Introduction
Os pulmões estão em contato contínuo com o ambiente externo e estão altamente expostos a ambas as partículas inofensivas e micróbios com a capacidade de causar doença. Portanto, é crítica para o sistema imunitário para montar respostas imunitárias potentes contra patogénios invasores, mas é igualmente importante para manter a tolerância a antigénios inalados que não causam doença. Para fornecer potente vigilância imunitária, o sistema respiratório é revestido com uma rede de células imunitárias, incluindo as células dendríticas (DC). DC são células profissionais de apresentação de antigénio, com a capacidade única para activar células T ingénuas. Em pulmões humanos, as DCs residentes encontram um antigénio e, em seguida, processo e transportá-lo para os gânglios linfáticos de drenagem do pulmão para a apresentação e a activação de células T 1, 2, 3.
No sistema imunológico humano, as DCs pode ser dividido em vários sub-grupos, com Distinct mas sobrepostos funções: CD1c + e CD141 + DCs mielóides (MDCs) e CD123 + DCs plasmocitóides (PDCs) 4, 5. Enquanto o conhecimento mais detalhado em DC humanas provém de estudos em sangue, é agora evidente que os pulmões humanos também abrigam populações raras de subconjuntos de DC com a capacidade de células T estimuladoras 6, 7, 8, 9. No entanto, os dados mostram que se acumulam as células imunitárias, incluindo as DCs, diferem na sua frequência, fenótipo e função, dependendo da sua localização anatómica 10. Assim, é importante para estudar as células imunes do tecido relevante para compreender a sua contribuição para a imunidade local e tolerância. Tomados em conjunto, o que sublinha a necessidade de estudar DCs pulmão residente quando confrontados com doenças pulmonares, apesar de DCs do sangue sendo mais prontamente disponíveis e acessíveis em humanos.
Os primeiros estudos que investigaram DCs pulmão residente em seres humanos se baseou principalmente na morfologia ea expressão de marcadores individuais, tais como HLA-DR e CD11c, em secções de tecido usando imunohistoquímica 11, 12, 13. Em contraste, estudos mais recentes têm normalmente dependiam de citometria de fluxo analisa a estudar diferentes subpopulações de células imunes. No entanto, uma vez que é difícil encontrar um único marcador de superfície celular que identifica exclusivamente um subconjunto específico DC, a limitação potencial de estudos que se aplique apenas quatro cores de citometria de fluxo é o risco de, incluindo populações de células com marcadores fenotípicos semelhantes, como DCs. Por exemplo, CD11c é expressa em todos os DCs mielóides e a grande maioria dos monócitos. Por outro lado, estudos em painéis de aplicação mais avançada de citometria de fluxo, o tecido de pulmão não-cancerosas de ressecções cirúrgicas de pacientes foram tipicamente utilizadosrefex "> 10, 14, 15, 16, embora não esteja claro se estas populações raras são verdadeiramente representativa de DCs presente em indivíduos saudáveis. No geral, os estudos são limitados, em grande parte devido ao facto de cirurgicamente removidas ou de tecido de pulmão humano total é escassa.
Para superar algumas destas limitações, este trabalho descreve como realizar uma análise detalhada da distribuição espacial e uma identificação fenotípica de DCs em biópsias endobrônquicas mucosas obtidas de voluntários saudáveis que se submetem a uma broncoscopia. Várias pequenas biópsias podem ser coletadas de cada indivíduo e pode, posteriormente, ser incorporado para corte e análise utilizando imuno-histoquímica ou enzimaticamente digerido para análise avançada de citometria de fluxo. Utilizando tecido pulmonar sob a forma de biópsias endobronquiais obtidos a partir de broncoscopia confere a vantagem de tornar possível realizar o rudy em voluntários saudáveis, ao contrário da cirurgia aberta dos pulmões que, por razões óbvias, é limitado a pacientes que necessitam de cirurgia torácica. Além disso, o tecido que é amostrado durante uma broncoscopia de voluntários saudáveis é fisiologicamente normal, em contraste com uma área não afectada do tecido pulmonar em pacientes com uma doença pulmonar. Por outro lado, as biópsias são pequenos e o número de células recuperadas, mesmo quando o agrupamento diversas biópsias, limita o tipo de análises que podem ser realizadas.
Embora o presente trabalho se concentra em DCs, os métodos descritos podem ser diretamente ampliada para incluir outras células (imunes) de interesse que residem no tecido da mucosa do pulmão humano. Além disso, os protocolos são também directamente aplicáveis às amostras obtidas de pacientes que sofrem de doenças pulmonares, onde broncoscopia faz parte de estabelecer o diagnóstico, tais como a doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), sarcoidose, ou câncer de pulmão.
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Protocol
NOTA: Esta pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Revisão Ética regional no Umeå, na Suécia.
1. A broncoscopia para Amostragem endobrônquica Biópsias de Seres Humanos
- Obter o consentimento informado de todos os participantes.
- Tratar indivíduos com midazolam oral (4-8 mg) e glicopirr�nio intravenosa (0,2-04 mg) 30 minutos antes da broncoscopia. Aplicar anestesia tópica com lidocaína na laringe e os brônquios. Deixe o gargarejo assunto com ~ 3 ml de lidocaína 4% e aplicar 3 ml à base da língua e na laringe através de uma seringa laringe. Otimizar a anestesia tópica com 8-10 doses de lidocaína spray. Realizar esta etapa com a estar sujeito.
- Inserir um broncoscópio de vídeo flexível pela boca através de um bocal de plástico com o sujeito na posição supina. Use um cateter de pulverização feita de propósito para completar a anestesia tópica da traquéia distal e brônquios através do broncoscópio. Aqui, utilizar uma dose de aproximadamente5-10 ml de lidocaína a 2%.
- Tome 6-9 biópsias da mucosa endobrônquica da carina principal e as principais divisões brônquicas usando uma pinça fenestrados (Figura 1). Após a broncoscopia e antes de deixar o hospital, deixar o resto assunto para 2-4 horas e fornecer a ele / ela com uma refeição ligeira.
2. Incorporação das biópsias em Glicol Metiloacrilado (GMA) Resin
NOTA: O protocolo imunocoloração GMA foi originalmente desenvolvido na Universidade de Southampton, Unidade histoquímica Investigação 17.
- Fixação: Para imuno-histoquímica, remover as biópsias do fórceps e colocá-las directamente em frascos de vidro contendo 3 ml de inibidores de acetona e protease desidratados gelado (fluoreto de fenilmetilsulfonilo (35 mg / 100 ml de acetona) e iodoacetamida (370 mg / 100 ml de acetona )). Corrigir o tecido durante a noite a -20 ° C (Figura 2).
NOTA: Os seguintes passos devem ser performada em um exaustor com luvas de borracha nitrílica apropriadas. O kit incorporação contém componentes que podem causar reações de sensibilização, irritação e / ou de pele alérgica. Todos os resíduos devem ser eliminados como resíduos perigosos. - Desidratação: Remover a acetona com inibidores e substituir com acetona desidratada fresco (sem inibidores) durante 15 min à temperatura ambiente (TA). Remova a acetona e substituí-lo com benzoato de metilo em 15 min.
- Infiltração: Prepara-se uma solução de processamento da solução de benzoato de metilo 5% em monómero de metacrilato de glicol; 10 ml é suficiente para um frasco para injectáveis. Usando pipetas de Pasteur de plástico, de aspiração a partir da solução de benzoato de metilo e substituir com 3 ml de solução de processamento. Incubam-se as biópsias e solução de processamento em excesso a 4 ° C durante 2 horas; Pipetas de Pasteur pode ser usado para todas as alterações de solução subsequentes, incluindo a incorporação de solução.
- Troque a solução de processamento a cada 2 horas (3x 2 incubações hr), de modo que o tempo total de infiltração do biopsies na solução de transformação é de pelo menos 6 horas. Inserir etiquetas de papel para dentro da extremidade superior das cápsulas de embebimento para identificar as biópsias.
- Prepara-se uma solução de incorporação de 75 mg de peróxido de benzoílo em 10 mL de monómero metacrilato de glicol. Adicionar 0,25 ml de N, N-dimetilanilina poli (óxido de etileno) (acelerador) à solução de incorporação para iniciar a reacção de polimerização. Remover a solução de transformação e colocar uma biópsia de dentro da cápsula incorporação relevante usando uma pinça.
- Lentamente encher a cápsula incorporação ao topo com uma solução de incorporação e fechar a tampa. Evitar perturbar a biópsia e criando grandes bolhas de ar. Incubam-se as cápsulas a 4 ° C até que a resina tenha polimerizado completamente.
- Armazenar as biópsias incorporados a -20 ° C em um tubo de 50 ml contendo cerca de 5 g de gel de sílica.
3. Seccionamento de endobrônquicos Biópsias GMA-encaixados
- revestimento de lâmina de microscópio: Lavar as lâminas de microscópio em ummáquina de lavar louça num ciclo normal. Cobrir os slides e permitir-lhes a secar ao ar.
- Prepara-se uma solução de revestimento de 10% de poli-L-lisina solução (PLL) em água destilada. Submergir as lâminas em solução de revestimento para 5 min, e depois deixá-los secar ao ar. Armazenar lâminas revestidas com PLL secos em suas caixas originais.
- Lavar as tiras da folha de vidro com 0,1% de Tween 20 em água destilada. Lavar o copo com 70% de etanol e seco com toalhas de papel. Cortar lâminas de vidro da faixa de vidro usando um fabricante de faca. Armazenar as lâminas num recipiente que impede o movimento para garantir que a aresta de corte não seja danificada ou cortada.
- Biópsia aparar: Coloque a cápsula biópsia em um divisor de cápsula e reduzir cada lado usando uma lâmina de ponta única em aço carbono. Remova a biópsia GMA-incorporado e coloque-a firmemente em um vício. Apare o excesso GMA de todo o biópsia usando a lâmina de aço.
- seccionamento GMA.
- Preparar uma solução de amoníaco a 0,05% com água destilada. Coloque a faca de vidro e biópsia em the micrótomo. alinhar cuidadosamente o bloco de biópsia com a lâmina, ajustando o suporte da faca e o ângulo do bloco de biópsia de modo que a lâmina assenta plana contra a superfície do bloco.
- Corte 2 mm de espessura utilizando o micrótomo em uma velocidade de corte lento e utilize uma pinça para transferir e flutuar as seções sobre a água de amônia. Flutuar as seções de 45-90 segundos, permitindo a recuperação antigênica gentil e desdobramento da seção.
- Pegar seções com lâmina de microscópio. Verifique a histologia da biópsia pela coloração rapidamente com azul de toluidina.
- Secam-se as lâminas em conjunto uma placa quente a 50 ° C e aplica 500 ul de corante azul de toluidina filtrou-se para uma secção utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico. Aqueça a seção sobre a chapa quente até um anel verde começa a surgir na borda da mancha, e, em seguida, lave-a com água.
- Usando um microscópio de luz, verifique a histologia biópsia. Secções utilizados para imuno-histoquímica deve conter boas áreas da lâmina não danificadopropria e do epitélio, com o menor número de glândulas e tão pouco músculo liso possível.
- Como no ponto 3.4.2, cortar seções que têm boa histologia e buscá-las com lâminas de microscópio PLL-revestidos para coloração imuno-histoquímica. Cortar, pelo menos, duas secções de cada biópsia para análise. lâminas secar por pelo menos 1 hora. Depois da secagem, as secções podem ser embrulhados em papel de alumínio e armazenadas a -20 ° C durante até 2 semanas, ou eles podem ser imediatamente imunocoradas.
4. imuno Coloração de endobrônquicos Biópsias GMA-encaixados
NOTA: A azida sódica é tóxica. Preparar a solução de azida de sódio a 0,1% dentro de um extractor de fumo e de distância a partir de ácidos. Em contacto com ácidos liberta gases tóxicos.
- Desenhar em torno seções usando uma caneta com ponta de diamante e organizar os slides em um rack de coloração.
- Execute um bloco peroxidase. Prepara-se uma solução de bloqueio da peroxidase de peróxido de hidrogénio a 0,3% em solução de azida de sódio a 0,1%. Apply 1 ml de peroxidase para o bloco de secções e incubar durante 30 min.
- Prepara-se uma solução de lavagem com solução salina 0,05 M tamponada com Tris (TBS), pH 7,6. Lavar as lâminas em TBS, 3x 5 min.
- Prepara-se uma solução do bloco de BSA a 1% em DMEM. Fazer isso com antecedência e em volumes grandes, alíquota e congelá-lo até que seja necessário. Escorra os slides e incubar as seções de solução de bloco para 30 min para bloquear anticorpo inespecífico vinculativo. Se a ligação não específica ainda ocorre, incluem um passo de incubação de 30 minutos com 5% de soro de bloco a partir das mesmas espécies como o anticorpo secundário.
- Dilui-se o anticorpo primário (CD45 ou CD1a) em TBS até à concentração desejada (CD45 diluído a 1: 1000; CD1a diluído a 1: 1,00) e aplicá-lo a slides. Lamela as seções e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas em TBS três vezes. Dilui-se o anticorpo secundário biotinilado (dirigido contra as espécies hospedeiras anticorpo primário, no caso de coelho anti-rato F (ab '2)) em TBS até à concentração desejada (1:300 diluição) e aplicá-lo aos slides. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Prepara-se uma estreptavidina-peroxidase de biotina complexo de pelo menos 30 min antes da utilização. Certifique-se de que não é suficiente para cobrir todos os slides. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Aplicar a solução para as lâminas e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas em TBS três vezes. Preparar 3-amino-9-etilcarbazole solução de substrato de peroxidase (AEC) (feita segundo as instruções do fabricante). Aplicá-lo para as lâminas e incubar durante 20-30 minutos ou até que a intensidade da coloração desejada desenvolve.
- Lavar as lâminas em água corrente durante 5 min. Contracoloração das secções com solução de hematoxilina de Mayer filtrada por 2 min. Lavar as lâminas em água corrente durante 5 minutos.
- Escorra as lâminas e cobrir as seções com meio de montagem aquoso permanente. Seca-se as lâminas a 80 ° C num forno de secagem. Permitir que os slides para esfriar, e depois montá-los com DPX e colocar uma lamela.
5. StAnálise aining
- Analisar as secções de ampliação de 40X usando um microscópio óptico com uma câmara montada ligado a um computador.
NOTA: Para a análise celular, contagem positivamente coradas, as células nucleadas na lâmina própria e epitélio brônquico intacto, excluindo as áreas de músculo liso, glândulas, grandes vasos sanguíneos e tecido incompatíveis ou danificado. - Calcular a média dos contagens de células e corrigir a contagem celular média para a região da lâmina própria e o comprimento do epitélio. A área da lâmina e o comprimento do epitélio pode ser calculado utilizando um programa de análise de imagem.
6. Digestão Enzimática de endobrônquico Biópsias
- Biópsias de lavagem: Utilizando fórceps estéreis, lugar biópsias intactas num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de solução salina tamponada de Hank (HBSS) (Figura 3). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm. Transferir as biópsias para um d estérilish por decantação o conteúdo do tubo de 15 ml com HBSS.
- Interrompendo muco com DTT: Substituir a HBSS no tubo com 10 ml de HBSS contendo 5 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT). Transferir as biópsias de volta para o tubo de 15 ml usando uma pinça estéril. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm.
- Vortex suavemente o tubo por 15 s. Transferir as biópsias num prato esterilizado por decantação o conteúdo do tubo de 15 ml com HBSS e DTT.
- Transferir as biópsias para o meio de cultura: Substituir a HBSS e DTT no tubo com 10 ml de meio de cultura RPMI 1640. Transferir as biópsias de volta para o tubo de 15 ml usando uma pinça estéril. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm.
- A digestão com colagenase biópsias e ADNase.
- Prepara-se uma solução de digestão de colagenase II (0,25 mg / ml) e ADNase (0,2 mg / ml) em RPMI pré-aquecido contendo uma solução 1 M de HEPES. Adicionar 500 uL de solução de digestão por poço numa culto de tecido de 48 poçosplaca ure.
- Coloque uma biópsia por poço em solução digestão. Incubar a placa sobre uma plataforma de agitação durante 60 min a 37 ° C a 220 rpm. Pipeta-se para baixo e depois de 30 minutos para re-dispersam as biópsias, e após 60 min, para desagregar o tecido completamente.
- Preparação de suspensões de células únicas.
- Piscina em conjunto as biópsias digeridos a partir dos poços para um tubo de 50 mL passando-a através de um filtro celular de 40 uM. Recolher os restantes células por lavagem dos poços com tampão de FACS gelada (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo soro fetal bovino a 2%).
- Apertar o tecido remanescente no filtro de células utilizando a parte de trás do êmbolo de uma seringa. Centrifugar as células digeridos a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de FACS gelada. Contar as células utilizando um hemocitómetro e manualmente Tripano mancha azul para avaliar a viabilidade das células.
- Ressuspender o sedimento celular a aproximadamente 1 X 10 6 células em 200 ul de tampão de FACS.
- Adicionar um corante de viabilidade celular para a exclusão de células mortas de acordo com o protocolo do fabricante.
- Adicionam-se 5 ul de reagente de bloqueio FcR e incubar durante 5 min a 4 ° C.
- Adicionar anticorpos de superfície celular contra CD45 (2 ul), linhagem (CD3, CD20, CD56, CD66abce, e CD14; 2 ul cada), CD16 (0,5 mL), HLA-DR (3 mL), CD11c (5 ul), CD123 (5 ul), CD1c (3 mL), e CD103 (2 uL) e incubar durante 15 min a 4 ° C. Detalhes sobre anticorpos pode ser encontrado na secção Métodos, mas dosear e optimizar os anticorpos para o fluxo preciso citómetro em uso. Lavar anticorpos em excesso com PBS durante 5 min a 400 x g. Adquirir as amostras frescas em um citômetro de fluxo ou corrigir as células em paraformaldeído 1% antes da acquisit tardeíon.
- Identificar DC humanas em biópsias pulmonares utilizando um ensaio de citometria de fluxo de 18 (Figura 4).
NOTA: Usando uma citometria de fluxo de software de análise, as células imunes são distinguidos de outras células do pulmão por gating em CD45. As células mortas pode ser excluída como células que são positivas para o corante VIVO / MORTO. De todos CD45 + células vivo, células de linhagem (células B, células T, células NK, neutrófilos e monócitos) pode ser excluída usando um cocktail de anticorpos contra CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, e CD16 em um canal. Seguindo que as células, HLA-DR + permitirá a identificação de todos os DCs humanas. MDCs pode ser distinguida de PDC com base na expressão de CD11c ou a falta de CD11c, respectivamente. MDCs pode ainda ser dividido em cd1c + MDCs ou CD141 +.
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Representative Results
Estudos que caracterizam as células do tecido residente respiratórias humanas imunes, incluindo as DCs, são limitadas, principalmente devido ao fato de que cirurgicamente removidas ou de tecido de pulmão humano total é escassa. Aqui, um método menos invasivo de obtenção de tecido de pulmão a partir de biópsias endobronquiais (EBB) de voluntários saudáveis e os protocolos desenvolvidos para estudar as células do sistema imunológico no tecido usando imuno-histoquímica ou citometria de fluxo são descritos.
Voluntários saudáveis foram submetidos a broncoscopia, como descrito anteriormente 19, 20. Seis a nove 1-2 mm 3 biópsias da mucosa endobrônquica foram tomadas a partir da carina principal e as principais divisões brônquicas de cada sujeito usando uma pinça fenestrados (Figura 1A). Duas biópsias foram embebidos em GMA, e depois utilizados para imuno-histoquímica para proporcionar informação espacial. O restante biopsiES foram enzimaticamente digeridos, e as suspensões unicelulares foram analisados utilizando multi-cor citometria de fluxo, o que permitiu a caracterização cuidadosa de subconjuntos raros de células (Figura 1B).
Para obter o máximo de informação espacial possível dos pequenos pedaços de tecido, as biópsias foram embebidos em GMA que permite secções ultrafinas uM (Figura 2A-B). Como esperado, as células imunes que expressam CD45 foram relativamente rara-em média, de 125 células CD45 + por mm 2 estavam presentes no tecido pulmonar, mucosa durante condições de estado estacionário, conforme avaliado por imuno-histoquímica (Figura 2C). O controlo do isotipo de IgG1 não resultou em nenhuma coloração positiva, indicando a alta especificidade do anticorpo primário. O número de células positivas tanto no epitélio do pulmão e da lâmina própria subjacente foram quantificadas e mostraram que as células CD45 + foram mais abundantes imunes no laMina própria do que no epitélio (Figura 2D). Além disso, as células CD1a expressando foram identificadas e enumeradas, e eles provavelmente representam DCs (Figura 2E). Em média, menos do que uma célula de CD1a + por mm 2 foi identificado na lâmina própria do pulmão em estado estacionário (Figura 2F).
A imuno-histoquímica fornece informações sobre a distribuição anatómica de células em tecido intacto, mas é, tipicamente, limitada na sua capacidade para definir as células utilizando múltiplos marcadores na superfície celular. Multi-cor citometria de fluxo, dependendo do instrumento, tem a vantagem de proporcionar mais informação por célula, e pode ser usado em pequenas amostras. Até nove biópsias mucosas pulmonares foram reunidas, lavadas, e incubadas a perturbar o muco. Cada biópsia foi então digerido por colagenase e ADNase em poços individuais de uma placa de 48 bem, resultando numa suspensão de uma única célula (Figures 3A - 3B). Em média, foram obtidos 1,5 x 10 6 células endobronquiais por objecto, e uma correlação positiva entre o rendimento celular e a viabilidade foi observado (Figura 3C). A viabilidade celular reduzida observada com números de células mais baixos poderiam ser explicados por uma maior concentração de enzima por célula que foi sub-óptima para as células. Este é um desafio com biópsias variando em tamanho e da densidade de células, com algumas biópsias amostragem mais da mucosa superficial do que outros. Como esperado, citometria de fluxo e a suspensão de célula única revelou que, em média, 12% das células eram CD45 + leucócitos, enquanto que a maioria das células no tecido da mucosa pulmonar sob condições de estado estacionário não foram células imunes (Figura 3D ). A citometria de fluxo e os dados IHC correlacionados, o que destaca a força da utilização de ambas as técnicas em paralelo.
+ leucócitos que expressa HLA-DR, mas foram negativos para os marcadores de linhagem CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14, e CD16 (Figura 4A). Neste pequena população de células, plasmocit�des DCs (PDCs) foram identificados com base na sua falta de expressão CD11c e sua elevada expressão de CD123 e HLA-DR (cer). Entre as células de linhagem negativa-HLA-DR + CD11c +, ambos CD1c + (coral) e CD141 + (castanho) foram identificados DCs mielóides (Figura 4A). Para melhor caracterizar estas subpopulações de células, a sua expressão do CD10 integrina 3 que se liga a E-caderina, importante para ligar o tecido, foi avaliada. Enquanto todos os subconjuntos de DC, bem como células T circulantes no sangue periférico, foram baixas ou negativas para CD103, uma parte distinta de células T e DCs encontrados nos pulmões de um mesmo indivíduo expressa CD103. Isto era verdadeiro tanto de células encontradas no lavado broncoalveolar, bem como no tecido pulmonar (Figura 4B).
Figura 1: Amostra de tecido da mucosa do pulmão humano. Broncoscopia (A) foram realizados em indivíduos para obter biópsias endobrônquicas das principais divisões brônquicas de um pulmão, usando uma pinça. (B) As biópsias foram seja incorporado em GMA para corte de tecido e imuno-histoquímica (azul diagrama) ou enzimaticamente digerido para obter uma única célula suspensões por citometria de fluxo (diagrama de rosa).m / files / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Incorporação das biópsias em resina GMA. (A) As biópsias retiradas de broncoscopia foram imediatamente transferidas para frascos de vidro contendo acetona desidratada gelada (painel da esquerda). Após fixação durante a noite, as biópsias foram infiltradas com uma solução de benzoato de metilo. As biópsias foram colocados na incorporação de cápsulas cheias com a incorporação de solução para iniciar a polimerização (painel do meio). biópsias incorporado podem ser armazenadas a -20 ° C ou pode ser segmentado para a coloração imuno-histoquímica (painel da direita). (B) Os passos principais destaques esquemáticos no processo de biópsias de incorporação utilizando GMA. Imagens representativas de biópsias seccionadas mostrando a presença de CD45 + (C) ou CD1a + células (E) são mostrados em comparação com os respectivos controlos isotípicos (painéis da direita). A coloração específica é mostrado em vermelho, e núcleos de células contrastadas com hematoxilina estão em azul. Barra de escala = 50 mm. Os gráficos de barras mostram a mediana ± gama interquartil de CD45 + (D) ou CD1a + (F) células por mm2 no epitélio ou da lâmina própria (n = 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A digestão enzimática das biópsias para citometria de fluxo. (A) Uma biópsia endobrônquica feita a partir de uma broncoscopia numa placa de Petri. As amostras foram lavadas em HBSS, tratada com DTT para remover o muco, umad digerido com colagenase e ADNase, antes da colheita de células individuais para análise de citometria de fluxo. (B) O esquema sumariza os principais processos de digestão de biópsias por citometria de fluxo. (C) O gráfico mostra a correlação com um rendimento de células e a viabilidade, tal como avaliado por contagem manual e de exclusão de azul de tripano (n = 20). (D) As suspensões de célula única a partir da biópsia digerido foram analisadas por citometria de fluxo e avaliadas quanto a viabilidade e a expressão de CD45 (antigénio de leucócitos comum). A citometria de fluxo gráfico mostra um doador representativa de 20 indivíduos saudáveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação de pulmão subconjuntos de células dendríticas em b digeridoiopsies. (A) gating estratégia para a identificação de CD1c + e DC CD141 + mielóides (MDCs) e DCS plasmocitoides (PDC) no tecido da mucosa pulmonar. A citometria de fluxo parcelas de um assunto representante são mostrados. (B) Os gráficos de pontos mostram a expressão do CD103 integrina nas populações de DCs em biópsias pulmonares (painel esquerdo), a lavagem broncoalveolar (painel do meio), e sangue periférico (painel da direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve como gerar uma caracterização espacial e fenotípica detalhada do pulmão DCs tecido residentes em humanos saudáveis utilizando imuno-histoquímica e citometria de fluxo em biópsias da mucosa endobrônquica recolhidos durante broncoscopia. Nos parágrafos seguintes etapas críticas do protocolo são discutidos em detalhe.
Passos críticos com o Protocolo
Seccionamento e imuno-histoquímica: É crítico para manter os blocos de biópsia a -20 ° C quando não se usa-los (passo 2.5). blocos quentes às vezes pode tornar-se macio e não vai seção também. Além disso, mantendo-se os blocos a -20 ° C irá preservar os locais de antigénio e resultam em melhor coloração com imuno-histoquímica.
Seccionamento e imuno-histoquímica: Quando o seccionamento das biópsias GMA-incorporados, é conveniente ter 3-4 recipientes de água de amônia disponíveis para flutuar as seções. Quando uma seção é captado, make-se de substituí-lo com uma seção fresca (passo 3.4). Isso garante que, no momento em que a secção é tratado de novo, que terá sido que flutua na água de amoníaco para aproximadamente o comprimento correcto de tempo (45-90 segundos), o que ajuda na apresentação de antigénios e a imuno-histoquímica subsequente. 2 um corte secções desta forma também permite para o seccionamento consecutiva, o que significa que a mesma célula pode potencialmente ser coradas com superfície celular ou marcadores intracelulares diferentes. É importante não tocar na ponta da lâmina de vidro quando o corte, uma vez que é facilmente danificada. Se houver quaisquer detritos a partir da lâmina que tem de ser removido, sempre escovar afastado do bordo de corte.
A digestão enzimática e citometria de fluxo: Em amostras de tecido em que as células imunes são raras, que é crítico para CD45 incluem no painel de coloração de fluxo para identificar primeiro leucócitos (em minoria) antes de identificar ainda DCs ou outras células imunes de interesse. Também, "Fluorescence menos um "ou isotipos controles são críticos para incluir ao validar os painéis de anticorpos utilizados para garantir que os eventos raros são verdadeiras sinal sobre barulho.
Modificações e resolução de problemas
Seccionamento e imuno-histoquímica: Para a maioria dos marcadores celulares expressos por células imunitárias, tecido tonsilar pode ser usado como um bom controlo positivo e para titular anticorpos para imuno-histoquímica, a fim de evitar o desperdício de material de biópsia endobrônquica limitada (passo 4). Para visualizar os processos dendríticos de DCs, os tecidos podem ser seccionadas em paralelo ao epitélio, em vez de perpendicularmente através da mucosa 21. Outros substratos de peroxidase pode ser utilizada para além de AEC, tal como DAB, se o utilizador requer um substrato de cor diferente. O complexo de enzima avidina / biotina pode também ser substituído, por exemplo, com fosfatase alcalina.
A digestão enzimática e citometria de fluxo: Embora a extremidadebiópsias obronchial são pequenos, as células do tecido residente sobreviver à digestão enzimática e de processamento numa suspensão de uma única célula para análise por citometria de fluxo (Figura 3). No entanto, é importante para avaliar o impacto potencial das enzimas sobre as manchas usadas na citometria de fluxo painel de anticorpos. Para testar se as cliva protocolo digestão enzimática fora, altere, ou interfere com a coloração do anticorpo, as células mais facilmente acessíveis que expressam marcadores similares, tais como as células mononucleares do sangue periférico, pode ser tratado com as enzimas digestivas (passo 6) ou não, e eles pode em seguida por coradas com anticorpos marcados fluorescentemente e analisadas por citometria de fluxo (passo 7). Se a colagenase e a ADNase não interferem com a disponibilidade do antigénio, as manchas com ou sem o tratamento das células com enzimas deve ser semelhante. Além disso, isso pode ser verificado usando, tanto a citometria de fluxo, bem como as secções de tecido e imuno-histoquímica intacta (Fifiguras 2 - 3) 19.
Limitações da técnica
Broncoscopia: Mais indivíduos saudáveis tolerar uma broncoscopia bem, e é um método habitualmente usado para examinar e provar os pulmões, incluindo a recolha de biópsias de mucosas endobronquiais, tal como descrito aqui (passo 1). No entanto, broncoscopia não é normalmente um método adequado para efectuar a amostragem longitudinal, uma vez que é muitas vezes percebido como desconfortável e é também um procedimento de tempo e exige grandes recursos. Portanto, as biópsias endobronquiais fornecer apenas um instantâneo das células imunes presentes no tecido da mucosa do pulmão num determinado momento, em vez de um estudo de longo prazo de alterações na dinâmica ou cinética.
Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
Seccionamento e imuno-histoquímica: A vantagem de incorporar em GMA ao invés de parafina ou pela criopreservaçãoé a preservação da morfologia superiores e antigénios, e maior número de secções de pequenas biópsias, devido às secções finas que podem ser obtidos 17.
A digestão enzimática e citometria de fluxo. Ao obter células individuais de pequenas biópsias, muito mais informações podem ser atingidos por multi-color citometria de fluxo.
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
Este protocolo descrito paralelos dois métodos para maximizar a informação que pode ser obtido a partir de pequenas biópsias endobronquiais, combinando imuno-histoquímica e citometria de fluxo. Para caracterizar a distribuição espacial de células imunes raras, tais como CDs, biópsias podem ser incorporados em GMA para obter secções finas para imuno-histoquímica, que, para distinguir as DCs a partir de outras células do sistema imunológico com marcadores similares, a digestão enzimática das biópsias permite multi-color flow cytometry para ser PErformed. Para permitir a identificação de novas características imparcial de DC durante a inflamação ou doença, a análise automatizada dos dados de citometria de fluxo pode ser realizada pela aplicação de algoritmos de extracção de característica 22. As aplicações futuras incluem o uso destas células individuais por separação de células para recolher as populações de células específicas que podem ser utilizadas para a sequenciação de ARN ou de caracterização do transcriptoma. A identificação de DCs que residem nos pulmões podem ser importantes para a compreensão das alterações no cenário imunológico durante a saúde e na doença.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer os voluntários que contribuíram material clínico para este estudo. Estamos também gratos ao pessoal do Departamento de Saúde Pública e Medicina Clínica, Divisão de Medicina / Medicina Respiratória do Hospital Universitário, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) para a recolha de todo o material clínico.
Este trabalho foi financiado por doações para AS-S do Conselho Sueco de Pesquisa, o Heart-Lung Foundation sueca, a Fundação Sueca para a Investigação Estratégica, eo Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
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