلدان النامية الإنسان تنبع من الدراسات في الدم، فمن الواضح الآن أن الرئتين الإنسان أيضا تؤوي السكان نادر من مجموعات فرعية العاصمة مع خلايا T قدرة تنشيطية 6، 7، 8، 9. ومع ذلك، تشير البيانات المتراكمة التي الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، تختلف في تكرارها، النمط الظاهري، وظيفة اعتمادا على الموقع التشريحي من 10. وبالتالي، فمن المهم دراسة الخلايا المناعية من الأنسجة ذات الصلة لفهم مساهمتها في الحصانة المحلية والتسامح. أخذت معا، وهذا يؤكد الحاجة لدراسة البلدان النامية والرئة المقيمين عند معالجة أمراض الرئة، على الرغم من البلدان النامية الدم يجري أكثر متوفرة بسهولة والوصول إليها في البشر.
أولى الدراسات التي حققت البلدان النامية والرئة المقيمين في البشر تعتمد في المقام الأول على التشكل والتعبير عن علامات واحدة، مثل HLA-DR وCD11c و، في أقسام الأنسجة باستخدام المناعية 11، 12، 13. في المقابل، المزيد من الدراسات الحديثة تعتمد عادة على cytometric تدفق التحليلات لدراسة مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية. ومع ذلك، نظرا لأنه من الصعب العثور على علامة سطح الخلية واحدة أن يعرف بشكل فريد مجموعة فرعية العاصمة محددة، والحد المحتمل للدراسات تطبق فقط أربعة ألوان قياس التدفق الخلوي هو خطر بما في ذلك سكان الخلية مع علامات المظهرية مماثلة لبلدان النامية. على سبيل المثال، يتم التعبير عن CD11c وعلى كافة DC الدم النخاعي، والغالبية العظمى من وحيدات. من ناحية أخرى، في الدراسات التي تطبق أكثر تقدما لوحات التدفق الخلوي، استخدمت أنسجة الرئة غير سرطانية من استئصال الجراحي للمرضى عادةXREF "> 10، 14، 15، 16، على الرغم من أنه من غير الواضح ما إذا كان هؤلاء السكان نادرة تمثل فعلا البلدان النامية موجودة في الاشخاص الاصحاء. وعموما، هناك دراسات محدودة إلى حد كبير يرجع ذلك إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة.
للتغلب على بعض من هذه القيود، ويصف هذا العمل كيفية إجراء تحليل مفصل لتوزيع المكاني وتحديد المظهري من البلدان النامية في الخزعات ضمن القصبة المخاطية التي تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء الذين خضعوا لتنظير القصبات. عدة خزعات صغيرة يمكن جمعها من كل فرد، ويمكن بعد ذلك أن جزءا لا يتجزأ من لباجتزاء والتحليل باستخدام المناعية أو إنزيمي هضمها لتحليل تدفق cytometric المتقدمة. باستخدام أنسجة الرئة في شكل خزعات ضمن القصبة تم الحصول عليها من bronchoscopies يمنح ميزة مما يجعل من الممكن لأداء الحاديudy على متطوعين أصحاء، على عكس الجراحة المفتوحة للرئتين، لأسباب واضحة، ويقتصر على المرضى التي تتطلب جراحة الصدر. وعلاوة على ذلك، فإن الأنسجة التي أخذت عينات خلال القصبات من المتطوعين الأصحاء أمر طبيعي من الناحية الفسيولوجية، على النقيض من منطقة غير المتضررة من أنسجة الرئة في المرضى الذين يعانون من مرض رئوي. من ناحية أخرى، الخزعات صغيرة وعدد الخلايا التي تم استردادها، حتى عندما تجمع عدة خزعات، يحد نوع من التحليلات التي يمكن القيام بها.
في حين يركز هذا العمل على البلدان النامية، والأساليب المذكورة يمكن توسيعها مباشرة لتشمل عددا آخر من الخلايا (المناعة) من الفائدة الموجودة في الأنسجة المخاطية رئة الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات هي أيضا قابلة للتطبيق مباشرة لعينات تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أمراض رئوية حيث القصبات هي جزء من وضع التشخيص، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الساركويد، أو سرطان الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البحث من قبل مجلس المراجعة الأخلاقية الإقليمي في أوميا، السويد.
1. تنظير القصبات لأخذ العينات ضمن القصبة خزعات من الموضوعات الإنسان
- الحصول على الموافقة المسبقة من جميع المشاركين.
- علاج الموضوعات مع ميدازولام عن طريق الفم (4-8 ملغ) وغليكوبيرونيوم الوريد (0،2 حتي 04 ملغ) 30 دقيقة قبل القصبات. تطبيق التخدير الموضعي مع يدوكائين في الحنجرة والقصبات الهوائية. السماح للغرغرة الموضوع مع ~ 3 مل من يدوكائين 4٪ وتطبيق 3 مل إلى قاعدة اللسان وفي الحنجرة عن طريق حقنة الحنجرة. تحسين التخدير الموضعي مع 8-10 جرعة من رذاذ يدوكائين. تنفيذ هذه الخطوة مع الجلوس الموضوع.
- إدراج المنظار الفيديو مرنة من خلال الفم عن طريق لسان حال البلاستيك مع هذا الموضوع في موقف ضعيف. استخدام رذاذ القسطرة من صنع هدف لاستكمال التخدير الموضعي من القصبة الهوائية والشعب الهوائية البعيدة عن طريق المنظار. هنا، استخدام جرعة من حوالي5-10 مل من يدوكائين 2٪.
- يستغرق 6-9 خزعات المخاطية داخل القصبة من كارينا الرئيسي والانقسامات الشعب الهوائية الرئيسية باستخدام ملقط منوفذة (الشكل 1). بعد القصبات وقبل خروجه من المستشفى، والسماح للبقية الموضوع لمدة 2-4 ساعة وتقدم له / لها مع وجبة خفيفة.
2. تضمين الخزعات في جلايكول Methylacrylate (GMA) الراتنج
ملاحظة: تم وضع بروتوكول المناعية GMA أصلا في جامعة ساوثهامبتون، وحدة بحوث كيمياء أنسجة 17.
- تثبيت: لالمناعية، وإزالة خزعات من ملقط ووضعها مباشرة في قارورة زجاجية تحتوي على 3 مل من المجففة الأسيتون ومثبطات الأنزيم البروتيني المثلج (phenylmethylsulfonyl فلوريد (35 ملغ / 100 مل الأسيتون) وiodoacetamide (370 ملغ / 100 مل الأسيتون )). إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية (الشكل 2).
ملاحظة: يجب PERFO الخطوات التاليةrmed في غطاء الدخان مع قفازات النتريل المناسبة. طقم التضمين تحتوي على المكونات التي يمكن أن تسبب ردود فعل الحساسية، وتهيج، و / أو حساسية الجلد. يجب التخلص من جميع النفايات من نفايات خطرة. - الجفاف: إزالة الأسيتون مع مثبطات واستبدالها مع الأسيتون المجففة الطازجة (بدون مثبطات) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الأسيتون واستبدالها بنزوات الميثيل لمدة 15 دقيقة.
- تسلل: إعداد محلول معالجة 5٪ حل بنزوات الميثيل في مونومر غليكول ميتاكريليت. 10 مل كافية لقنينة واحدة. استخدام ماصات باستور البلاستيك، مص قبالة حل بنزوات الميثيل واستبدالها مع 3 مل من محلول معالجة. احتضان الخزعات وحل معالجة الزائد عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. الماصات باستور يمكن استخدامها لجميع التغييرات حل لاحقة، بما في ذلك تضمين حل.
- تبادل حل معالجة كل 2 ساعة (3X 2 حضانات ساعة)، وبالتالي فإن مجموع الوقت تسلل الحيويةpsies في حل معالجة هو لا يقل عن 6 ساعة. إدراج ملصقات ورقية في نهاية العلوي من الكبسولات تضمين لتحديد الخزعات.
- يعد حل التضمين من 75 ملغ البنزويل بيروكسايد في 10 مل من مونومر غليكول ميتاكريليت. إضافة 0.25 مل من N، N بولي -dimethylaniline (أكسيد الاثيلين) (التسريع) إلى حل التضمين لبدء رد فعل البلمرة. إزالة حل معالجة ووضع خزعة واحدة في كبسولة التضمين ذات الصلة باستخدام ملقط.
- ببطء ملء الكبسولة تضمين إلى الأعلى مع تضمين حل وأغلق الغطاء. تجنب إزعاج خزعة وخلق فقاعات الهواء الكبيرة. احتضان الكبسولات في 4 درجات مئوية حتى بلمرة الراتنج تماما.
- تخزين الخزعات جزءا لا يتجزأ في -20 درجة مئوية في أنبوب 50 مل تحتوي على ما يقرب من 5 غ من هلام السيليكا.
3. باجتزاء من التحليلات ضمن القصبة جزءا لا يتجزأ من GMA-
- طلاء شريحة المجهر: تغسل الشرائح المجهر فيغسالة الصحون في دورة عادية. تغطية الشرائح والسماح لهم الهواء الجاف.
- يعد حل طلاء من 10٪ بولي-L-ليسين (PLL) حل في الماء المقطر. غمر الشرائح في حل الطلاء لمدة 5 دقائق، ثم السماح لهم الهواء الجاف. تخزين جافة الشرائح المغلفة PLL في صناديق الأصلية.
- تغسل شرائح الزجاج ورقة مع 0.1٪ توين 20 في الماء المقطر. شطف الزجاج مع الايثانول 70٪ والجافة مع المناشف الورقية. قطع ريش الزجاج من قطاع الزجاج باستخدام صانع سكين. تخزين شفرات في حاوية يمنع الحركة لضمان طليعة لا يحصل تلف أو رصدت.
- خزعة تقليم: ضع الكبسولة خزعة في التقسيم كبسولة وخفض كل جانب باستخدام الكربون الصلب حافة شفرة واحدة. إزالة خزعة جزءا لا يتجزأ من GMA-ووضعه بقوة في الرذيلة. تقليم الزائد GMA من جميع أنحاء الخزعة باستخدام شفرة الفولاذ.
- GMA باجتزاء.
- إعداد 0.05٪ محلول الأمونيا مع الماء المقطر. ضع السكين والزجاج، وخزعة في الالبريد مشراح. بعناية محاذاة كتلة خزعة مع شفرة عن طريق ضبط حامل سكين وزاوية كتلة خزعة بحيث تقع شفرة مسطحة ضد سطح الكتلة.
- قطع 2 ميكرون أبواب سميكة باستخدام مشراح على سرعة القطع بطيئة واستخدام ملقط لنقل وتطفو من المقاطع على الماء والأمونيا. تطفو على أقسام لل45-90 ثانية، مما يسمح لطيف استرجاع مستضد وتتكشف من هذا الباب.
- التقاط المقاطع مع شريحة المجهر. فحص الأنسجة خزعة من تلطيخ بسرعة مع طولويدين الأزرق.
- تجفيف الشرائح على مجموعة لوحة الساخن إلى 50 درجة مئوية، وتطبيق 500 ميكرولتر من طولويدين تصفيتها وصمة عار الزرقاء إلى قسم باستخدام ماصة باستير البلاستيك. تدفئة القسم على صفيحة ساخنة حتى تبدأ حلقة الخضراء في الظهور على حافة وصمة عار، ثم غسله بالماء.
- باستخدام المجهر الضوئي، والتحقق من الأنسجة الخزعة. أقسام المستخدمة لالمناعية يجب أن يحتوي على مناطق جيدة من الصفيحة التالفةالمخصوصة وظهارة، مع عدد قليل من الغدد وكما تذكر العضلات الملساء وقت ممكن.
- كما هو الحال في القسم 3.4.2، وقطع الفروع التي لديها الأنسجة جيدة واعتقالهما مع شرائح المجهر المغلفة PLL لتلطيخ المناعى. قطع اثنين على الأقل مقاطع من كل خزعة للتحليل. الشرائح الجافة لا يقل عن 1 ساعة. بعد التجفيف، وأقسام يمكن أن تكون ملفوفة في احباط القصدير وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع، أو أنها يمكن immunostained على الفور.
4. المناعى تلطيخ من التحليلات ضمن القصبة جزءا لا يتجزأ من GMA-
ملاحظة: أزيد الصوديوم السامة. تحضير 0.1٪ محلول أزيد الصوديوم داخل غطاء الدخان وبعيدا عن الأحماض. الاتصال مع الأحماض يحرر غاز سام.
- رسم حول المقاطع باستخدام قلم الماس ذات الرؤوس وترتيب الشرائح على رف تلطيخ.
- أداء كتلة البيروكسيد. يعد حل كتلة البيروكسيديز من 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في 0.1٪ محلول أزيد الصوديوم. تطبيق ورقةذ 1 مل من كتلة البيروكسيديز إلى أقسام واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- إعداد محلول غسل 0.05 مخزنة المالحة تريس-M (TBS)، ودرجة الحموضة 7.6. تغسل الشرائح في TBS، 3X 5 دقائق.
- يعد حل كتلة BSA 1٪ في DMEM. القيام بذلك في وقت مبكر وبكميات كبيرة، قسامة وتجميده لحين الحاجة إليها. استنزاف الشرائح واحتضان المقاطع في حل كتلة لمدة 30 دقيقة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. إذا غير محددة ملزمة لا يزال يحدث، وتشمل حضانة خطوة 30 دقيقة مع كتلة المصل 5٪ من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية (CD45 أو CD1a) في TBS إلى تركيز المطلوب (CD45 المخفف في 1: 1000، CD1a المخفف في 1: 1،00) وتطبيقه على الشرائح. ساترة الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في RT.
- غسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تمييع الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز (موجهة ضد الأنواع المضيفة الأجسام المضادة الأولية، في هذه الحالة أرنب لمكافحة فأر F (أ ب "2)) في TBS إلى تركيز المطلوب (1:300 تمييع) وتطبيقه على الشرائح. احتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- إعداد معقدة لا يقل عن 30 دقيقة البيوتين البيروكسيديز streptavidin قبل الاستخدام. ضمان وجود ما يكفي لتغطية كافة الشرائح. تغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تطبيق الحل على الشرائح واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- تغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. إعداد 3-أمينو-9-ethylcarbazole (AEC) حل البيروكسيديز الركيزة (صنع في تعليمات الشركة الصانعة). تطبيقه على الشرائح واحتضان لمدة 20-30 دقيقة أو حتى شدة وصمة عار المطلوب يتطور.
- شطف الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 5 دقائق. مباين الأقسام مع حل haematoxylin تصفيتها ماير لمدة 2 دقيقة. تغسل الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 5 دقائق.
- استنزاف الشرائح وتغطية أقسام المتوسطة مع تصاعد مائي دائم. تجفيف الشرائح في 80 درجة مئوية في فرن التجفيف. السماح للشرائح حتى يبرد، ومن ثم تحميل لهم DPX ووضع ساترة.
5. القديستحليل aining
- تحليل الأقسام في 40X التكبير باستخدام المجهر الضوئي مع كاميرا محمولة متصلة بجهاز كمبيوتر.
ملاحظة: للحصول على تحليل الخلوي، العد الملون بشكل إيجابي، وخلايا الأنوية داخل الصفيحة المخصوصة القصبي وظهارة سليمة، باستثناء مناطق العضلات الملساء والغدد والأوعية الدموية الكبيرة، والأنسجة غير متطابقة أو التالفة. - متوسط عدد الخلايا وتصحيح متوسط عدد خلايا لمنطقة الصفيحة المخصوصة وطول ظهارة. ويمكن حساب منطقة الصفيحة المخصوصة وطول ظهارة باستخدام برنامج تحليل الصور.
6. الأنزيمية الهضم من ضمن القصبة الخزعات
- الخزعات غسل: استخدام ملقط معقم، مكان الخزعات سليمة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزنة هانك (HBSS) (الشكل 3). احتضان لمدة 5 دقائق على RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة. نقل الخزعات إلى د معقمإيش من قبل الصب محتوى أنبوب 15 مل مع HBSS.
- تعطيل المخاط مع DTT: استبدال HBSS في أنبوب مع 10 مل من HBSS تحتوي على 5 ملم 1،4-dithiothreitol (DTT). نقل الخزعات مرة أخرى في أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقم. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة.
- دوامة أنبوب بلطف لمدة 15 ثانية. نقل الخزعات على طبق العقيمة التي كتبها الصب محتوى أنبوب 15 مل مع HBSS والتلفزيون الرقمي الأرضي.
- نقل الخزعات إلى ثقافة المتوسط: استبدال HBSS والتلفزيون الرقمي الأرضي في الأنبوب مع 10 مل من RPMI 1640 مستنبت. نقل الخزعات مرة أخرى في أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقم. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة.
- هضم الخزعات مع كولاجيناز والدناز.
- يعد حل هضم كولاجيناز الثاني (0.25 ملغ / مل)، والدناز (0.2 ملغ / مل) في درجة حرارة ما قبل RPMI تحتوي على 1 حل M HEPES. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل بئر في عبادة الأنسجة 48-جيدا لوحة لدى عودتهم.
- ضع 1 خزعة لكل بئر في حل الهضم. احتضان لوحة على منصة تهتز لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 220 دورة في الدقيقة. ماصة صعودا وهبوطا بعد 30 دقيقة لإعادة تفريق الخزعات، وبعد 60 دقيقة، لتفصيل تماما الأنسجة.
- إعداد تعليق خلية واحدة.
- تجمع معا الخزعات هضمها من الآبار في أنبوب 50 مل بتمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون. جمع الخلايا المتبقية عن طريق غسل الآبار مع العازلة FACS المثلج (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني).
- ضغط على الأنسجة المتبقية على مصفاة الخلية باستخدام الجزء الخلفي من المكبس من حقنة. الطرد المركزي الخلايا هضمها في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف و resuspend بيليه في 5 مل من FACS العازلة الجليد الباردة. عد الخلايا يدويا باستخدام عدادة الكريات والتريبان وصمة عار الزرقاء لتقييم جدوى من الخلايا.
= "jove_title"> 7. تدفق تحليل Cytometric من الخلايا واحدة من ضمن القصبة الخزعات بعد الأنزيمية الهضم
- Resuspend وبيليه الخلية إلى ما يقرب من 1 × 10 6 خلايا في 200 ميكرولتر من FACS العازلة.
- إضافة صبغة بقاء الخلية لاستبعاد خلية ميتة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إضافة 5 ميكرولتر من FCR حجب كاشف واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة الأجسام المضادة سطح الخلية ضد CD45 (2 ميكرولتر)، النسب (CD3، CD20، CD56، CD66abce، وCD14، 2 ميكرولتر لكل منهما)، CD16 (0.5 ميكرولتر)، HLA-DR (3 ميكرولتر)، CD11c و(5 ميكرولتر)، CD123 (5 ميكرولتر)، CD1c (3 ميكرولتر)، وCD103 (2 ميكرولتر) واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تفاصيل عن الأجسام المضادة يمكن العثور عليها في قسم الطرق، ولكن عاير وتحسين الأجسام المضادة لتدفق الدقيق الكريات في الاستخدام. يغسل الأجسام المضادة الزائدة مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في 400 ز س. الحصول على عينات جديدة على قياس التدفق الخلوي أو إصلاح الخلايا في 1٪ امتصاص العرق قبل acquisit في وقت لاحقأيون.
- تحديد البلدان النامية الإنسان في الخزعات الرئة باستخدام التدفق الخلوي مقايسة 18 (الشكل 4).
ملاحظة: استخدام التدفق الخلوي برامج التحليل، وتتميز الخلايا المناعية من خلايا الرئة الأخرى التي تبوب على CD45. يمكن استبعاد الخلايا الميتة كما الخلايا التي هي ايجابية لايف / صبغ الميت. جميع CD45 + الحية الخلايا، والخلايا النسب (خلايا B وخلايا T، الخلايا القاتلة الطبيعية، العدلات، وحيدات) يمكن استبعاد باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد CD20، CD3، CD56، CD66abce، CD14، CD16 وفي قناة واحدة. وبعد ذلك، HLA-DR + خلايا سيسمح بتحديد كافة DC الإنسان. MDCs يمكن تمييزها عن PDCS على أساس التعبير عن CD11c وأو عدم وجود CD11c و، على التوالي. MDCs يمكن تقسيمها الى مزيد من CD1c + MDCs أو CD141 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الدراسات التي تميز الجهاز التنفسي الخلايا المناعية الأنسجة المقيمين الإنسان، بما في ذلك البلدان النامية، محدودة، يرجع إلى حد كبير إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة. هنا، والخطوط العريضة لطريقة أقل الغازية للحصول على أنسجة الرئة من الخزعات ضمن القصبة (EBB) من المتطوعين الأصحاء والبروتوكولات وضعت لدراسة الخلايا المناعية في النسيج باستخدام المناعية أو التدفق الخلوي.
خضع متطوعين أصحاء القصبات، كما هو موضح سابقا 19 و 20. تم نقل ستة إلى تسعة 1-2 ملم 3 خزعات المخاطية داخل القصبة من كارينا الرئيسي والانقسامات الشعب الهوائية الرئيسية لكل موضوع باستخدام ملقط منوفذة (الشكل 1A). كانت جزءا لا يتجزأ اثنين من الخزعات في GMA واستخدامها في وقت لاحق لالمناعية لتوفير المعلومات المكانية. وbiopsi المتبقيةتم هضمها وفاق إنزيمي، وتم تحليل وحيدة الخلية تعليق باستخدام متعددة الألوان التدفق الخلوي، مما سمح توصيف دقيق للمجموعات فرعية خلية نادرة (الشكل 1B).
للحصول على أكبر قدر من المعلومات المكانية ممكن من قطعة نسيج صغيرة، وجزءا لا يتجزأ من الخزعات في GMA التي تسمح لأقسام ميكرومتر سامسونج (الشكل 2A-B). كما هو متوقع، كانت الخلايا المناعية، معربا عن CD45 النادرة في نسبيا المتوسط، كانت 125 CD45 + الخلايا لكل مم 2 موجودة في أنسجة الرئة المخاطية خلال ظروف الحالة المستقرة، وفقا لتقييم المناعية (الشكل 2C). أدت سيطرة IgG1 نمط إسوي في أي تلطيخ إيجابي، مشيرا إلى خصوصية عالية من الأجسام المضادة الأولية. وتم قياس كمية عدد الخلايا الإيجابية في كل من ظهارة الرئة والكامنة الصفيحة المخصوصة وأظهر أن CD45 + المناعي خلايا كانت أكثر وفرة في لوس انجليسالمخصوصة مينا مما كانت عليه في ظهارة (الشكل 2D). وعلاوة على ذلك، تم تحديد الخلايا CD1a، معربا عن وتعداد، والأرجح أنها تمثل البلدان النامية (الشكل 2E). في المتوسط، وقد تم تحديد أقل من واحد CD1a + خلية لكل ملم 2 في الصفيحة المخصوصة الرئة في حالة مستقرة (الشكل 2F).
تقدم المناعية معلومات عن التوزيع التشريحي للخلايا في أنسجة سليمة، ولكن عادة ما تقتصر في قدرتها على تحديد الخلايا باستخدام عدة علامات على سطح الخلية. متعدد الألوان قياس التدفق الخلوي، وهذا يتوقف على الصك، لديه ميزة توفير مزيد من المعلومات في كل خلية، ويمكن استخدامه في عينات صغيرة. وكان يتم تجميع ما يصل إلى تسع الخزعات الرئة المخاطية، وغسلها، وحضنت لتعطيل المخاط. ثم هضمها كل خزعة من كولاجيناز والدناز في الآبار الفردية من بئر لوحة 48، مما أدى إلى تعليق وحيد الخلية (F igures 3A - 3B). في المتوسط، وقد تم الحصول على 1.5 × 10 6 خلايا داخل القصبة في الموضوع، ولوحظ وجود علاقة إيجابية بين العائد الخلية وقدرتها على البقاء (الشكل 3C). انخفاض بقاء الخلية لوحظ مع أعداد الخلايا أقل من المحتمل أن يكون أوضح من خلال تركيز انزيم أعلى في الخلية التي كانت دون المستوى الأمثل للخلايا. هذا هو التحدي مع الخزعات متفاوتة من حيث الحجم وكثافة الخلايا، مع بعض الخزعات أخذ العينات أكثر من الغشاء المخاطي السطحي من غيرها. كما هو متوقع، وتدفق تحليل cytometric من تعليق وحيد الخلية كشفت أنه، في المتوسط، وكانت 12٪ من الخلايا CD45 + الكريات البيض، في حين أن الغالبية العظمى من الخلايا في الأنسجة المخاطية في الرئة تحت ظروف الحالة المستقرة لا الخلايا المناعية (الشكل 3D ). وcytometric تدفق البيانات وIHC المترابطة، الذي يسلط الضوء على قوة توظيف التقنيات على حد سواء في نفس الوقت.
= "1"> الاستفادة من بروتوكول الهضم الأنزيمي، كانت ملطخة تعليق خلية من الخزعات ضمن القصبة مع لجنة من الأجسام المضادة fluorescently المسمى. وقد تم تحليل وتيرة مجموعات فرعية العاصمة مختلفة في أنسجة الرئة والتعبير عنها من CD103 مقارنة مع الخلايا في غسل القصبات أو الدم المحيطي من نفس الموضوع. وقد تم تحديد خلايا الدم النخاعي باستخدام البوابة على CD45 الحية + الكريات البيضاء التي عبرت عن HLA-DR لكن كانت سلبية بالنسبة للعلامات النسب CD3، CD20، CD56، CD66abce، CD14، CD16 والشكل (4A). في هذه الفئة من السكان قليل من الخلايا، تم تحديد بلازماوية البلدان النامية (PDCS) على أساس عدم والتعبير CD11c ووعلى التعبير عال من CD123 و HLA-DR (البط البري). بين HLA-DR + الخلايا النسب سلبي CD11c و+، سواء CD1c + (المرجان) وCD141 + (المارون) وتم تحديد البلدان النامية الدم النخاعي (الشكل 4A). لمزيد من تميز هذه فرعية الخلايا، التعبير عنها في CD10 إنتغرين 3 التي تربط لE-كادهيرين، المهم في ترسيخ الأنسجة، وتقييمها. في حين أن جميع مجموعات فرعية العاصمة، وكذلك خلايا T المتداولة في الدم المحيطي، كانت منخفضة أو سلبية لCD103، أعربت نسبة متميزة من البلدان النامية والخلايا التائية الموجودة في الرئتين من نفس الشخص CD103. كان هذا صحيحا من الخلايا الموجودة في كل من غسل القصبات وكذلك في أنسجة الرئة (الشكل 4B).
الشكل 1: أخذ عينات من الأنسجة المخاطية رئة الإنسان. تم تنفيذ (A) Bronchoscopies حول مواضيع الحصول على الخزعات داخل القصبة من الانقسامات الشعب الهوائية الرئيسية من رئة واحدة باستخدام ملقط. (ب) الخزعات إما جزءا لا يتجزأ من GMA لباجتزاء الأنسجة والمناعية (الرسم البياني الأزرق) أو إنزيمي هضمها للحصول على تعليق خلية واحدة لالتدفق الخلوي (الرسم البياني الوردي).م / الملفات / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تضمين الخزعات في الراتنج GMA. (A) تم نقل الخزعات المأخوذة من bronchoscopies فورا إلى قارورة زجاجية تحتوي الأسيتون المجففة المثلج (اللوحة اليسرى). بعد تثبيت بين عشية وضحاها، كانت مخترقة الخزعات مع حل بنزوات الميثيل. وضعت الخزعات في تضمين كبسولات مليئة تضمين حل لبدء البلمرة (لوحة المتوسطة). ويمكن تخزين الخزعات جزءا لا يتجزأ في -20 درجة مئوية أو يمكن مقطوع لتلطيخ المناعية (اللوحة اليمنى). (ب) يسلط الضوء على التخطيطي الخطوات الرئيسية في عملية الخزعات تضمين باستخدام GMA. صور الممثل الخزعات مقطوع وتبين وجود CD45 + (C) أو CD1a + الخلايا (E) مقارنة مع الضوابط نمط إسوي منها (لوحات اليمين). يظهر تلطيخ محددة باللون الأحمر، ونواة الخلية counterstained مع الهيماتوكسيلين هم باللون الأزرق. شريط النطاق = 50 ميكرون. وتشير الرسوم البيانية متوسط ± مجموعة الشرائح الربعية من CD45 + (D) أو CD1a + (F) خلايا لكل ملم 2 في ظهارة أو الصفيحة المخصوصة (ن = 20). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: الهضم الأنزيمية من خزعات لالتدفق الخلوي. (أ) خزعة ضمن القصبة مأخوذة من القصبات في طبق بيتري. تم غسلها الخزعات في HBSS، وتعامل مع DTT لإزالة المخاط، وهود يتفاعل مع كولاجيناز والدناز السابقة إلى مجموعة من الخلايا وحيدة لتحليل تدفق cytometric. (ب) يلخص التخطيطي الإجراءات الرئيسية لهضم خزعات لالتدفق الخلوي. (C) ويظهر الرسم البياني العلاقة في العائد الخلية وقدرتها على البقاء، وفقا لتقييم العد والفرز اليدوي والاستبعاد التريبان الأزرق (ن = 20). (D) وحيدة الخلية تعليق من خزعة هضمها تم تحليلها من قبل التدفق الخلوي وتقييم لجدوى والتعبير عن CD45 (الكريات البيض مستضد مشترك). والتدفق الخلوي مؤامرة يظهر المانحة ممثل واحد من كل 20 أشخاص أصحاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد الرئة فرعية الخلايا الجذعية في ب هضمهاiopsies. (أ) استراتيجية المحاصرة لتحديد CD1c + وCD141 + البلدان النامية الدم النخاعي (MDCs) والبلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS) في الأنسجة المخاطية في الرئة. ويبين التدفق الخلوي المؤامرات من موضوع تمثيلي واحد. (ب) مؤامرات نقطة تظهر التعبير عن CD103 إنتغرين على سكان البلدان النامية في الخزعات الرئة (اللوحة اليسرى)، غسل القصبات (وسط لوحة)، والدم المحيطي (اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتصف هذه الورقة كيفية إنشاء توصيف المكاني وphenotypical مفصل من الرئة البلدان النامية الأنسجة المقيمين في البشر صحية باستخدام المناعية والتدفق الخلوي على خزعات المخاطية داخل القصبة التي تم جمعها خلال تنظير القصبات. في الفقرات التالية تناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول في التفاصيل.
خطوات حاسمة للبروتوكول
باجتزاء والمناعية: فمن الأهمية بمكان للحفاظ على القطع الخزعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية عند عدم استخدامها (الخطوة 2.5). يمكن كتل دافئة أحيانا تصبح لينة ولن القسم أيضا. بالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على كتل في -20 درجة مئوية والحفاظ على المواقع المستضد ويؤدي إلى أفضل تلطيخ باستخدام المناعية.
باجتزاء والمناعية: عند باجتزاء الخزعات جزءا لا يتجزأ من GMA، وأنها مريحة لديك 3-4 حاويات من الماء والأمونيا المتاحة لتعويم أقسام جرا. عندما اختار القسم حتى، يا أماهكه تأكد من استبدال ذلك مع قسم جديد (الخطوة 3.4). هذا يضمن أن، في الوقت الذي يتم التعامل مع هذا الباب مرة أخرى، فإنه سيكون قد تم تطفو على الماء والأمونيا ما يقرب من طول الصحيح من الساعة (45-90 ثانية)، والذي يساعد في تقديم المستضد والمناعية لاحقة. قطع 2 ميكرون المقاطع في هذا الشكل يسمح أيضا لباجتزاء التوالي، وهو ما يعني أن الخلية نفسها من المحتمل أن تكون ملطخة مع مختلف سطح الخلية أو علامات داخل الخلايا. ومن المهم عدم لمس حافة القطع النصل الزجاج عندما باجتزاء، وتلف بسهولة. إذا كان هناك أي حطام من النصل الذي يحتاج إلى إزالتها، وفرشاة دائما بعيدا عن حافة القطع.
الهضم الأنزيمي والتدفق الخلوي: في عينات الأنسجة حيث الخلايا المناعية نادرة، فمن الأهمية بمكان أن تشمل CD45 في لوحة تدفق تلطيخ أولا تحديد الكريات البيض (في الأقلية) قبل زيادة تحديد البلدان النامية أو غيرها من الخلايا المناعية من الفائدة. أيضا، "وluorescence ناقص واحد "أو نمط إسوي ضوابط حاسمة لتشمل أثناء التحقق من صحة وحات الأجسام المضادة المستخدمة للتأكد من أن الأحداث النادرة هي إشارة حقيقية على الضوضاء.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
باجتزاء والمناعية: بالنسبة لمعظم علامات الخلوية التي أعرب عنها الخلايا المناعية والأنسجة لوزة الحلق يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إيجابية جيدة وعاير الأجسام المضادة المناعية من أجل تجنب إضاعة محدودة المواد خزعة داخل القصبة (الخطوة 4). لتصور عمليات شجيري من البلدان النامية، الأنسجة يمكن مقطوع بالتوازي مع ظهارة، بدلا من عموديا من خلال الغشاء المخاطي 21. ركائز البيروكسيديز الأخرى يمكن استخدامها، بالإضافة إلى لجنة الطاقة الذرية، مثل DAB، إذا كان المستخدم يحتاج إلى اللون الركيزة مختلفة. ويمكن أيضا أن تكون بديلا مجمع إنزيم أفيدين / البيوتين، على سبيل المثال، مع الفوسفاتيز القلوية.
الهضم الأنزيمي والتدفق الخلوي: على الرغم من أن نهايةالخزعات obronchial صغيرة، وخلايا الأنسجة المقيمين البقاء على قيد الحياة الهضم الأنزيمي والتجهيز في تعليق وحيد الخلية لتحليل تدفق cytometric (الشكل 3). ومع ذلك، فمن المهم تقييم التأثير المحتمل للالانزيمات على البقع المستخدمة في التدفق الخلوي لوحة الأجسام المضادة. لاختبار ما إذا كان يشق بروتوكول الأنزيمية الهضم خارج، يغير، أو يتداخل مع تلوين الأجسام المضادة، أكثر سهولة الخلايا معربا عن علامات مماثلة، مثل خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية، يمكن علاجها مع الانزيمات الهاضمة (الخطوة 6) أم لا، وأنها ويمكن بعد ذلك ملطخة الأجسام المضادة fluorescently المسمى وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي (الخطوة 7). إذا كان كولاجيناز والدناز لا تتداخل مع توافر مستضد، ينبغي للبقع مع أو بدون علاج الخلايا مع الانزيمات مشابها. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من استخدام كل من التدفق الخلوي، فضلا عن أقسام الأنسجة والمناعية سليمة (فايgures 2-3) 19.
القيود المفروضة على تقنية
القصبات: معظم الأصحاء الأفراد تتسامح مع القصبات بشكل جيد، وأنه هو وسيلة تستخدم بشكل روتيني لفحص وأخذ عينات من الرئتين، بما في ذلك جمع خزعات المخاطية داخل القصبة، كما هو موضح هنا (الخطوة 1). ومع ذلك، القصبات هي عادة ليست طريقة مناسبة لأداء لأخذ العينات الطولية، لأنه غالبا ما ينظر إليها على أنها غير مريحة، وأنه هو أيضا إجراء زمني ويطالب الموارد. لذلك، توفر الخزعات ضمن القصبة فقط لقطة من الخلايا المناعية الموجودة في الأنسجة المخاطية في الرئة في وقت معين، بدلا من دراسة طويلة الأجل للتغيرات في ديناميات أو حركية.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
باجتزاء والمناعية: ميزة التضمين في GMA بدلا من البارافين أو عن طريق الحفظ بالتبريدهو الحفاظ متفوقة من التشكل ومولدات المضادات، وعدد أكبر من المقاطع من الخزعات صغيرة، ويرجع ذلك إلى الشرائح الرقيقة التي يمكن الحصول عليها 17.
الهضم الأنزيمي والتدفق الخلوي. من خلال الحصول على الخلايا واحد من الخزعات صغيرة، لا يمكن أن يتحقق المزيد من المعلومات من قبل متعدد الألوان التدفق الخلوي.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
ووصف هذا البروتوكول طريقتين موازية لتحقيق أقصى قدر من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من الخزعات ضمن القصبة الصغيرة من خلال الجمع بين المناعية والتدفق الخلوي. لتوصيف التوزيع المكاني للخلايا المناعية النادرة مثل البلدان النامية، الخزعات يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في GMA للحصول على الشرائح الرقيقة لالمناعية، في حين أن التمييز بين البلدان النامية من الخلايا المناعية الأخرى مع علامات مماثلة، والهضم الأنزيمي من الخزعات يسمح متعددة الألوان قياس التدفق الخلوي أن تكون المؤسسة العامةrformed. للتمكين من التعرف متحيز من الخصائص الجديدة من البلدان النامية خلال التهاب أو مرض، وتحليل الآلي للبيانات تدفق cytometric لا يمكن أن يؤديها من خلال تطبيق خوارزميات استخراج ميزة 22. وتشمل التطبيقات المستقبلية باستخدام هذه الخلايا وحيدة الخلية الفرز لجمع السكان خلية معينة والتي يمكن استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أو التنميط transcriptomic. قد يكون تحديد البلدان النامية المقيمين في الرئتين مهم لفهم التغيرات التي طرأت على المشهد المناعة أثناء الصحة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر المتطوعين الذين ساهموا المواد السريرية لهذه الدراسة. ونحن أيضا ممتنون للموظفين في وزارة الصحة العامة والطب السريري، شعبة الطب / طب الجهاز التنفسي في مستشفى جامعة، أوميا (Norrlands universitetssjukhus) لجمع جميع المواد السريرية.
وأيد هذا العمل عن طريق منح ل AS-S من مجلس السويدية البحوث، والمؤسسة السويدية القلب والرئة، والمؤسسة السويدية للأبحاث الاستراتيجية، ومعهد كارولينسكا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
