Introduction
Lungorna är i kontinuerlig kontakt med den yttre miljön och är mycket utsatt för både ofarliga partiklar och mikrober med kapacitet att orsaka sjukdom. Därför är det viktigt för immunförsvaret att montera potenta immunsvar mot invaderande patogener, men det är lika viktigt att upprätthålla tolerans mot inhalerade antigener som inte orsakar sjukdom. Att ge potent immunövervakning, är andningssystemet fodrad med ett nätverk av immunceller, inklusive dendritiska celler (DC). DCs är professionella antigenpresenterande celler med den unika förmågan att aktivera naiva T-celler. I humana lungor, bosatta DC möter en antigen och sedan processen och transportera den till lung dränerande lymfkörtlar för presentation till och aktivering av T-celler 1, 2, 3.
I människans immunsystem, kan DCs delas upp i flera undergrupper, med Distinct men överlappande funktioner: CD1c + och CD141 + myeloida DCs (MDCS) och CD123 + plasmacytoid DCs (PDCs) 4, 5. Medan de flesta detaljerad kunskap om human DC härrör från studier i blod, är det nu uppenbart att de mänskliga lungor hamnen också sällsynta populationer av DC delmängder med T-cell stimulerande kapacitet 6, 7, 8, 9. Men ackumulerande data visar att immunceller, inklusive DC, skiljer sig åt i sin frekvens, fenotyp och funktion beroende på deras anatomiska läge 10. Således är det viktigt att studera immunceller från relevant vävnad för att förstå deras bidrag till lokal immunitet och tolerans. Sammantaget understryker detta behovet av att studera lung bosatt DC när man behandlar lungsjukdomar, trots blod DC är mer lättillgängliga och åtkomliga i människor.
De första studierna som undersökte lung bosatt DC hos människa åberopade främst på morfologi och ett uttryck för enskilda markörer, såsom HLA-DR och CD11c, i vävnadssnitt med hjälp av immunohistokemi 11, 12, 13. Däremot senare studier har typiskt förlitat sig på flödescytometrisk analyser för att studera olika immuncellundergrupper. Eftersom det är svårt att hitta en enda cellytan markör som identifierar en specifik DC delmängd den potentiella begränsning av studier som endast fyra färger flödescytometri är risken att inkludera cellpopulationer med liknande fenotypiska markörer som DC. Till exempel är CD11c uttrycks på alla myeloida DCS och den stora majoriteten av monocyter. Å andra sidan, i studier att tillämpa mer avancerade flödescytometrisystem paneler, var godartade lungvävnad från kirurgiska resektioner av patienter som vanligtvis användsxref "> 10, 14, 15, 16, även om det är oklart om dessa sällsynta populationer är verkligt representativa för DCs närvarande hos friska försökspersoner. Sammantaget är studier begränsade till stor del på grund av det faktum att avlägsnas kirurgiskt eller hela mänskliglungvävnad är knappa.
För att övervinna några av dessa begränsningar, beskriver detta arbete hur man utföra en detaljerad analys av rumsliga fördelning och en fenotypisk identifiering av DCs i slemhinnor endobronkiala biopsier som erhålls från friska frivilliga försökspersoner som genomgår en bronkoskopi. Flera små biopsier kan samlas in från varje individ och kan därefter bäddas för sektionering och analys med hjälp av immunhistokemi eller enzymatiskt för avancerad flödescytometrisk analys. Med användning av lungvävnad i form av endobronkiala biopsier erhållna från bronchoscopies tillgodoses den fördelen att göra det möjligt att utföra den stUdy på friska frivilliga personer, till skillnad från öppen kirurgi i lungorna som, av uppenbara skäl, är begränsad till patienter som kräver thoraxkirurgi. Vidare är den vävnad som samplas under en bronkoskopi från friska frivilliga fysiologiskt normala, i motsats till en icke-drabbade området av lungvävnad hos patienter med lungsjukdom. Å andra sidan, de biopsier är små och antalet celler som hämtas, även när sammanslagning flera biopsier, begränsar den typ av analyser som kan utföras.
Även detta arbete är inriktat på utvecklingsländerna, de metoder som beskrivs kan direkt utvidgas att omfatta andra (immun) celler av intresse som finns i human slemhinna lungvävnad. Dessutom protokollen är också direkt tillämpliga på prover från patienter som lider av lungsjukdomar där bronkoskopi är en del av upprättandet diagnosen, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), sarkoidos eller lungcancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Denna forskning godkändes av den regionala etikprövningsnämnden i Umeå, Sverige.
1. Bronkoskopi för provtagning bronkerna Biopsier från människa
- Erhålla informerat samtycke från alla deltagare.
- Behandla patienter med oralt midazolam (4-8 mg) och intravenös glycopyrronium (0,2-04 mg) 30 minuter före bronkoskopi. Applicera topikal anestesi med lidokain i struphuvudet och luftrören. Låt ämnet gurgla med ~ 3 ml lidokain 4% och gäller 3 ml till tungbasen och i struphuvudet via en struphuvudet spruta. Optimera lokal anestesi med 8-10 doser av lidokain spray. Utför detta steg med ämnet sammanträde.
- Sätt en flexibel video bronkoskop genom munnen via en plast munstycke med ämnet i ryggläge. Använd en specialgjord sprut kateter för att slutföra den aktuella anestesi av den distala luftstrupe och bronker via bronkoskop. Här använder en dos av cirka5-10 ml lidokain 2%.
- Ta 6-9 endobronkiala slemhinnor biopsier från huvud carina och de viktigaste luftrörs divisionerna använder Fenestrated pincett (Figur 1). Efter bronkoskopi och innan de lämnar sjukhuset, låt ämnet vila för 2-4 timmar och ge honom / henne med en lätt måltid.
2. Bädda in biopsier i Glykol metylakrylat (GMA) Resin
OBS! GMA immunfärgning protokoll utvecklades ursprungligen vid Southampton University, Histochemistry Research Unit 17.
- Fixering: För immunohistokemi, ta bort biopsier från tången och placera dem direkt i glasampuller innehållande 3 ml iskall torkad aceton och proteashämmare (fenylmetylsulfonylfluorid (35 mg / 100 ml aceton) och jodacetamid (370 mg / 100 ml aceton )). Fixera vävnaden över natten vid -20 ° C (figur 2).
OBS! Följande steg bör PERFOrmed i ett dragskåp med lämpliga nitril. Inbäddning kit innehåller komponenter som kan orsaka allergi, irritation och / eller allergiska hudreaktioner. Allt avfall måste tas om hand som farligt avfall. - Uttorkning: Ta bort aceton med hämmare och ersätta med färsk uttorkad aceton (utan hämmare) under 15 minuter vid rumstemperatur (RT). Ta bort aceton och ersätta det med metylbensoat under 15 minuter.
- Infiltration: Bered en processlösning av 5% metylbensoat lösning i glykol metakrylatmonomer; 10 ml är tillräckligt för en flaska. Använda plast Pasteur pipetter, sug av metylbensoat lösning och ersätta med 3 ml bearbetning lösning. Inkubera biopsier och överskott i bearbetningslösning vid 4 ° C under 2 h; Pasteur pipetter kan användas för alla efterföljande ändringar lösning, inklusive bädda lösning.
- Byta ut processlösningen varje 2 h (3 x 2 h inkubationer), så den totala infiltration tiden för biopsies i bearbetning lösning är minst 6 h. Sätt pappersetiketter i den övre änden av inbäddning kapslarna att identifiera biopsier.
- Bered en inbäddning lösning av 75 mg bensoylperoxid i 10 ml glykol metakrylatmonomer. Lägga 0,25 ml N, N-dimetylanilin poly (etylenoxid) (accelerator) till inbäddning lösning för att påbörja polymerisationsreaktionen. Ta behandlingslösning och placera en biopsi på den relevanta inbäddning kapseln med pincett.
- Sakta fylla bädda kapseln till toppen med bädda lösning och stäng locket. Undvika att störa biopsin och skapa stora luftbubblor. Inkubera kapslarna vid 4 ° C till dess att hartset har fullständigt polymeriserat.
- Lagra de inbäddade biopsier vid -20 ° C i ett 50 ml rör innehållande ca 5 g silikagel.
3. Sektionering av GMA-inbäddade endobronkiala Biopsier
- Objektglas beläggning: Tvätta objektglas i endiskmaskin på en vanlig cykel. Täck bilderna och låt dem lufttorka.
- Framställa en beläggningslösning av 10% poly-L-lysin (PLL) lösning i destillerat vatten. Dränka objektglasen i beläggningslösningen under 5 min, och sedan låta dem lufttorka. Förvaras torrt PLL-belagda objektglas i sin ursprungliga lådor.
- Tvätta Sheet Glass remsor med 0,1% Tween 20 i destillerat vatten. Skölj glaset med 70% etanol och torr med hushållspapper. Kristall blad från glasremsan med hjälp av en knivmakare. Förvara bladen i en behållare som förhindrar rörelse för att säkerställa att skäreggen inte skadas eller hack.
- Biopsi trimning: Placera biopsi kapsel i en kapsel splitter och skära ner på varje sida med hjälp av en kol-stål enda kant blad. Ta bort GMA-inbäddade biopsi och placera den stadigt i ett skruvstäd. Trimma överskott GMA från hela biopsi med hjälp av stålblad.
- GMA snittning.
- Förbered 0,05% ammoniaklösning med destillerat vatten. Placera glaskniv och biopsi i the mikrotomen. Noggrant rikta in biopsi blocket med bladet genom att justera knivhållaren och vinkeln av biopsiblocket så att bladet vilar platt mot ytan av blocket.
- Klipp 2 um tjocka sektioner med hjälp av mikrotomen på en långsam skärhastighet och använder pincett för att överföra och flyta ut sektioner på ammoniakvatten. Float avsnitten för 45-90 sekunder, så mild antigenåtervinning och utvecklandet av sektionen.
- Plocka upp sektioner med objektglas. Kontrollera biopsi histologi genom att snabbt färgning med toluidinblått.
- Torka glasen på en värmeplatta inställd på 50 ° C och applicera 500 | il filtrerade toluidinblått fläck till en sektion med hjälp av en plast pasteurpipett. Värm avsnittet om värmeplattan tills en grön ring börjar dyka upp vid kanten av fläcken, och sedan tvätta bort det med vatten.
- Med hjälp av ett ljusmikroskop, ta biopsi histologi. Sektioner som används för immunohistokemi bör innehålla bra områden av oskadad laminapropria och epitel, med så få körtlar och så lite glatt muskulatur som möjligt.
- Som i avsnitt 3.4.2, skär sektioner som har god histologi och plocka upp dem med PLL-belagda objektglas för immunohistokemisk färgning. Skära åtminstone två sektioner från varje biopsi för analys. Torra bilder för åtminstone en timme. Efter torkning, kan sektionerna vara insvept i aluminiumfolie och förvarades vid -20 ° C i upp till 2 veckor, eller så kan de omedelbart immun.
4. Immunohistokemisk Färgning av GMA-inbäddade endobronkiala Biopsier
OBS: Natriumazid är giftigt. Förbered 0,1% natriumazid lösning inom ett dragskåp och bort från syror. Kontakt med syror frigör giftig gas.
- Rita runt sektioner med hjälp av en diamant spets penna och ordna bilderna på en färgning rack.
- Utför en Peroxidas block. Förbereda ett peroxidas blocket lösning av 0,3% väteperoxid i 0,1% natriumazid-lösning. apply 1 ml av peroxidas blocket till avsnitt och inkubera under 30 min.
- Bered en rengöringslösning med 0,05 M Tris-buffrad saltlösning (TBS), pH 7,6. Tvätta bilderna i TBS, 3x 5 min.
- Bered en 1% BSA blockera lösning i DMEM. Gör detta i förväg och i stora volymer, portion och frysa den tills den behövs. Dränera objektglasen och inkubera sektionerna i blocket lösning under 30 minuter för att blockera ospecifik antikroppsbindning. Om ospecifik bindning fortfarande förekommer, bland annat en 30 min inkubation steg med 5% serum kvarter från samma art som den sekundära antikroppen.
- Späd primär antikropp (CD45 eller CD1a) i TBS till önskad koncentration (CD45 utspätt till 1: 1000, CD1a utspätt till 1: 1,00) och tillämpa den på diabilder. Täckglas sektionerna och inkubera över natten vid RT.
- Tvätta diabilder i TBS tre gånger. Späd biotinylerad sekundär antikropp (riktad mot den primära antikroppen värdarten, i detta fall kanin-anti-mus-F (ab '2)) i TBS till den önskade koncentrationen (01:300 utspädning) och tillämpa den på diabilder. Inkubera i 2 h vid RT.
- Förbered en streptavidin biotin-peroxidas komplex åtminstone 30 minuter före användning. Se till att det är tillräckligt för att täcka alla bilder. Tvätta bilderna i TBS tre gånger. Applicera lösningen på bilderna och inkubera i 2 h vid RT.
- Tvätta bilderna i TBS tre gånger. Framställa 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) peroxidas-substratlösning (tillverkad enligt tillverkarens instruktioner). Tillämpa den på bilderna och inkubera i 20-30 minuter eller tills den önskade fläckintensiteten utvecklas.
- Skölj objektglasen i rinnande kranvatten under 5 min. Motfärg sektionerna med filtrerad Mayers hematoxylin-lösning under 2 min. Tvätta bilderna i rinnande kranvatten under 5 min.
- Töm bilderna och täcka delar med permanent vattenmonteringsmedium. Torka glasen vid 80 ° C i en torkugn. Låt objektglasen svalna och sedan montera dem med DPX och placera ett täckglas.
5. Staining Analys
- Analysera sektioner vid 40X förstoring med användning av ett ljusmikroskop med en monterad kamera ansluten till en dator.
OBS: För cellanalys, räkna positivt färgade, kärn celler i bronkerna lamina propria och intakt epitel, med undantag av områden av glatt muskulatur, körtlar, stora blodkärl, och inkompatibla eller skadad vävnad. - Det genomsnittliga cellräkningar och korrigera den genomsnittliga cellräkning för området av lamina propria och längden på epitelet. Det område av lamina propria och längden på epitelet kan beräknas med användning av ett bildanalysprogram.
6. Enzymatisk Digestion av endobronkiala Biopsier
- Tvätt biopsier: Använda steril pincett, placera intakta biopsier i en 15 ml koniskt rör som innehåller 10 ml Hanks buffrade saltlösning (HBSS) (Figur 3). Inkubera under 5 min vid RT på en gungande plattform vid 30 varv per minut. Överför biopsier till en steril dish genom dekantering av innehållet i 15 ml rör med HBSS.
- Störa slem med DTT: Byt HBSS i röret med 10 ml HBSS innehållande 5 mM 1,4-ditiotreitol (DTT). Överför biopsier tillbaka in i 15 ml rör med steril pincett. Inkubera under 15 min vid RT på en gungande plattform vid 30 varv per minut.
- Vortexa röret försiktigt under 15 sekunder. Överför biopsier på en steril skålen genom dekantering av innehållet i 15 ml rör med HBSS och DTT.
- Överföra de biopsier till odlingsmediet: Byt HBSS och DTT i röret med 10 ml RPMI 1640-odlingsmedium. Överför biopsier tillbaka in i 15 ml rör med steril pincett. Inkubera under 10 min vid RT på en gungande plattform vid 30 varv per minut.
- Smälta biopsier med kollagenas och DNas.
- Bered en digestion lösning av kollagenas II (0,25 mg / ml) och DNas (0,2 mg / ml) i förvärmda RPMI innehållande 1 M HEPES-lösning. Tillsätt 500 mikroliter av uppslutningslösningen per brunn i en 48-brunnars vävnadskulture platta.
- Placera en biopsi per brunn i matsmältningen lösning. Inkubera plattan på en skakande plattform under 60 min vid 37 ° C vid 220 rpm. Pipettera upp och ner efter 30 min att åter dispergera biopsier, och efter 60 min, för att fullständigt dela upp vävnaden.
- Förbereda enkelcellsuspensioner.
- Pool tillsammans de digere biopsier från brunnarna i en 50 ml tub genom att låta den passera genom en 40 | im cellfilter. Samla in de kvarvarande cellerna genom tvättning av brunnarna med iskall FACS-buffert (fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande 2% fetalt bovint serum).
- Pressa det återstående vävnad på cellfilter med hjälp av baksidan av kolven i en spruta. Centrifugera de spjälkade cellerna vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. Försiktigt bort supernatanten och suspendera pelleten i 5 ml iskall FACS buffert. Räkna cellerna manuellt med en hemocytometer och Trypan blånad att bedöma lönsamheten av cellerna.
- Resuspendera cellpelleten till cirka 1 x 10 6 celler i 200 | il FACS-buffert.
- Lägg till en cellviabilitet färgämne för döda celler uteslutning enligt tillverkarens protokoll.
- Tillsätt 5 | il av FcR blockeringsreagens och inkubera under 5 min vid 4 ° C.
- Lägg på cellytan antikroppar mot CD45 (2 pl), härstamning (CD3, CD20, CD56, CD66abce och CD14; 2 pl vardera), CD16 (0,5 l), HLA-DR (3 l), CD11c (5 l), CD123 (5 | il), CD1c (3 | il), och CD103 (2 | j, l) och inkubera under 15 minuter vid 4 ° C. Detaljer om antikroppar kan hittas i metodavsnittet, men titrera och optimera antikroppar mot exakt flödescytometern i bruk. Tvätta bort överskott av antikroppar med PBS under 5 min vid 400 x g. Förvärva prover färska på en flödescytometer eller fixera cellerna i 1% paraformaldehyd före senare acquisitJon.
- Identifiera humana DCs i lung biopsier med användning av en flödescytometri-analys 18 (figur 4).
OBS: Med hjälp av en flödescytometrianalys programvara, immunceller skiljer sig från andra lungceller genom grind på CD45. Döda celler kan uteslutas som celler som är positiva för LIVE / DEAD färgämne. Av all levande CD45 + celler, härstamningsceller (B-celler, T-celler, NK-celler, neutrofiler och monocyter) kan uteslutas med användning av en cocktail av antikroppar mot CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 och CD16 i en kanal. Efter att HLA-DR + celler gör det möjligt att identifiera alla mänskliga DCs. MDCS kan särskiljas från PDCs baserat på expressionen av CD11c eller bristen på CD11c, respektive. MDCS kan ytterligare delas in CD1c + MDCS eller CD141 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studier som kännetecknar mänskliga andningsvävnads bosatt immunceller, inklusive DC, är begränsade, till stor del på grund av det faktum att avlägsnas kirurgiskt eller hela mänskliglungvävnad är knappa. Här är en mindre invasiv metod för att få lungvävnad från endobronkiala biopsier (EBB) av friska frivilliga och utvecklade protokoll för att studera immunceller i vävnaden med hjälp av immunohistokemi eller flödescytometri beskrivs.
Friska frivilliga genomgick bronkoskopi, såsom tidigare beskrivits 19, 20. Sex till nio 1-2 mm 3 endobronkiala slemhinnor biopsier togs från huvud carina och de viktigaste luftrörs divisioner för varje ämne med hjälp av Fenestrated pincett (Figur 1A). Två biopsier var inbäddade i GMA och därefter används för immunohistokemi för att tillhandahålla rumslig information. Den återstående biopsies var enzymatiskt och encelliga suspensioner analyserades med hjälp av flerfärgade flödescytometri, vilket möjliggjorde noggrann karaktärisering av sällsynta cellgrupper (Figur 1B).
För att få så mycket rumslig information som möjligt från små vävnadsbitar ades biopsier inbäddade i GMA som möjliggör ultratunna im sektioner (figur 2A-B). Som väntat, CD45-uttryckande immunceller var relativt sällsynta i genomsnitt 125 CD45 + celler per mm 2 var närvarande i mukosal lungvävnad under steady-state-betingelser, såsom fastställts genom immunhistokemi (figur 2C). IgG1 isotypkontroll gav ingen positiv färgning, vilket visar hög specificitet för den primära antikroppen. Antalet positiva celler i både lungepitelet och den underliggande lamina propria kvantifierades och visade att CD45 + immune celler var mer rikligt förekommande i den lamina propria än i epitel (figur 2D). Vidare har CD1a-uttryckande celler identifierats och räknats, och de troligen representerar DCs (Figur 2E). I genomsnitt var färre än en CD1a + cell per mm 2 identifierades i lungan lamina propria vid steady state (Figur 2F).
Immunohistokemi ger information om den anatomiska fördelningen av celler i intakt vävnad, men den är typiskt begränsad i sin förmåga att definiera cellerna med användning av multipla cell ytmarkörer. Flera färger flödescytometri, beroende på instrumentet, har fördelen av att tillhandahålla mer information per cell, och det kan användas i små prover. Upp till nio mukosala lung biopsier slogs samman, tvättades, och inkuberades att störa slem. Varje biopsi digererades sedan med kollagenas och DNas i enskilda brunnar i en 48 brunn-platta, vilket resulterar i en enkelcellsuspension (Figures 3A - 3B). I genomsnitt var 1,5 x 10 6 endobronkiala celler per ämne erhålls, och en positiv korrelation mellan cellutbytet och livskraft observerades (Figur 3C). Den reducerade cellviabilitet observeras med lägre cellantal skulle potentiellt kunna förklaras av en högre enzymkoncentration per cell som var suboptimal för cellerna. Detta är en utmaning med biopsier varierande både i storlek och i celldensitet, med vissa biopsier provtagning mer av ytliga slemhinnan än andra. Som väntat, flödescytometrisk analys av den encelliga suspension visade att i genomsnitt var 12% av cellerna CD45 + leukocyter, medan majoriteten av celler i lungan mukosal vävnad under stationära förhållanden var inte immunceller (Figur 3D ). Flödescytometrisk och IHC uppgifter korrelerade, som belyser styrkan i att använda båda teknikerna parallellt.
+ leukocyter som uttryckte HLA-DR men var negativa för härstamning markörer CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14 och CD16 (figur 4A). I denna lilla population av celler, plasmacytoid DCs (PDCs) identifieras baserat på deras brist på CD11c expression och deras höga uttryck av CD123 och HLA-DR (blågrön). Bland de CD11c + HLA-DR + linjenegativa celler, både CD1c + (korall) och CD141 + (rödbrun) myeloida DCs identifierades (Figur 4A). För att ytterligare karakterisera dessa cellgrupper, deras uttryck av integrin CD10 3 som binder till E-cadherin, viktigt i vävnadsförankring, utvärderades. Medan alla DC delmängder, såväl som T-celler som cirkulerar i perifert blod, var låga eller negativa för CD103, en distinkt del av DCS-och T-celler som återfinns i lungorna hos samma individ uttryckt CD103. Detta var sant för celler som återfinns både i bronkoalveolär skölj samt i lungvävnad (Figur 4B).
Figur 1: Provtagning av human lunga slemhinnevävnad. (A) Bronchoscopies utfördes på ämnen för att erhålla endobronkiala biopsier från de viktigaste luftrörsuppdelningarna av en lung använder pincett. (B) biopsier antingen inbäddade i GMA för vävnadssnitt och immunohistokemi (blå diagram) eller enzymatiskt för att erhålla en enda cellsuspensioner för flödescytometri (rosa diagram).m / filer / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bädda biopsier i GMA harts. (A) Biopsier tagna från bronchoscopies fördes omedelbart till glasflaskor som innehåller iskall uttorkad aceton (till vänster). Efter natten fixering ades biopsier infiltrerades med metylbensoat lösning. Biopsier placerades i bädda kapslar fyllda med bädda lösning för att påbörja polymerisation (mitten panel). Inbäddade biopsier kan lagras vid -20 ° C eller kan avdelas för immunohistokemi färgning (högra panelen). (B) De schematiska höjdpunkter viktiga steg i processen för att bädda biopsier hjälp GMA. Representativa bilder av sektione biopsier visar närvaron av CD45 + (C) eller CD1a + celler (E) visas i förhållande till respektive isotypkontrollerna (höger paneler). Specifik färgning visas i rött, och cellkärnorna motfärgades med hematoxylin är i blått. Skalstreck = 50 | im. Stapeldiagram visar medianen ± interkvartilt intervall av CD45 + (D) eller CD1a + (F) celler per mm 2 i epitelet eller lamina propria (n = 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Enzymatisk digestion av biopsier för flödescytometri. (A) En endobronkiala biopsi tas från en bronkoskopi i en petriskål. Biopsierna tvättades i HBSS, behandlades med DTT för att avlägsna slem, end spjälkas med kollagenas och DNas före samlingen av enskilda celler för flödescytometrisk analys. (B) Den schematiska sammanfattar de viktigaste förfarandena för att smälta biopsier för flödescytometri. (C) Diagrammet visar korrelationen i cell avkastning och lönsamhet, enligt bedömning av manuell räkning och trypanblåttuteslutning (n = 20). (D) Single-cellsuspensioner från den digere biopsi analyserades genom flödescytometri och bedömas med avseende på viabilitet och uttrycket av CD45 (leukocyt gemensamma antigenet). Flödescytometri tomten visar en representativ givare av 20 friska försökspersoner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Identifiering av lung dendritiska cellundergrupper i smält biopsies. (A) gating strategi för identifiering av CD1c + och CD141 + myeloida DCs (MDCS) och plasmacytoid DCs (PDCs) i lung slemhinnevävnad. Flödescytometri tomter från ett representativt ämne visas. (B) De punktdiagram visar uttrycket av integrin CD103 på populationer av DC i lung biopsier (till vänster), bronkoalveolär lavage (mitten panel) och perifert blod (högra panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver hur man skapar en detaljerad rumslig och fenotypiska karaktärisering av lungvävnad bosatta DC hos friska människor med hjälp av immunhistokemi och flödescytometri på endobronkiala slemhinnor biopsier som samlats in under bronkoskopi. I de följande styckena kritiska steg i protokollet diskuteras i detalj.
Kritiska steg med protokollet
Sektionering och immunohistokemi: Det är viktigt att hålla de biopsi blocken vid -20 ° C när de inte använder dem (steg 2,5). Varma block kan ibland bli mjuk och kommer inte avsnitt också. Dessutom kommer att hålla blocken vid -20 ° C bevara antigenplatser och resultera i bättre färgning med användning av immunohistokemi.
Sektione och immunhistokemi: När sektionering av GMA-inbäddade biopsier, är det lämpligt att ha 3-4 behållare av ammoniakvatten som att flyta avsnitten på. När en sektion är plockas upp, make se till att ersätta den med en ny sektion (steg 3,4). Detta säkerställer att, vid den tidpunkt då avsnittet hanteras igen, kommer det att ha flutit på ammoniakvatten för ungefär rätt tid (45-90 sek), vilket underlättar antigenpresentation och den efterföljande immunohistokemi. Cutting 2 | j, m sektioner på detta sätt också medger konsekutiv snittning, vilket innebär att samma cell potentiellt kan färgas med olika cellytan eller intracellulära markörer. Det är viktigt att inte röra i framkanten av glasbladet när sektionering, eftersom det är lätt skadas. Om det finns någon skräp från bladet som måste avlägsnas, alltid borsta bort från skäreggen.
Enzymatisk nedbrytning och flödescytometri: I vävnadsprover där immunceller är sällsynta, är det viktigt att inkludera CD45 i flödes färgning panelen att först identifiera leukocyter (i minoritet) innan ytterligare identifierar DCs eller andra immunceller av intresse. Även "fluorescence minus en "eller isotypkontrollerna är avgörande för att inkludera medan validera panelerna antikropp som användes för att säkerställa att sällsynta händelser sann signal över buller.
Ändringar och felsökning
Sektionering och immunohistokemi: För de flesta cellulära markörer uttryckta av immunceller, kan tonsill vävnad användas som en god positiv kontroll och för att titrera antikroppar för immunohistokemi, för att undvika slöseri med begränsad endobronkial biopsimaterial (steg 4). För att visualisera de dendritiska processerna för DC: er, kan vävnaderna sektion parallellt med epitel, snarare än vinkelrätt genom en slemhinna 21. Andra peroxidas substrat kan användas som tillägg till AEC, såsom DAB, om användaren kräver ett annat substrat färg. Avidin / biotin enzymkomplex kan också vara substituerade, till exempel, med alkaliskt fosfatas.
Enzymatisk digerering och flödescytometri: Även om slutobronchial biopsier är små, vävnads-resident celler överlever den enzymatiska digestion och bearbetning till en enkelcellsuspension för flödescytometrisk analys (Figur 3). Det är dock viktigt att utvärdera de potentiella effekterna av enzymerna på fläckarna som används i flödescytometri antikroppspanel. För att testa huruvida enzymatisk spjälkning protokoll klyver bort, ändrar eller stör färgningsantikroppen, mer lättillgängliga celler som uttrycker liknande markörer, såsom perifera mononukleära blodceller, kan behandlas med matsmältningsenzymer (steg 6) eller inte, och de kan därefter av färgades med fluorescensmärkta antikroppar och analyserades med flödescytometri (steg 7). Om kollagenas och DNas inte interfererar med antigenet tillgänglighet bör fläckarna med eller utan behandling av cellerna med enzymer se liknande. Vidare detta verifieras kan använda både flödescytometri, liksom intakt vävnadssektioner och immunohistokemi (Fisiffror 2 - 3) 19.
Begränsningar av tekniken
Bronkoskopi: De flesta friska individer tolerera en bronkoskopi väl, och det är en metod som rutinmässigt används för att undersöka och prova lungorna, bland annat för att samla endobronkiala slemhinnor biopsier, som beskrivs här (steg 1). Men är bronkoskopi normalt inte en lämplig metod att utföra för längd provtagning, eftersom det ofta uppfattas som obehagligt, och det är också en tids- och resurskrävande förfarande. Därför endobronkiala biopsier ger bara en ögonblicksbild av immunceller som finns i slemhinnans lungvävnaden vid en given tidpunkt, snarare än en långtidsstudie av förändringar i dynamik och kinetik.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Sektionering och immunhistokemi: Fördelen med att bädda in GMA snarare än paraffin eller genom kryokonserveringär den överlägsna bevarandet av morfologi och antigener och större antal sektioner från de små biopsier, på grund av de tunna sektionerna som kan erhållas 17.
Enzymatisk digerering och flödescytometri. Genom att erhålla enstaka celler från små biopsier, kan mycket mer information uppnås genom flera färger flödescytometri.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
Detta protokoll beskrivs två parallella metoder för att maximera den information som kan erhållas från små endobronkiala biopsier genom att kombinera immunohistokemi och flödescytometri. För att karakterisera den geografiska fördelningen av sällsynta immunceller såsom DC, biopsier kan bäddas in i GMA att erhålla tunna sektioner för immunhistokemi, medan att skilja DC från andra immunceller med liknande markörer, den enzymatiska nedbrytning av de biopsier tillåter flera färger flödescytometri vara performed. För att möjliggöra objektiv identifiering av nya egenskaperna hos DC under inflammation eller sjukdom, kan den automatiserade analysen av flödescytometriska data utförs genom att applicera feature extraction algoritmer 22. Framtida tillämpningar inkluderar användning av dessa enstaka celler för cellsortering för att samla specifika cellpopulationer som kan användas för RNA-sekvensering eller transcriptomic profilering. Identifieringen av DC bosatta i lungorna kan vara viktig för att förstå förändringar i immun landskapet under hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de frivilliga som har bidragit kliniskt material till denna studie. Vi är också tacksamma för personalen vid Institutionen för folkhälsa och klinisk medicin, Avdelningen för medicin / Respiratory Medicine, Universitetssjukhuset, Umeå (Norrlands Universitetssjukhus) för insamling av alla kliniskt material.
Detta arbete har finansierats med bidrag till AS-S från svenska Vetenskapsrådet, Svenska Hjärt-Lungfonden, Svenska Stiftelsen för Strategisk Forskning, och Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
