Introduction
Die Lungen sind in ständigem Kontakt mit der äußeren Umgebung und sind an beiden unschädliche Teilchen und Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Krankheit zu verursachen stark ausgesetzt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Immunsystem wirksamer Immunreaktionen gegen eindringende Pathogene zu montieren, aber es ist ebenso wichtig, Toleranz gegenüber inhalierten Antigenen zu erhalten, die nicht Krankheit verursachen kann. Bereitzustellen potent Immunüberwachung wird das Atmungssystem mit einem Netzwerk von Immunzellen ausgekleidet, einschließlich dendritischen Zellen (DCs). DCs sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die mit der einzigartigen Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren. In menschlichen Lungen auftreten resident DCs ein Antigen und dann verarbeiten und transportieren sie in die Lunge-drainierenden Lymphknoten zur Präsentation an und Aktivierung von T - Zellen 1, 2, 3.
Im menschlichen Immunsystem kann DCs in mehrere Untergruppen unterteilt werden, mit Distinct aber überlappende Funktionen: CD1c + und CD141 + myeloider DCs (MDC) und CD123 + plasmazytoiden DCs (PDCs) 4, 5. Während die meisten detailliertes Wissen über die menschliche DCs aus Studien in Blut stammt, ist nun klar , dass die menschliche Lunge 9 auch seltene Populationen von DC Untergruppen mit T-Zell - stimulierende Kapazität 6, 7, 8, Hafen. Allerdings zeigen anfallenden Daten , dass Immunzellen, einschließlich DCs, unterscheiden sich in ihrer Frequenz, Phänotyp und Funktion in Abhängigkeit von ihrer anatomischen Lage 10. Somit ist es wichtig, Immunzellen aus dem relevanten Gewebe zu studieren ihren Beitrag zur lokalen Immunität und Toleranz zu verstehen. Zusammengenommen unterstreicht dies die Notwendigkeit, Lungenresidenten DCs zu studieren, wenn Lungenerkrankungen Adressierung trotz Blut DCs mehr ist leicht verfügbar und zugänglich in Menschen.
Die ersten Studien , die Lungenresidenten DCs beim Menschen in erster Linie untersucht verließ sich auf die Morphologie und die Expression einzelner Marker, wie HLA-DR und CD11c, in Gewebeschnitten mittels Immunhistochemie 11, 12, 13. Im Gegensatz dazu haben neuere Studien der Regel auf durchflusszytometrischen verlassen analysiert verschiedene Immunzelluntergruppen zu untersuchen. Da es jedoch schwierig ist, einen einzelnen Zelloberflächenmarker zu finden, die eindeutig einen bestimmten DC Subset identifiziert, ist die potentielle Begrenzung der Studien Anwendung nur Vierfarben-Durchflusszytometrie das Risiko Zellpopulationen mit ähnlichen phänotypischen Marker wie DCs von einschließlich. Zum Beispiel CD11c wird auf allen myeloiden DCs und die überwiegende Mehrzahl der Monozyten exprimiert. Auf der anderen Seite, in Studien fortgeschritteneren Durchflusszytometrie Platten, nicht-kanzerösen Lungengewebe von chirurgische Resektionen von Patienten Anwendung wurden typischerweise verwendet,xref "> 10, 14, 15, 16, obwohl es ist unklar , ob diese seltenen Populationen von DCs in gesunden Probanden wirklich repräsentativ sind. Insgesamt sind im Wesentlichen auf die Tatsache Studien begrenzt , dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp.
Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, beschreibt diese Arbeit, wie eine detaillierte Analyse der räumlichen Verteilung und einer phänotypischen Identifizierung von DCs in der Schleimhaut endobronchiale Biopsien von gesunden Freiwilligen erhalten auszuführen, die eine Bronchoskopie unterziehen. Mehrere kleine Biopsien können von jedem einzelnen gesammelt werden und anschließend eingebettet werden kann für das Schneiden und Analyse Immunhistochemie oder enzymatisch für fortgeschrittene durchflusszytometrische Analyse verdaut. Verwendung von Lungengewebe in Form von endobronchialen Biopsien von Bronchoskopie erhalten verleiht den Vorteil, dass es möglich, die st auszuführenudy an gesunden Freiwilligen, im Gegensatz zu einer offenen Operation der Lunge, die aus offensichtlichen Gründen ist, beschränkt sich auf Patienten, die Thoraxchirurgie erfordern. Weiterhin das Gewebe, das während einer Bronchoskopie von gesunden Freiwilligen abgetastet ist physiologisch normal, im Gegensatz zu einem nicht-betroffenen Bereich von Lungengewebe bei Patienten mit einer Lungenkrankheit. Auf der anderen Seite sind die Biopsien klein und die Anzahl der Zellen wiedergewonnen, selbst wenn mehrere Biopsien Bündelung begrenzt den Typ von Analyse, die durchgeführt werden können.
Während die vorliegende Arbeit auf DCs konzentriert sich die beschriebenen Methoden direkt erweitert werden kann, um andere (Immun-) Zellen von Interesse, die in der menschlichen Schleimhaut Lungengewebe befinden umfassen. Darüber hinaus sind die Protokolle auch direkt anwendbar auf Proben von Patienten erhalten von Lungenerkrankungen leiden, wo Bronchoskopie Teil der Feststellung der Diagnose, wie zB chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Sarkoidose oder Lungenkrebs ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Diese Arbeit wurde von der regionalen Ethical Review Board in Umeå, Schweden genehmigt wurde.
1. Bronchoskopie zur Probenahme Endobronchial Biopsien von Human Subjects
- Erhalten Sie informierte Zustimmung aller Beteiligten.
- Behandeln Sie Patienten mit oralem Midazolam (4-8 mg) und intravenöse Glycopyrroniums (0,2-04 mg) 30 Minuten vor der Bronchoskopie. Bewerben Lokalanästhesie mit Lidocain in den Larynx und der Bronchien. Lassen Sie das Thema Gurgeln mit ~ 3 ml Lidocain 4% und gelten 3 ml auf die Zungengrund und in den Larynx über eine Larynx Spritze. Optimieren Sie die Lokalanästhesie mit 8-10 Dosen von Lidocain-Spray. Führen Sie diesen Schritt mit dem Thema Sitzen.
- Legen Sie eine flexible Video-Bronchoskop durch den Mund über ein Mundstück aus Kunststoff mit dem Thema in der Rückenlage. Verwenden Sie einen speziell angefertigten Spritz Katheter die Lokalanästhesie der distalen Trachea und der Bronchien über das Bronchoskop zu vervollständigen. Hier verwenden, um eine Dosis von ungefähr5-10 ml Lidocain 2%.
- Nehmen Sie 6-9 endobronchiale Schleimhaut - Biopsien von der Haupt carina und die wichtigsten bronchiale Divisionen mit Fenstern versehenen Zange (Abbildung 1). Im Anschluss an die Bronchoskopie und vor dem Verlassen des Krankenhauses, lassen Sie den Gegenstand Rest für 2-4 Stunden und ihm / ihr mit einer leichten Mahlzeit.
2. Die Einbettung der Biopsien in Glycol Methylacrylat (GMA) Harz
HINWEIS: Die GMA Immunofärbungsprotokoll ursprünglich an der Universität Southampton, Histochemie Research Unit 17 entwickelt wurde.
- Befestigung: Für die Immunhistochemie, die Biopsien aus der Zange entfernen und legen Sie sie direkt in Fläschchen Glas mit 3 ml eiskaltem dehydriert Aceton und Protease-Inhibitoren (Phenylmethylsulfonylfluorid (35 mg / 100 ml Aceton) und Iodacetamid (370 mg / 100 ml Aceton )). Befestigen Sie das Gewebe über Nacht bei -20 ° C (Abbildung 2).
HINWEIS: Die folgenden Schritte perfo werden sollin einem Abzug mit geeigneten Nitrilhandschuhen RMED. Die Einbettung Kit enthält Komponenten, die Sensibilisierung, Reizungen verursachen können, und / oder allergischen Hautreaktionen kommen. Alle Abfälle sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. - Dehydration: Entfernen Sie das Aceton mit Inhibitoren und ersetzen mit frischen dehydriert Aceton (ohne Inhibitoren) für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie das Aceton und ersetzen Sie es mit Benzoesäuremethylester für 15 min.
- Infiltrations: Vorbereiten einer Verarbeitungslösung von 5% Benzoesäuremethylester Lösung in Glykol Methacrylatmonomer; 10 ml ist für ein Fläschchen ausreichend. Mit Kunststoff-Pasteurpipetten, absaugen der Benzoesäuremethylester Lösung und ersetzen mit 3 ml Verarbeitungslösung. Inkubieren der Biopsien und überschüssige Behandlungslösung bei 4 ° C für 2 h; Pasteur-Pipetten können für alle nachfolgenden Lösung Änderungen verwendet werden, einschließlich Lösung zu integrieren.
- Tauschen Sie die Verarbeitungslösung alle 2 Stunden (3x 2 h Inkubationen), so dass die gesamte Infiltrationszeit des Biopsies in der Verarbeitungslösung beträgt mindestens 6 Stunden. Legen Sie Papieretiketten in das obere Ende der Einbettung Kapseln die Biopsien zu identifizieren.
- Vorbereiten eines Einbettungs Lösung von 75 mg Benzoylperoxid in 10 ml Glykol Methacrylatmonomer. Zugabe von 0,25 ml N, N - Dimethylanilin Poly (ethylenoxid) (Beschleuniger) zum Einbettungslösung um die Polymerisationsreaktion zu beginnen. Entfernen Sie die Verarbeitungslösung und legen Sie eine Biopsie in die entsprechende Einbettung Kapsel mit einer Pinzette.
- Langsam füllen an die Spitze der Einbettung Kapsel mit Lösung Einbetten und die Kappe schließen. Vermeiden Sie die Biopsie zu stören und große Luftblasen zu schaffen. Inkubieren Sie die Kapseln bei 4 ° C, bis das Harz vollständig polymerisiert ist.
- Speichern der eingebetteten Biopsien bei -20 ° C in einem 50 ml-Röhrchen ca. 5 g Kieselgel enthält.
3. Sectioning von GMA-embedded Endobronchial Biopsien
- Objektträger-Beschichtung: Waschen Sie die Objektträger in einGeschirrspüler auf einem normalen Zyklus. Decken Sie die Dias und lassen sie an der Luft trocknen.
- Vorbereitung einer Beschichtungslösung aus 10% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung in destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Folien in Beschichtungslösung für 5 Minuten, und sie dann an der Luft trocknen lassen. Trocken lagern PLL-beschichteten Folien in der Originalverpackung.
- Blatt Glasstreifen mit 0,1% Tween 20 in destilliertem Wasser waschen. Spülen Sie das Glas mit 70% Ethanol und mit Papiertüchern trocken. Schneiden Sie Glas Klingen aus dem Glasstreifen mit einem Messermacher verwenden. Lagern Sie die Blätter in einen Behälter, der Bewegung, um sicherzustellen, wird verhindert, dass die Schneidkante nicht beschädigt wird oder gekerbt.
- Biopsy Besatz: Legen Sie die Biopsie Kapsel in einer Kapselsplitter und fällten jede Seite mit einem Kohlenstoff-Stahl Single-Kante Klinge. Entfernen Sie die GMA-embedded Biopsie und stecken Sie sie fest in einen Schraubstock. Überschüssiges GMA aus der ganzen Biopsie mit Hilfe der Stahlklinge.
- GMA Schnitte.
- Bereiten 0,05% Ammoniaklösung mit destilliertem Wasser. Das Glas Messer und Biopsie in the Mikrotom. Sorgfältig ausrichten Block die Biopsie-Block mit der Klinge den Messerhalter durch die Einstellung und den Winkel der Biopsie, so dass die Klinge gegen die Oberfläche des Blocks flach aufliegt.
- Schneiden Sie 2 um dicke Abschnitte das Mikrotom auf eine langsame Schnittgeschwindigkeit und verwenden Zange zu übertragen und Schwimmer aus Abschnitten auf dem Ammoniakwasser. Schwimmer die Abschnitte für 45-90 Sekunden, so dass sanfte Antigen-Retrieval und Entfaltung des Abschnitts.
- Pick-up Abschnitte mit Mikroskop-Objektträger. Überprüfen Sie die Biopsie Histologie durch schnell mit Toluidinblaufärbung.
- Trocknen Sie die Dias auf einer heißen Platte auf 50 ° C und anwenden 500 ul gefiltert Toluidinblau Fleck auf einen Abschnitt einer Kunststoff Pasteurpipette. Erwärmen Sie den Abschnitt auf der heißen Platte, bis ein grüner Ring am Rand des Flecks zu entstehen beginnt, und dann mit Wasser abwaschen.
- Mit einem Lichtmikroskop, überprüfen Sie die Biopsie Histologie. Bereiche für die Immunhistochemie verwendet werden, sollten gute Bereiche unbeschädigter Lamina enthaltenpropria und Epithel, mit möglichst wenigen Drüsen und so wenig wie möglich der glatten Muskulatur.
- Wie in Abschnitt 3.4.2, schneiden Abschnitte, die gute Histologie haben und holen sie mit PLL-beschichteten Objektträger für die immunhistochemische Färbung auf. Schneiden mindestens zwei Abschnitte von jeder Biopsie für die Analyse. Trockenobjektträger für mindestens 1 Std. Nach dem Trocknen Abschnitte können in Stanniol und gelagert bei -20 ° C für bis zu 2 Wochen eingewickelt werden oder sie können sofort immunhistochemisch werden.
4. immunhistochemischen Färbung von GMA-embedded Endobronchial Biopsien
HINWEIS: Natriumazid ist giftig. Bereiten Sie die 0,1% Natriumazid-Lösung innerhalb einer Abzugshaube und weg von Säuren. Berührung mit Säure giftige Gase.
- Zeichnen Sie um Abschnitte einen Diamantstift und die Dias auf eine Färbebank arrangieren.
- Führen Sie einen Peroxidase-Block. Bereiten einer Peroxidase Block Lösung von 0,3% Wasserstoffperoxid in 0,1% Natriumazid-Lösung. Apply 1 ml der Peroxidase Block Abschnitte und für 30 min inkubieren.
- Bereiten Sie eine Waschlösung von 0,05 M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), pH 7,6. Waschen Sie die Folien in TBS, 3x 5 min.
- Bereiten Sie eine 1% BSA-Block-Lösung in DMEM. Tun Sie dies im Voraus und in großen Mengen aliquotieren und einfrieren, bis sie benötigt. Lassen Sie die Folien und brüten die Abschnitte in Blocklösung für 30 min unspezifische Antikörper zu blockieren Bindung. Wenn unspezifische Bindung immer noch auftritt, umfassen eine 30 min Inkubationsschritt mit 5% Serum Block von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper.
- Verdünnte primärer Antikörper (CD45 oder CD1a) in TBS auf die gewünschte Konzentration (CD45 bei einer Verdünnung von 1: 1000; CD1a bei einer Verdünnung von 1: 1,00) und es auf Folien. Deckglas die Abschnitte und über Nacht bei RT inkubiert.
- Waschen Dias in TBS dreimal. Verdünnte biotinylierten sekundären Antikörper (gerichtet gegen den primären Antikörper Wirtsspezies, in diesem Fall von Kaninchen - anti-Maus - F (ab '2)) in TBS auf die gewünschte Konzentration (1:300 Verdünnung) und es auf Folien. Inkubieren für 2 h bei RT.
- Bereiten Sie eine Streptavidin Biotin-Peroxidase-Komplex mindestens 30 min vor dem Gebrauch. Stellen Sie sicher, dass es genug für alle Folien abzudecken. Waschen Sie die Folien in TBS dreimal. Tragen Sie die Lösung auf die Objektträger und Inkubation für 2 h bei RT.
- Waschen Sie die Folien in TBS dreimal. Bereiten Sie 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) Peroxidase-Substratlösung (hergestellt pro Anweisungen des Herstellers). Wenden Sie es auf den Schlitten und Inkubation für 20-30 Minuten oder bis die gewünschte Farbintensität entwickelt.
- Spülen Sie die Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min. Gegenfärbung der Schnitte mit gefilterten Mayers Hämatoxylin-Lösung für 2 min. Waschen Sie die Folien Leitungswasser für 5 Minuten in Laufen.
- Lassen Sie die Folien und decken die Bereiche mit permanenten wässrigen Eindeckmittel. Trocknen der Objektträger bei 80 ° C in einem Trockenofen. Lassen Sie die Folien, abkühlen lassen und dann montieren sie mit DPX und setzen Sie ein Deckglas.
5. Staining Analyse
- Analysieren Sie die Abschnitte bei 40-facher Vergrößerung eines Lichtmikroskops mit einer montierten Kamera an einen Computer angeschlossen.
HINWEIS: Für die Zellanalyse, Graf positiv gefärbt, kernhaltigen Zellen in der bronchialen Lamina propria und intakten Epithels, ohne Bereiche der glatten Muskulatur, Drüsen, große Blutgefäße, und nicht übereinstimmen oder beschädigtes Gewebe. - Der Mittelwert der Zellzahlen und korrigieren Sie die durchschnittliche Zellzahl für den Bereich der Lamina propria und der Länge des Epithels. Der Bereich der Lamina propria und die Länge des Epithels kann unter Verwendung eines Bildanalyseprogramm berechnet werden.
6. Die enzymatische Verdauung von Endobronchial Biopsien
- Waschen Biopsien: Unter Verwendung einer sterilen Pinzette Ort intakten Biopsien in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) (Abbildung 3). Inkubieren für 5 min bei RT auf einem Schüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie die Biopsien in ein steriles dIsh durch den Inhalt des 15-ml-Röhrchen mit HBSS dekantiert.
- Brechender Schleim mit DVB-T: Ersetzen Sie die HBSS in der Röhre mit 10 ml HBSS, enthaltend 5 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT). Übertragen Sie die Biopsien zurück in die 15-ml-Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Schüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute.
- Mischen Sie den Schlauch vorsichtig für 15 Sekunden. Übertragen Sie die Biopsien auf eine sterile Schale durch den Inhalt des 15-ml-Röhrchen mit HBSS und DTT Umfüllen.
- Die Übertragung der Biopsien in das Kulturmedium: Ersetzen Sie die HBSS und DTT in dem Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640-Kulturmedium. Übertragen Sie die Biopsien zurück in die 15-ml-Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Inkubieren für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute.
- Verdauen Biopsien mit Kollagenase und DNase.
- Bereiten Sie eine Aufschlußlösung von Kollagenase II (0,25 mg / ml) und DNase (0,2 mg / ml) in vorgewärmten RPMI mit 1 M HEPES-Lösung. In 500 ul der Aufschlusslösung pro Well in einer 48-Well-Gewebe Kulture Platte.
- Platz 1 Biopsie pro Vertiefung in Aufschlußlösung. Inkubieren der Platte auf einer Schüttelplattform 60 Minuten lang bei 37 ° C bei 220 rpm. Pipette nach oben und unten nach 30 Minuten, um die Biopsien wieder zu dispergieren, und nach 60 min vollständig in das Gewebe aufzuschlüsseln.
- Vorbereiten Einzelzellsuspensionen.
- Pool zusammen die verdauten Biopsien aus den Vertiefungen in einen 50-ml-Röhrchen, indem es durch ein 40 & mgr; m Zellsieb verläuft. Sammle die restlichen Zellen durch die Vertiefungen mit eiskaltem FACS-Puffer gewaschen (Phosphate-buffered saline (PBS), enthaltend 2% fötales Rinderserum).
- Quetschen das verbleibende Gewebe auf der Zellsieb die Rückseite des Kolbens einer Spritze. Zentrifugiere die verdauten Zellen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig entfernen und das Pellet in 5 ml eiskaltem FACS-Puffer resuspendieren. Zählen Sie die Zellen manuell ein Hämozytometer und Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen.
- Resuspendieren des Zellpellets auf etwa 1 x 10 6 Zellen in 200 & mgr; l FACS - Puffer.
- Fügen Sie eine Lebensfähigkeit der Zellen Farbstoff für tote Zelle Ausschluss gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- In 5 ul FcR-Blockierungsreagenz und Inkubation für 5 min bei 4 ° C.
- In Zelloberfläche Antikörper gegen CD45 (2 ul), Linie (CD3, CD20, CD56, CD66abce und CD14; 2 ul jeweils), CD16 (0,5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123 (5 ul), CD1c (3 ul) und CD103 (2 ul) und für 15 min bei 4 ° C inkubieren. Details zu Antikörper können in dem Abschnitt Verfahren gefunden werden, aber titrieren und die Antikörper auf die genaue Durchflusszytometer im Einsatz zu optimieren. überschüssige Antikörper mit PBS für 5 min bei 400 x g abzuwaschen. Erwerben Sie die Proben frisch auf einem Durchflusszytometer oder die Zellen in 1% Paraformaldehyd fixieren vor später acquisitIon.
- Identifizieren menschlichen DCs in Lungenbiopsien unter Verwendung einer Durchflusszytometrie - Assay 18 (Abbildung 4).
HINWEIS: eine Durchflusszytometrie-Analyse-Software verwendet wird, werden Immunzellen aus anderen Lungenzellen zeichnen sich durch auf CD45 Gating. Tote Zellen können als Zellen ausgeschlossen werden, dass für die Live / Dead-Farbstoff positiv sind. Von allen Live - CD45 + Zellen, Linie Zellen (B - Zellen, T - Zellen, NK - Zellen, Neutrophilen und Monozyten) in einem Kanal mit einem Cocktail von Antikörpern gegen CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 und CD16 werden ausgeschlossen. Dem folgend, HLA-DR + Zellen die Identifizierung aller humanen DCs ermöglichen. MDCs kann von PDCs unterschieden werden basierend auf der Expression von CD11c oder das Fehlen von CD11c, respectively. MDCs können weiter in CD1c + MDCs oder CD141 + unterteilt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studien an menschlichen Atmungsgewebe residenten Immunzellen zu charakterisieren, einschließlich DCs, sind begrenzt, vor allem aufgrund der Tatsache, dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp. Hier wird eine weniger invasive Methode der Lungengewebe von endobronchialen Biopsien erhalten (EBB) von gesunden Freiwilligen und entwickelten Protokolle, die Immunzellen in das Gewebe zu studieren Immunhistochemie unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder skizziert.
Gesunde Probanden unterzogen Bronchoskopie, wie zuvor beschrieben 19, 20. Sechs bis neun 1-2 mm 3 endobronchiale Schleimhautbiopsien wurden von der Haupt carina und den wichtigsten bronchiale Divisionen jedes Thema mit Fenstern versehenen Zange (Abbildung 1A) entnommen. Zwei Biopsien wurden in GMA eingebettet und anschließend für die Immunhistochemie verwendet räumliche Informationen zur Verfügung zu stellen. Der verbleibende biopsies wurden enzymatisch verdaut und die Einzelzellsuspensionen wurden Durchflusszytometrie mehrfarbigen analysiert, die sorgfältige Charakterisierung von seltenen Zellpopulationen (1B) erlaubt.
Zu erhalten , wie viel räumliche Informationen wie möglich aus den kleinen Gewebestücken wurden die Biopsien in GMA eingebettet , die (2A-B Abbildung) für ultradünne um - Schnitte ermöglicht. Wie erwartet, CD45-exprimierenden waren Immunzellen relativ seltenen durchschnittlich 125 CD45 + Zellen pro mm 2 in mukosalen Lungengewebe vorhanden waren , während des stationären Bedingungen, wie durch Immunhistochemie (2C) bewertet. Die IgG1 Isotyp-Kontrolle führte zu keiner positive Färbung, was eine hohe Spezifität des primären Antikörpers. Die Anzahl der positiven Zellen sowohl in der Lunge Epithel und der propria zugrunde liegenden Lamina wurden quantifiziert und zeigten , dass CD45 + Immunzellen im la reichlicher warenmina propria als im Epithel (2D). Darüber hinaus wurden CD1a-exprimierenden Zellen identifiziert und aufgezählt, und sie am ehesten repräsentieren DCs (Abbildung 2E). Im Durchschnitt weniger als ein CD1a + Zellen pro mm 2 wurde in der Lunge lamina propria im stationären Zustand (Figur 2F) identifiziert.
Immunhistochemie liefert Informationen über die anatomische Verteilung der Zellen in intaktem Gewebe, aber es ist typischerweise beschränkt in seiner Fähigkeit, die Zellen unter Verwendung mehrerer Zelloberflächenmarker zu definieren. Mehrfarben-Durchflusszytometrie, je nach Gerät, hat den Vorteil von mehr Informationen pro Zelle Bereitstellung, und es kann in kleinen Proben verwendet werden. Bis zu neun Schleimhautlungenbiopsien wurden vereinigt, gewaschen und inkubiert, um den Schleim zu stören. Jede Biopsie wurde dann durch Kollagenase und DNase in einzelnen Vertiefungen einer 48 - Well-Platte verdaut, was zu einer Einzelzellsuspension (Figures 3A - 3B). Im Durchschnitt 1,5 x 10 6 Zellen pro endobronchial Subjekt erhalten wurden, und eine positive Korrelation zwischen der Zellausbeute und die Lebensfähigkeit wurde beobachtet (Abbildung 3C). Die reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen mit niedriger Zellzahlen beobachtet potenziell durch eine höhere Enzymkonzentration pro Zelle erklärt werden könnte, die für die Zellen nicht optimal war. Dies ist eine Herausforderung mit Biopsien sowohl in Größe und in der Zelldichte variiert, wobei einige Biopsien mehr der oberflächlichen Schleimhaut als andere zu probieren. Wie erwartet, durchflusszytometrische Analyse der Suspension Einzelzell ergab , dass im Durchschnitt 12% der Zellen Leukozyten CD45 + waren, während die Mehrzahl der Zellen in der Lunge Schleimhautgewebe unter stationären Bedingungen waren nicht Immunzellen (Abbildung 3D ). Die durchflusszytometrische und IHC Daten korreliert, die die Stärke der Anwendung beider Techniken parallel hervorhebt.
+ Leukozyten identifiziert , die HLA-DR ausgedrückt aber waren negativ für die Abstammungslinie Marker CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14 und CD16 (4A). In dieser kleinen Population von Zellen wurden plasmazytoiden DCs (PDCs), basierend auf ihren Mangel an CD11c Expression und ihre hohe Expression von CD123 und HLA-DR (teal) identifiziert. Unter den CD11c + HLA-DR + lineage-negativen Zellen, die beide CD1c + (Koralle) und CD141 + (kastanienbraun) myeloiden DCs identifiziert wurden (4A). Zur weiteren Charakterisierung dieser Zellen-Untergruppen, deren Expression der Integrin-CD10 3, die E-Cadherin, wichtig bei der Gewebeverankerungs bindet, wurde bewertet. Während alle DC Untergruppen, sowie T-Zellen im peripheren Blut zirkulierenden, CD103 für niedrig oder negativ waren, eine deutliche Anteil von DCs und T in den Lungen des gleichen Individuums gefunden Zellen exprimiert CD103. Dies galt für beide in der bronchoalveolären Lavage sowie in Lungengewebe (4B) Zellen gefunden.
Abbildung 1: Probenahme von menschlichen Lungenschleimhautgewebe. (A) Bronchoskopie wurden an Probanden durchgeführt , um endobronchiale Biopsien von den wichtigsten bronchiale Teilungen einer Lunge mit einer Pinzette zu erhalten. (B) Biopsien wurden entweder in GMA eingebettet für die Gewebe - Schnitte und Immunhistochemie (blau - Diagramm) oder enzymatisch verdaut Einzelzellsuspensionen für die Durchflusszytometrie (pink Diagramm) zu erhalten.m / files / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: die Biopsien in GMA - Harz einbetten. (A) Biopsien aus Bronchoskopien entnommen wurden sofort in Glasfläschchen mit eiskaltem dehydriert Aceton (linkes Feld) übertragen. Nach Fixierung über Nacht wurden die Biopsien mit Methylbenzoat Lösung infiltriert. Biopsien wurden in Einbettungs Kapseln platziert gefüllt mit Lösung Einbettung Polymerisation (Mitte) zu beginnen. Embedded-Biopsien können bei -20 ° C gelagert werden oder kann für die Immunhistochemie-Färbung (rechtes Bild) geschnitten werden. (B) Die schematischen Highlights wichtigsten Schritte im Prozess der Einbettung Biopsien mit GMA. Repräsentative Bilder von geschnittenen Biopsien zeigt die Anwesenheit von CD45 + (C) oder CD1a + Zellen (E) sind im Vergleich zu den jeweiligen Isotypkontrollen (rechte Felder) gezeigt. Die spezifische Markierung wird in rot dargestellt, und die Zellkerne mit Hämatoxylin gegengefärbt sind in blau. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Balkendiagramme zeigen den Median ± Quartilabstand von CD45 + (D) oder CD1a + (F) Zellen pro mm 2 im Epithel oder Lamina propria (n = 20). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Enzymatische Verdauung von Biopsien für die Durchflusszytometrie. (A) Ein von einer Bronchoskopie genommen endobronchiale Biopsie in einer Petrischale. Die Biopsien wurden in HBSS gewaschen, mit DTT behandelt Schleim zu entfernen, eind mit Kollagenase und DNase vor der Entnahme von Einzelzellen für die durchflusszytometrische Analyse verdaut. (B) Die schematische Übersicht über die wichtigsten Verfahren für Zytometrie Biopsien für Fluss zu verdauen. (C) Die Grafik zeigt die Korrelation in Zellausbeute und Lebensfähigkeit, wie durch manuelles Zählen und Trypanblau-Ausschluss bewertet (n = 20). (D) Einzelzellsuspensionen aus dem aufgeschlossenen Biopsie wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert und für die Lebensfähigkeit und die Expression von CD45 (Leukozyten common antigen) bewertet. Die Durchflusszytometrie Plot zeigt eine repräsentative Spender aus 20 gesunden Probanden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Identifizierung von Lungen- dendritische Zellen - Untergruppen in verdaute biopsies. (A) Gating Strategie zur Identifizierung von CD1c + und CD141 + myeloider DCs (MDC) und plasmazytoiden DCs (PDCs) in Lungenschleimhautgewebe. Die Durchflusszytometrie Plots aus einem Vertreter Thema gezeigt. (B) Die Punktdiagramme zeigen die Expression der Integrin - CD103 auf Populationen von DCs in Lungenbiopsien (linkes Bild), Bronchiallavage (Mitte) und dem peripheren Blut (rechtes Bild). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Dokument beschreibt, wie eine detaillierte räumliche und phänotypischen Charakterisierung von Lungengewebe residenten DCs bei gesunden Menschen zu erzeugen, Immunhistochemie und Zytometrie auf endobronchiale Schleimhaut-Biopsien während der Bronchoskopie gesammelt fließen. In den folgenden Absätzen kritischen Schritte in dem Protokoll werden im Detail diskutiert.
Kritische Schritte mit dem Protokoll
Schneiden und Immunhistochemie: Es ist wichtig, die Biopsienblöcke bei -20 ° C zu halten, wenn sie nicht (Schritt 2.5). Warme Blöcke können manchmal weich werden und wird auch nicht Abschnitt. Darüber hinaus werden die Blöcke halten bei -20 ° C Antigenstellen zu erhalten und eine bessere Färbung führen Immunhistochemie.
Sectioning und Immunhistochemie: Wenn die GMA-Embedded-Biopsien sectioning, ist es zweckmäßig, auf 3-4 Behälter von Ammoniakwasser zur Verfügung zu schweben die Abschnitte zu haben. Wenn ein Abschnitt aufgenommen wird, make sicher, dass es mit einem frischen Abschnitt (Schritt 3.4) zu ersetzen. Dies gewährleistet, dass zu dem Zeitpunkt, Abschnitt wieder abgewickelt wird, wird es für etwa die richtige Länge der Zeit (45-90 sec), wurden auf dem Ammoniakwasser schwimmenden, die in der Antigenpräsentation unterstützt und die anschließende Immunhistochemie. Schneiden 2 & mgr; m Abschnitte in dieser Weise ermöglicht es auch für aufeinanderfolgende Schnitte, was bedeutet, daß die gleiche Zelle kann möglicherweise mit unterschiedlichen Zelloberfläche oder intrazellulären Markern gefärbt werden. Es ist wichtig, nicht die Schneidkante der Glas Klinge zu berühren, wenn sectioning, da diese leicht beschädigt wird. Wenn es irgendeine Schmutz von der Klinge ist, die entfernt werden muss, um immer Bürste von der Schneidkante entfernt.
Die enzymatische Verdauung und Durchflusszytometrie: In Gewebeproben, bei denen Immunzellen sind selten, ist es entscheidend, CD45 im Strömungs Färbung Panel umfassen zum ersten Leukozyten (in der Minderheit) identifizieren, bevor eine weitere Identifizierung DCs oder anderen Immunzellen von Interesse. Auch "fluorescence minus eins "oder Isotypkontrollen sind entscheidend für die öffnen, indem die Antikörper-Panels verwendet, Validierung, dass seltene Ereignisse, um sicherzustellen, wahre Signal über Lärm.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung
Schneiden und Immunhistochemie: Für die meisten zellulären Marker von Immunzellen exprimiert wird, kann Tonsillengewebe als gute positive Kontrolle verwendet werden, und Antikörper für die Immunhistochemie, um zu titrieren begrenzte endobronchial Biopsiematerial (Schritt 4) zu verschwenden. Um die dendritischen Prozesse der DCs visualisieren können Gewebe parallel zu dem Epithel werden geschnitten, und nicht senkrecht durch die Schleimhaut 21. Andere Peroxidase Substrate können zusätzlich zu AEC wie DAB verwendet werden, wenn der Benutzer eine andere Substratfarbe erfordert. Das Avidin / Biotin-Enzym-Komplex kann beispielsweise auch substituiert sein, mit alkalischer Phosphatase.
Die enzymatische Verdauung und Durchflusszytometrie: Obwohl das Endeobronchial Biopsien sind klein, die Gewebe-residente Zellen überleben , die enzymatische Verdauung und die Verarbeitung zu einer Einzelzellsuspension für die durchflusszytometrische Analyse (Abbildung 3). Jedoch ist es wichtig, die möglichen Auswirkungen der Enzyme auf die Flecken in der Durchflusszytometrie-Antikörper-Panel verwendet, um zu beurteilen. Um zu testen, ob die enzymatische Verdauung Protokoll abspaltet, Abspaltungen, oder interferiert mit der Antikörperfärbung, leichter zugängliche Zellen, die ähnliche Marker, wie peripheren mononukleären Blutzellen, mit den Verdauungsenzyme (Schritt 6) oder nicht, und sie behandelt werden, anschließend kann, indem sie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und mittels Durchflusszytometrie analysiert (Schritt 7) gefärbt. Wenn die Kollagenase und DNase nicht mit dem Antigen Verfügbarkeit stören, die Flecken mit oder ohne Behandlung der Zellen mit Enzymen sollte ähnlich aussehen. Darüber hinaus kann diese unter Verwendung verifizierenden sowohl Durchflusszytometrie als auch intakte Gewebeschnitten und Immunhistochemie (Figuren 2 - 3) 19.
Einschränkungen der Technik
Bronchoskopie: Die meisten gesunden Menschen tolerieren eine Bronchoskopie gut, und es ist ein Verfahren routinemäßig in die Lunge zu untersuchen und zu probieren, einschließlich endobronchiale Schleimhaut-Biopsien zu sammeln, wie hier beschrieben (Schritt 1). Jedoch Bronchoskopie ist typischerweise kein geeignetes Verfahren zur Längs Abtastung durchzuführen, da es oft als unangenehm empfunden wird, und es ist auch ein zeit- und ressourcenintensive Prozedur. Deshalb bieten endobronchial Biopsien nur eine Momentaufnahme der Immunzellen, die in der Schleimhaut Lungengewebe zu einem Zeitpunkt gegeben, anstatt eine Langzeitstudie von Veränderungen in der Dynamik oder Kinetik.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
Sectioning und Immunhistochemie: Der Vorteil der eher in GMA Einbettung als Paraffin oder durch Kryokonservierungist die überlegene Erhaltung der Morphologie und Antigenen, und eine größere Anzahl von Abschnitten von den kleinen Biopsien, aufgrund der dünnen Abschnitte , die 17 erhalten werden kann.
Die enzymatische Verdauung und Durchflusszytometrie. Durch einzelne Zellen aus kleinen Biopsien zu erhalten, viel mehr Informationen können durch mehrfarbige erreicht werden Durchflusszytometrie.
Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering
Dieses Protokoll beschrieben zwei parallele Verfahren, um die Information zu maximieren, die von kleinen endobronchial Biopsien durch Immunhistochemie kombiniert und Durchflusszytometrie erhalten werden kann. Um die räumliche Verteilung der seltenen Immunzellen zu charakterisieren, wie DCs können Biopsien in GMA eingebettet werden, um dünne Abschnitte für die Immunhistochemie erhalten, während DCs zu unterscheiden von anderen Immunzellen mit ähnlichen Marker, der enzymatische Verdau der Biopsien ermöglicht Mehrfarben-Durchflusszytometrie sein performed. Um die unvoreingenommene Identifizierung von neuartigen Eigenschaften von DCs bei einer Entzündung oder Erkrankung, die automatisierte Analyse von Durchflusszytometrie - Daten ermöglichen kann durch die Anwendung Merkmalsextraktion Algorithmen 22 durchgeführt werden. Zukünftige Anwendungen sind diese einzelnen Zellen für die Zellsortierung spezifischen Zellpopulationen zu sammeln, die für die RNA-Sequenzierung oder transkriptomischen Profilierung verwendet werden kann. Die Identifizierung von DCs in der Lunge ansässig sind, können für das Verständnis der Veränderungen in der Immun Landschaft während der Gesundheit und Krankheit von Bedeutung sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Freiwilligen danken, die klinische Material zu dieser Studie beigetragen haben. Wir sind auch dankbar, dass die Mitarbeiter an der Abteilung für öffentliche Gesundheit und klinische Medizin, Abteilung für Medizin / Pneumologie, Universitätsklinikum, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) für die Sammlung aller klinischen Materials.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an AS-S von der schwedischen Research Council, die schwedische Herz-Lungen-Stiftung, der schwedischen Stiftung für strategische Forschung und dem Karolinska Institutet unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
