Introduction
Les poumons sont en contact permanent avec l'environnement extérieur et sont très exposés à la fois des particules et des microbes inoffensifs ayant la capacité de provoquer une maladie. Par conséquent, il est essentiel pour le système immunitaire pour monter des réponses immunitaires puissantes contre les pathogènes envahissants, mais il est tout aussi important de maintenir la tolérance aux antigènes inhalés qui ne provoquent pas de maladie. Pour assurer la surveillance immunitaire puissante, le système respiratoire est garni d'un réseau de cellules du système immunitaire, notamment des cellules dendritiques (CD). DC sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles avec la capacité unique d'activer les cellules T naïves. Dans les poumons humains, les DC résidents rencontrent un antigène et ensuite traiter et de le transporter vers les ganglions lymphatiques drainant des poumons pour la présentation et à l' activation des cellules T 1, 2, 3.
Dans le système immunitaire humain, les DC peuvent être divisés en plusieurs sous-ensembles, avec distinct , mais qui se chevauchent fonctions: CD1c + et CD141 + DC myéloïdes (MDC) et CD123 + DC plasmacytoïdes (PDC) 4, 5. Alors que la plupart des connaissances détaillées sur les DC humaine provient des études dans le sang, il est maintenant évident que les poumons humains abritent aussi des populations rares de sous - ensembles DC avec des cellules T capacité stimulatrice 6, 7, 8, 9. Cependant, les données montrent que l' accumulation des cellules immunitaires, y compris les DC, diffèrent par leur fréquence, leur phénotype et la fonction en fonction de leur emplacement anatomique 10. Ainsi, il est important d'étudier les cellules du système immunitaire du tissu pertinent pour comprendre leur contribution à l'immunité locale et la tolérance. Pris ensemble, ce qui souligne la nécessité d'étudier les PED pulmonaires résident lorsque lutter contre les maladies pulmonaires, malgré les PED sanguins étant plus facilement disponibles et accessibles chez l'homme.
Les premières études qui a enquêté sur les PED pulmonaires résident chez l' homme sont principalement fondés sur la morphologie et l'expression de marqueurs simples, tels que HLA-DR et CD11c, dans des coupes de tissus par immunohistochimie 11, 12, 13. En revanche, des études plus récentes ont généralement compté sur cytométrie de flux des analyses pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires. Cependant, étant donné qu'il est difficile de trouver un seul marqueur de surface cellulaire qui identifie uniquement un sous-ensemble spécifique DC, la limitation potentielle des études qu'appliquer quatre couleurs cytométrie en flux est le risque d'inclure des populations de cellules avec des marqueurs phénotypiques semblables à DC. Par exemple, CD11c est exprimée sur tous les DC myéloïdes et la grande majorité des monocytes. D'autre part, dans les études appliquant plus avancées panneaux de cytométrie de flux, les tissus pulmonaires non cancéreuses de résections chirurgicales de patients ont été généralement utiliséxref "> 10, 14, 15, 16, même si on ne sait pas si ces populations rares sont vraiment représentatives des PED présents chez des sujets sains. Dans l' ensemble, les études sont limitées en grande partie due au fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare.
Pour surmonter certaines de ces limitations, cet ouvrage décrit comment effectuer une analyse détaillée de la distribution spatiale et une identification phénotypique des CD dans les biopsies bronchiques muqueuses obtenues chez des volontaires sains qui subissent une bronchoscopie. Plusieurs petites biopsies peuvent être collectées à partir de chaque individu et peuvent ensuite être intégrées pour sectionner et de l'analyse par immunohistochimie ou enzymatiquement digéré pour l'analyse avancée par cytométrie de flux. En utilisant le tissu pulmonaire sous forme de biopsies bronchiques obtenues à partir de bronchoscopies confère l'avantage de rendre possible la réalisation de la study sur des volontaires sains, contrairement à la chirurgie ouverte des poumons qui, pour des raisons évidentes, est limitée aux patients qui nécessitent une chirurgie thoracique. En outre, le tissu qui est échantillonné au cours d'une bronchoscopie chez des volontaires sains est physiologiquement normal, contrairement à une zone non affectée du tissu pulmonaire chez les patients présentant une maladie pulmonaire. D'autre part, les biopsies sont faibles et le nombre de cellules récupérées, même lorsque la mise en commun de plusieurs biopsies, limite le type d'analyses qui peuvent être effectuées.
Bien que le présent travail se concentre sur les pays en développement, les méthodes décrites peuvent être directement élargi pour inclure d'autres cellules (immunitaires) d'intérêt qui résident dans le tissu muqueux de poumon humain. En outre, les protocoles sont également directement applicable à des échantillons prélevés sur des patients souffrant de maladies pulmonaires où la bronchoscopie fait partie de l'établissement du diagnostic, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la sarcoïdose, ou d'un cancer du poumon.
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Protocol
NOTE: Cette recherche a été approuvé par le Conseil d'examen éthique régionale à Umeå, en Suède.
1. bronchoscopie pour échantillonnage endobronchique biopsies de sujets humains
- Obtenir le consentement éclairé de tous les participants.
- Traiter les sujets avec le midazolam par voie orale (4-8 mg) et glycopyrronium par voie intraveineuse (0,2 à 04 mg) 30 min avant la bronchoscopie. Appliquer une anesthésie topique avec de la lidocaïne dans le larynx et les bronches. Que le sujet gargariser avec ~ 3 ml de lidocaïne à 4% et appliquer 3 ml à la base de la langue et dans le larynx par l'intermédiaire d'une seringue du larynx. Optimisez l'anesthésie topique avec 8-10 doses de lidocaïne pulvérisation. Effectuer cette étape avec le sujet assis.
- Insérez un bronchoscope vidéo flexible à travers la bouche par l'intermédiaire d'un embout en plastique avec le sujet en position couchée. Utilisez un vaporisateur cathéter spécialement fait pour compléter l'anesthésie topique de la trachée et des bronches distale via le bronchoscope. Ici, utiliser une dose d'environ5-10 ml de lidocaïne à 2%.
- Prendre 6-9 biopsies muqueuses bronchiques de la carina principale et les principales divisions bronchiques à l' aide des pinces fenêtrées (figure 1). Suite à la bronchoscopie et avant de quitter l'hôpital, que le sujet reste pour 2-4 heures et de fournir lui / elle avec un repas léger.
2. Intégration de la Biopsies en Glycol Méthylacrylate (GMA) Résine
NOTE: Le protocole d'immunocoloration GMA a été initialement développé à l' Université de Southampton, Unité de recherche histochimie 17.
- Fixation: Par immunohistochimie, retirez les biopsies de la pince et les placer directement dans des flacons en verre contenant 3 ml d'inhibiteurs de l'acétone et la protéase déshydratés glacées (fluorure de phénylméthylsulfonyle (35 mg / 100 ml d'acétone) et iodoacétamide (370 mg / 100 ml d'acétone )). Fixer le tissu pendant la nuit à -20 ° C (Figure 2).
REMARQUE: Les étapes suivantes devraient être Performé dans une hotte avec des gants en nitrile appropriés. Le kit d'intégration contient des composants qui peuvent provoquer des réactions de sensibilisation, d'irritation, de la peau et / ou allergique. Tous les déchets doivent être éliminés comme des déchets dangereux. - Déshydratation: éliminer l'acétone avec des inhibiteurs et remplacer avec de l'acétone déshydratée frais (sans inhibiteurs) pendant 15 min à température ambiante (RT). Éliminer l'acétone et le remplacer par le benzoate de méthyle pendant 15 minutes.
- Infiltration: Préparer une solution de traitement d'une solution à 5% de benzoate de méthyle dans le monomère de méthacrylate de glycol; 10 ml est suffisante pour un flacon. À l'aide pipettes Pasteur en matière plastique, l'aspiration de la solution de benzoate de méthyle et le remplacer par 3 ml de solution de traitement. Incuber les biopsies et la solution de traitement en excès à 4 ° C pendant 2 heures; Pipettes Pasteur peuvent être utilisés pour tous les changements de solution ultérieurs, y compris une solution enrobage.
- Remplacez la solution de traitement toutes les 2 heures (3x 2 incubations hr), de sorte que le temps total d'infiltration du biopsies dans la solution de traitement est d'au moins 6 heures. Insérez des étiquettes en papier dans l'extrémité supérieure des capsules d'enrobage pour identifier les biopsies.
- Préparer une solution d'enrobage de 75 mg de peroxyde de benzoyle dans 10 ml de monomère de méthacrylate de glycol. Ajouter 0,25 ml de N, N - diméthylaniline poly (oxyde d'éthylène) (accélérateur) à la solution d'enrobage pour commencer la réaction de polymérisation. Retirer la solution de traitement et placer une biopsie dans la capsule d'enrobage pertinentes en utilisant une pince.
- Remplir lentement la capsule enrobage vers le haut avec une solution intégrant et fermer le bouchon. Éviter de perturber la biopsie et la création de grosses bulles d'air. Incuber les capsules à 4 ° C jusqu'à ce que la résine soit complètement polymérisé.
- Stocker les biopsies incorporés à -20 ° C dans un tube de 50 ml contenant environ 5 g de gel de silice.
3. Sectionnement des biopsies endobronchiques GMA-embarqués
- Microscope slide revêtement: Laver les lames de microscope dans unlave-vaisselle sur un cycle normal. Couvrir les diapositives et les laisser sécher à l'air.
- Préparer une solution de revêtement de 10% de poly-L-lysine (PLL) dans de l'eau distillée. Immerger les lames dans une solution de revêtement pendant 5 min, puis laissez-les sécher à l'air. Stocker les diapositives PLL enduit sec dans leur boîte d'origine.
- Laver les lames de verre en feuille avec 0,1% de Tween 20 dans de l'eau distillée. Rincer le verre avec 70% d'éthanol et sécher avec des serviettes en papier. Couper les lames de verre de la bande de verre à l'aide d'une machine à couteau. Stocker les lames dans un récipient qui empêche le mouvement de veiller à ce que l'arête de coupe ne soit pas endommagé ou entaillé.
- Biopsie rognage: Placez la capsule de biopsie dans un séparateur de capsule et de réduire chaque côté à l'aide d'une seule lame de pointe en acier au carbone. Retirer la biopsie GMA intégré et placez-le fermement dans un étau. Coupez l'excédent GMA autour de la biopsie en utilisant la lame d'acier.
- tronçonnage GMA.
- Préparer une solution d'ammoniaque à 0,05% avec de l'eau distillée. Placez le couteau de verre et la biopsie dans ee microtome. aligner soigneusement le bloc de biopsie avec la lame en ajustant le porte-couteau et l'angle du bloc de biopsie de telle sorte que la lame repose à plat contre la surface du bloc.
- Couper 2 sections um d'épaisseur à l'aide du microtome sur une vitesse de coupe lente et utiliser des pinces pour transférer et flotter sections sur l'eau de l'ammoniac. Float les sections de 45-90 sec, permettant douce récupération d'antigène et le déroulement de la partie.
- Pick-up sections avec lame de microscope. Vérifiez l'histologie de la biopsie par coloration rapidement avec le bleu de toluidine.
- Sécher les lames sur un ensemble de plaque chaude à 50 ° C et appliquer 500 pi de toluidine filtrée bleuissement à une section à l'aide d'une pipette en plastique de Pasteur. Réchauffez la section sur la plaque chaude jusqu'à ce qu'un anneau vert commence à émerger au bord de la tache, puis laver avec de l'eau.
- L'utilisation d'un microscope optique, vérifier l'histologie de la biopsie. Sections utilisées pour l'immunohistochimie doivent contenir les bonnes zones de lame intactepropria et l'épithélium, avec aussi peu de glandes et que peu de muscle lisse que possible.
- Comme dans la section 3.4.2, couper des sections qui ont une bonne histologie et les ramasser avec des lames de microscope PLL revêtus pour la coloration immunohistochimique. Couper au moins deux sections de chaque biopsie pour l'analyse. diapositives sécher pendant au moins 1 h. Après séchage, les articles peuvent être enveloppés dans une feuille d'étain et stockés à -20 ° C pendant jusqu'à 2 semaines, ou ils peuvent être immédiatement immunocoloration.
4. Coloration immunohistochimique des biopsies endobronchiques GMA-embarqués
NOTE: L'azoture de sodium est toxique. Préparer la solution d'azoture de sodium à 0,1% dans une hotte et à l'écart des acides. Le contact avec les acides dégage des gaz toxiques.
- Dessiner autour sections à l'aide d'un stylo à pointe de diamant et d'organiser les diapositives sur un support de coloration.
- Effectuer un bloc de peroxydase. Préparer une solution de Peroxydase de bloc de 0,3% de peroxyde d'hydrogène dans une solution d'azoture de sodium à 0,1%. Apply 1 ml du bloc de peroxydase aux sections et laisser incuber pendant 30 min.
- Préparer une solution de lavage de 0,05 M de solution saline tamponnée au Tris (TBS), pH 7,6. Laver les lames dans du TBS, 3x 5 min.
- Préparer une solution à 1% de blocs de BSA dans du DMEM. Pour ce faire à l'avance et des volumes grande, aliquoter et congeler jusqu'à ce que nécessaire. Égoutter les lames et incuber les sections en solution de bloc pendant 30 minutes pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique. Si une liaison non spécifique se produit encore, comprendre une étape d'incubation de 30 min avec le bloc de sérum de 5% par rapport à la même espèce que l'anticorps secondaire.
- Diluer anticorps primaire (CD45 ou CD1a) dans du TBS à la concentration désirée (CD45 dilué à 1: 1000; CD1a dilué à 1: 1,00) et l'appliquer à des diapositives. Coverslip les sections et laisser incuber pendant une nuit à température ambiante.
- Laver les lames dans du TBS trois fois. Diluer l' anticorps secondaire biotinylé (dirigé contre l'espèce d' anticorps de l' hôte principal, dans ce cas de lapin anti-souris F (ab '2)) dans du TBS à la concentration désirée (1:300 dilution) et l'appliquer à des diapositives. Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
- Préparer une streptavidine biotine-peroxydase complexe au moins 30 minutes avant utilisation. Assurez-vous qu'il ya assez pour couvrir toutes les diapositives. Laver les lames dans du TBS trois fois. Appliquer la solution sur les lames et incuber pendant 2 h à température ambiante.
- Laver les lames dans du TBS trois fois. Préparer le 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC) d'une solution de substrat de peroxydase (fabriquée conformément aux instructions du fabricant). Appliquer sur les lames et incuber pendant 20 à 30 minutes, ou jusqu'à ce que l'intensité de la coloration souhaitée se développe.
- Rincer les lames dans l'eau du robinet pendant 5 min. Counterstain les sections avec la solution hématoxyline de Mayer filtrée pendant 2 min. Laver les lames dans l'eau du robinet pendant 5 min.
- Égoutter les diapositives et couvrir les sections avec un milieu aqueux permanent de montage. Sécher les lames à 80 ° C dans un four de séchage. Laisser les diapositives refroidir, puis les monter avec DPX et placer une lamelle.
5. StAnalyse aining
- Analyser les sections à 40X au moyen d'un microscope optique avec une caméra montée connecté à un ordinateur.
NOTE: Pour l'analyse cellulaire, comptez positivement colorées, les cellules nucléées au sein de la lamina propria bronchique et de l'épithélium intact, à l'exclusion des zones de muscle lisse, les glandes, les gros vaisseaux sanguins et les tissus dépareillés ou endommagés. - Moyenner les comptes de cellules et de corriger le nombre moyen des cellules dans la zone de la lamina propria et la longueur de l'épithélium. La superficie de la lamina propria et la longueur de l'épithélium peut être calculé en utilisant un programme d'analyse d'image.
6. La digestion enzymatique des endobronchiques Biopsies
- Biopsies de lavage: En utilisant des pinces stériles, placer des biopsies intactes dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de solution saline tamponnée de Hank (HBSS) (Figure 3). Incuber pendant 5 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule à 30 tours. Transférer les biopsies à un d stérileish décante le contenu du tube de 15 ml avec du HBSS.
- Perturber mucus avec TNT: Remplacer le HBSS dans le tube avec 10 ml de HBSS contenant 5 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT). Transférer les biopsies dans le tube de 15 ml en utilisant des pinces stériles. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule à 30 tours.
- Vortex doucement le tube pendant 15 secondes. Transférer les biopsies sur une boîte stérile décante le contenu du tube de 15 ml avec du HBSS et TNT.
- Transfert des biopsies pour le milieu de culture: Remplacer le HBSS et de la TNT dans le tube avec 10 ml de RPMI 1640 milieu de culture. Transférer les biopsies dans le tube de 15 ml en utilisant des pinces stériles. Incuber pendant 10 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule à 30 tours.
- Digérer biopsies avec collagénase et DNase.
- Préparer une solution de digestion de collagénase II (0,25 mg / ml) et de la DNase (0,2 mg / ml) dans préchauffée RPMI contenant 1 M de solution de HEPES. Ajouter 500 pi de solution de digestion par puits dans un culte de tissu 48 puitsplaque ure.
- Placer 1 biopsie par puits dans une solution de digestion. Incuber la plaque sur une plate-forme sous agitation pendant 60 min à 37 ° C, à 220 tours par minute. Introduire à la pipette vers le haut et vers le bas après 30 minutes pour redisperser les biopsies, et après 60 minutes, de désagréger complètement le tissu.
- La préparation de suspensions de cellules isolées.
- Piscine ensemble les biopsies digérées provenant des puits dans un tube de 50 ml, en le faisant passer à travers un tamis cellulaire de 40 pm. Recueillir les cellules restantes par lavage des puits avec un tampon FACS glacé (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2% de sérum de fœtus bovin).
- Presser le tissu restant sur le tamis cellulaire en utilisant le retour du piston d'une seringue. Centrifuger les cellules digérées à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de tampon FACS glacé. Compter les cellules manuellement à l'aide d'un hémocytomètre et Trypan bleuissement pour évaluer la viabilité des cellules.
- Remettre en suspension le culot de cellules à environ 1 x 10 6 cellules dans 200 ul de tampon FACS.
- Ajouter un colorant de viabilité cellulaire pour mort cellulaire d'exclusion, selon le protocole du fabricant.
- Ajouter 5 ul de FcR réactif de blocage et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
- Ajouter des anticorps de surface cellulaire contre CD45 (2 ul), de la lignée (CD3, CD20, CD56, CD66abce, et CD14; 2 pl chacun), CD16 (0,5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123 (5 pi), CD1c (3 pi), et CD103 (2 pi) et incuber pendant 15 min à 4 ° C. Les détails sur les anticorps peuvent être trouvés dans la section des méthodes, mais titrent et d'optimiser les anticorps à l'écoulement précis cytomètre en cours d'utilisation. Laver les anticorps en excès avec du PBS pendant 5 min à 400 x g. Acquérir les échantillons frais sur un cytomètre de flux ou de fixer les cellules dans 1% de paraformaldehyde avant acquisit plus tardion.
- Identifier les CD humaines dans les biopsies pulmonaires en utilisant une cytométrie en flux dosage 18 (Figure 4).
NOTE: L'utilisation d'un flux cytométrie logiciel d'analyse, les cellules immunitaires se distinguent des autres cellules pulmonaires par gating sur CD45. Les cellules mortes peuvent être exclus comme des cellules qui sont positives pour le colorant, LIVE / DEAD. Tout d' CD45 + cellules vivantes, des cellules de la lignée (cellules B, les cellules T, les cellules NK, les neutrophiles et monocytes) peuvent être exclus en utilisant un cocktail d'anticorps anti - CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 et CD16 dans un canal. Après que les cellules, HLA-DR + permettront l'identification de tous les CD humaines. Les MDC peuvent être distinguées des PDCs basées sur l'expression de CD11c ou l'absence de CD11c, respectivement. MDC peuvent être divisés en CD1c + ou CD141 + MDC.
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Representative Results
Les études caractérisant les cellules immunitaires humaines respiratoires tissus-résident, y compris les pays en développement, sont limitées, en grande partie en raison du fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare. Ici, une méthode moins invasive d'obtenir le tissu pulmonaire à partir de biopsies bronchiques (EBB) des volontaires sains et des protocoles mis au point pour étudier les cellules immunitaires dans le tissu par immunohistochimie ou par cytométrie de flux sont décrites.
Des volontaires sains ont subi une bronchoscopie, comme décrit précédemment 19, 20. Six à neuf de 1-2 mm 3 biopsies bronchiques muqueuses ont été prises à partir de la carina principale et les principales divisions bronchiques de chaque sujet en utilisant une pince fenêtrée (figure 1A). Deux biopsies ont été intégrées dans GMA et ensuite utilisées pour l'immunohistochimie pour fournir des informations spatiales. Le biopsi restantes ont été digérés enzymatiquement, et les suspensions monocellulaires ont été analysées à l' aide multi-couleurs cytométrie de flux, ce qui a permis la caractérisation minutieuse des sous - ensembles de cellules rares (figure 1B).
Pour obtenir plus de renseignements spatiale que possible des petits morceaux de tissus, les biopsies ont été intégrées dans GMA qui permet ultraminces sections um (Figure 2A-B). Comme prévu, les cellules immunitaires CD45 exprimant étaient relativement rares en moyenne, 125 CD45 + cellules par mm 2 étaient présents dans les tissus pulmonaires de la muqueuse lors de l' état d' équilibre, comme évalué par immunohistochimie (figure 2C). Le contrôle IgG1 isotype a donné lieu à aucune coloration positive, ce qui indique une haute spécificité de l'anticorps primaire. Le nombre de cellules positives à la fois dans l'épithélium du poumon et de la lamina propria sous - jacente ont été quantifiés et ont montré que les cellules CD45 + immunitaires étaient plus abondants dans la lamina propria que dans l'épithélium (figure 2D). En outre, les cellules CD1a exprimant ont été identifiées et dénombrées, et ils représentent le plus probable DC (Figure 2E). En moyenne, moins d'une + cellule par mm 2 CD1a a été identifié dans la lamina propria du poumon à l' état d' équilibre (Figure 2F).
Immunohistochimie fournit des informations sur la distribution anatomique des cellules dans un tissu intact, mais il est généralement limité dans sa capacité à définir des cellules à l'aide de plusieurs marqueurs de surface cellulaire. Multi-couleurs cytométrie en flux, en fonction de l'instrument, a l'avantage de fournir plus d'informations par cellule, et il peut être utilisé dans de petits échantillons. Jusqu'à neuf biopsies de la muqueuse du poumon ont été réunies, lavées et mises en incubation à perturber le mucus. Chaque biopsie a ensuite été digéré par la collagénase et l' ADNase dans des puits individuels d'une plaque à puits 48, résultant en une suspension monocellulaire (FFIGURES 3A - 3B). En moyenne, 1,5 x 10 6 cellules bronchiques par sujet ont été obtenues, et une corrélation positive entre le rendement et la viabilité cellulaire a été observée (figure 3C). La viabilité cellulaire observée avec diminution du nombre de cellules inférieur pourrait être expliquée par une concentration plus élevée de l'enzyme par la cellule qui est sous-optimal pour les cellules. Ceci est un défi avec des biopsies varier à la fois en taille et en densité cellulaire, avec des biopsies échantillonner plus de la muqueuse superficielle que d'autres. Comme prévu, le débit d' analyse cytométrique de la suspension à cellule unique a révélé que, en moyenne, 12% des cellules sont CD45 + leucocytes, alors que la majorité des cellules dans le tissu de la muqueuse du poumon dans des conditions de l' état d' équilibre sont pas des cellules immunitaires (Figure 3D ). La cytométrie de flux et les données IHC corrélées, ce qui met en évidence la force d'employer les deux techniques en parallèle.
+ leucocytes qui exprimait HLA-DR , mais étaient négatifs pour les marqueurs de la lignée CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14 et CD16 (figure 4A). Dans cette petite population de cellules, DCs plasmacytoïdes (PDC) ont été identifiés en fonction de leur manque d'expression de CD11c et de leur forte expression de CD123 et HLA-DR (TEAL). Parmi les cellules de la lignée négative HLA-DR + CD11c +, à la fois CD1c + (corail) et CD141 + (marron) DC myéloïdes ont été identifiés (figure 4A). Pour caractériser davantage ces sous-ensembles de cellules, leur expression de la CD10 intégrine 3 qui se lie à la E-cadhérine, importante dans l'ancrage de tissus, a été évaluée. Alors que tous les sous-ensembles à courant continu, ainsi que des cellules T en circulation dans le sang périphérique, étaient faibles ou négatives pour CD103, une partie distincte de cellules DCs et T se trouvent dans les poumons du même individu exprime CD103. Cela était vrai des cellules qui se trouvent à la fois dans le lavage broncho - alvéolaire, ainsi que dans les tissus pulmonaires (figure 4B).
Figure 1: Échantillonnage des tissus humains de la muqueuse du poumon. (A) bronchoscopies ont été effectuées sur des sujets pour obtenir des biopsies bronchiques des principales divisions bronchiques d'un poumon en utilisant une pince. (B) Les biopsies ont été soit intégrés dans GMA pour la coupe des tissus et immunohistochimie (diagramme bleu) ou enzymatiquement digéré pour obtenir une seule cellule suspensions pour cytométrie de flux (diagramme rose).m / files / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Intégration des biopsies en résine GMA. (A) Les biopsies prélevées sur bronchoscopies ont été immédiatement transférés dans des flacons de verre contenant de l'acétone déshydratée glacée (panneau de gauche). Après fixation pendant une nuit, les biopsies ont été infiltrés avec une solution de benzoate de méthyle. Les biopsies ont été placés dans l'incorporation des capsules remplies avec une solution intégrant pour commencer la polymérisation (panneau du milieu). biopsies embarqués peuvent être conservés à -20 ° C ou peuvent être sectionnés pour coloration immunohistochimique (panneau de droite). (B) Les faits saillants schématiques des étapes clés du processus de biopsies d' enrobage en utilisant GMA. Des images représentatives de biopsies en coupe montrant la présence de CD45 + (C) ou des cellules CD1a + (E) sont présentées par rapport aux témoins isotypes respectifs (panneaux de droite). La coloration spécifique est affichée en rouge, et des noyaux de cellules de contraste avec l'hématoxyline sont en bleu. Barre d'échelle = 50 pm. Les graphiques à barres montrent la médiane ± écart interquartile de CD45 + (D) ou CD1a + (F) cellules par mm 2 dans l'épithélium ou lamina propria (n = 20). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: La digestion enzymatique des biopsies pour cytométrie en flux. (A) Une biopsie endobronchique prise à partir d' une bronchoscopie dans une boîte de Pétri. Les biopsies ont été lavées dans HBSS, traité avec la TNT pour éliminer le mucus, unD digéré avec collagénase et DNase avant la collecte de cellules uniques pour l'analyse de cytométrie de flux. (B) Le schéma résume les principales procédures pour digérer les biopsies cytométrie de flux. (C) Le graphique montre la corrélation du rendement et la viabilité cellulaire, évaluée par comptage manuel et exclusion du bleu Trypan (n = 20). (D) des suspensions monocellulaires à partir de la biopsie digérée a été analysée par cytométrie en flux et évaluée pour la viabilité et l'expression de CD45 (antigène commun leucocytaire). La cytométrie en flux graphique montre un donneur représentatif sur 20 sujets sains. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Identification des poumons sous - ensembles de cellules dendritiques en b digéréeiopsies. (A) la stratégie Gating pour l'identification des CD1c + et CD141 + DC myéloïdes (MDC) et les CD plasmacytoïdes (PDCs) dans les tissus de la muqueuse du poumon. La cytométrie en flux de parcelles représentant un sujet sont présentées. (B) Les tracés de points montrent l'expression du CD103 intégrine sur les populations des PED dans les biopsies pulmonaires (panneau de gauche), lavage broncho - alvéolaire (panneau du milieu), et le sang périphérique (panneau de droite). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cet article décrit comment générer une caractérisation spatiale et phénotypique détaillée du poumon PED tissus résidents chez l'homme sain par immunohistochimie et cytométrie en flux sur des biopsies muqueuses bronchiques recueillies au cours de la bronchoscopie. Dans les paragraphes qui suivent les étapes critiques dans le protocole sont discutés en détail.
Étapes critiques avec le Protocole
Sectionner et immunohistochimie: Il est essentiel de garder les blocs de biopsie à -20 ° C lors de leur utilisation non (étape 2.5). blocs chauds peuvent parfois devenir molle et ne section. De plus, en gardant les blocs à -20 ° C permettra de préserver les sites antigènes et aboutir à une meilleure coloration par immunohistochimie.
Sectionnement et immunohistochimie: Lorsque sectionnant les biopsies GMA-intégrées, il est commode d'avoir 3-4 conteneurs d'eau d'ammoniac disponibles pour flotter les sections sur. Lorsqu'une section est ramassé, make sûr de le remplacer par une nouvelle section (étape 3.4). Cela garantit que, au moment où l'article est traité encore une fois, il aura été flottant sur l'eau d'ammoniaque à peu près à la longueur correcte de temps (45-90 secondes), ce qui facilite la présentation de l'antigène et l'immunohistochimie subséquente. Découpe des sections 2 um de cette manière permet également de tronçonnage consécutif, ce qui signifie que la même cellule peut éventuellement être colorées avec différentes de surface cellulaire ou des marqueurs intracellulaires. Il est important de ne pas toucher le bord de coupe de la lame de verre lorsque la coupe, car il est facilement endommagé. S'il n'y a aucun débris de la lame qui doit être enlevée, toujours la brosse à distance du bord de coupe.
La digestion enzymatique et cytométrie en flux: Dans les échantillons de tissus où les cellules immunitaires sont rares, il est essentiel d'inclure CD45 dans le panneau de coloration d'écoulement d'abord d'identifier les leucocytes (en minorité) avant d'identifier davantage les PED ou d'autres cellules immunitaires d'intérêt. En outre, "fluorescence moins un »ou isotypes contrôles sont essentiels pour inclure tout en validant les panneaux d'anticorps utilisés pour faire en sorte que les événements rares sont vrai signal sur bruit.
Modifications et dépannage
Sectionnement et immunohistochimie: Pour la plupart des marqueurs cellulaires exprimés par les cellules immunitaires, les tissus des amygdales peut être utilisé comme un bon contrôle positif et de titrer les anticorps pour immunohistochimie afin d'éviter de gaspiller le matériel de biopsie endobronchique limitée (étape 4). Pour visualiser les processus dendritiques des PED, les tissus peuvent être sectionnées parallèlement à l'épithélium, plutôt que perpendiculairement à travers la muqueuse 21. D'autres substrats de peroxydase peuvent être utilisés en plus de l'AEC, tels que DAB, si l'utilisateur a besoin d'une couleur différente du substrat. Le complexe enzymatique d'avidine / biotine peut également être substitué, par exemple avec une phosphatase alcaline.
la digestion enzymatique et cytométrie de flux: Bien que la finDes biopsies obronchial sont petites, les cellules tissulaires résident survivent à la digestion enzymatique et le traitement dans une suspension à cellule unique pour une analyse cytométrique en flux (Figure 3). Cependant, il est important d'évaluer l'impact potentiel des enzymes sur les taches utilisées dans la cytométrie en flux panel d'anticorps. Pour tester si les clive de protocole de digestion enzymatique large, modifie, ou interfère avec la coloration d'anticorps, plus facilement accessibles des cellules exprimant des marqueurs similaires, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique, peuvent être traités avec des enzymes digestives (étape 6) ou non, et ils on peut ensuite par colorées avec des anticorps marqués par fluorescence et analyse par cytométrie de flux (étape 7). Si la collagénase et de la DNase ne pas interférer avec la disponibilité de l'antigène, les taches, avec ou sans traitement des cellules avec des enzymes doivent être similaires. En outre, cela peut être vérifié en utilisant les deux cytométrie de flux, ainsi que des coupes de tissu intactes et immunohistochimie (Figures 2 - 3) 19.
Limites de la technique
Bronchoscopie: La plupart des personnes en bonne santé tolèrent une bronchoscopie bien, et il est une méthode couramment utilisée pour examiner et prélever les poumons, y compris pour recueillir des biopsies bronchiques muqueuses, comme décrit ici (étape 1). Cependant, la bronchoscopie est généralement pas une méthode appropriée pour effectuer l'échantillonnage longitudinal, car il est souvent perçu comme mal à l'aise, et il est également une procédure de temps et de ressources exigeant. Par conséquent, les biopsies bronchiques ne fournissent qu'un aperçu des cellules immunitaires présentes dans le tissu des muqueuses du poumon à un moment donné, plutôt que d'une étude à long terme des changements dans la dynamique ou cinétique.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Sectionnement et immunohistochimie: L'avantage de l'intégration dans les GMA plutôt que de la paraffine ou par cryoconservationest supérieure à la préservation de la morphologie et les antigènes, et un plus grand nombre de sections à partir des biopsies, du fait des coupes minces qui peuvent être obtenus 17.
la digestion enzymatique et cytométrie de flux. En obtenant des cellules isolées à partir de biopsies, beaucoup plus d'informations peut être atteint par plusieurs couleurs cytométrie en flux.
Applications futures ou les directions après la maîtrise de cette technique
Ce protocole décrit deux procédés parallèles afin de maximiser les informations qui peuvent être obtenues à partir des biopsies bronchiques en combinant immunohistochimie et en cytométrie de flux. Pour caractériser la distribution spatiale des cellules immunitaires rares tels que les CD, les biopsies peuvent être intégrés dans GMA pour obtenir de fines sections pour l'immunohistochimie, alors que pour distinguer les PED à partir d'autres cellules immunitaires avec des marqueurs similaires, la digestion enzymatique des biopsies permet multi-couleurs cytométrie en flux être performed. Pour permettre l'identification objective des nouvelles caractéristiques des pays en développement au cours de l' inflammation ou d'une maladie, l'analyse automatisée des données de cytométrie en flux peut être effectuée en appliquant des algorithmes d'extraction de caractéristiques 22. futures applications comprennent l'utilisation de ces cellules uniques pour le tri pour recueillir des populations cellulaires spécifiques qui peuvent être utilisées pour le séquençage de l'ARN ou de profilage transcriptomique cellule. L'identification des CD résidant dans les poumons peut être important pour la compréhension des changements dans le paysage immunitaire au cours de la santé et de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les bénévoles qui ont contribué matériel clinique à cette étude. Nous sommes également reconnaissants envers le personnel du ministère de la Santé publique et de la médecine clinique, Division de la médecine / médecine respiratoire, Hôpital universitaire, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) pour la collecte de tout le matériel clinique.
Ce travail a été soutenu par des subventions à l'AS-S du Conseil suédois de la recherche, la Fondation suédoise Heart-Lung, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique et le Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
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