Summary
Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.
Abstract
El cordón umbilical humano (UC) y la placenta son fuentes no invasivos, primitivas y abundante de células estromales mesenquimales (MSC) que han ganado cada vez más atención, ya que no plantean preocupaciones éticas o morales. Los métodos actuales para aislar MSCs de UC producen bajas cantidades de células con potencial de proliferación variables. Desde UC es un órgano anatómicamente compleja, diferencias en las propiedades de MSC pueden ser debido a las diferencias en las regiones anatómicas de su aislamiento. En este estudio, hemos diseccionado primero las muestras de cable / placenta en tres regiones anatómicas discretas: UC, Junction cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP). En segundo lugar, dos zonas distintas, forro de cable (CL) y gelatina de Wharton (WJ), se separaron. a continuación, se utilizó la técnica de cultivo de explante para aislar las células de las cuatro fuentes. El tiempo requerido para el cultivo primario de células de los explantes varió dependiendo de la fuente del tejido. Consecuencia de las células se produjo dentro de 3 - 4 days de los explantes CPJ, mientras que se observó crecimiento después de 7 - 10 días y 11 - 14 días de CL / WJ y FP explantes, respectivamente. Las células aisladas eran adherentes a plástico y muestran morfología y de la superficie marcadores fibroblastoides, tales como CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 y, de manera similar a la médula ósea (BM) MSCs derivada de. Sin embargo, la eficiencia de formación de colonias de las células variada, con CPJ-MSCs y WJ-MSC que muestra mayor eficiencia que BM-MSC. MSC de las cuatro fuentes diferencian en adipogénica, condrogénica y linajes osteogénicos, indicando que eran multipotentes. CPJ-MSC diferenciado de manera más eficiente en comparación con otras fuentes de MSC. Estos resultados sugieren que el CPJ es la región anatómica más potente y produce un mayor número de células, con mayores capacidades de proliferación y de auto-renovación in vitro. En conclusión, el análisis comparativo de los MSCs de las cuatro fuentes indicó que CPJ es una fuente más prometedora de las MSC para la terapia celular, regenerative medicina y la ingeniería de tejidos.
Introduction
Las células madre están presentes en diversos órganos y tejidos del cuerpo. Poseen potencial regenerativo y juegan un papel importante en la reparación de tejidos dañados en el cuerpo durante todo el ciclo de la vida humana 1, 2. Esto ha generado un gran interés en las células madre adultas (ASC), sobre todo porque, a diferencia de las células madre embrionarias (CES), el uso de la ASC no plantean dilemas morales y éticos. Varios estudios han reportado el aislamiento de las ASC, tales como células mesenquimales del estroma (MSC); células madre hematopoyéticas (HSCs); y diferentes progenitores, incluyendo diversas fuentes adultas que van desde la médula ósea (BM) para el tejido adiposo (AT) y la pulpa dental 3, 4, 5. Sin embargo, el número de ASC presentes en la mayoría de los nichos adultos es limitado, y su aislamiento generalmente implica un procedimiento invasivo y doloroso con posible donantemorbilidad del sitio. Además, la edad del donante y el estrés ambiental también podrían desempeñar un papel significativo en la determinación de la calidad y la actividad biológica de las células aisladas 6, 7, 8. ASCs también muestran la proliferación limitada y potencial de diferenciación durante el cultivo in vitro.
Para superar estas desventajas de ASC actual, las nuevas fuentes que se hayan intentado aislar células madre. Estos esfuerzos han conducido al aislamiento de células madre a partir de fuentes perinatales, incluyendo sangre del cordón umbilical, el tejido del cordón, la placenta y líquido amniótico 9. Estas fuentes han ganado la atención debido a su fácil disponibilidad y abundante 10, 11, 12, 13. células Además, tejidos perinatales se pueden obtener de forma no invasiva, y madre derivadas de ellos sonmás primitivo que ASCs aislados de fuentes de adultos 14, 15. Ellos se aíslan de los tejidos obtenidos en el nacimiento y se considera que han sufrido alteraciones mínimas en el genoma debido al envejecimiento y ambientales tensiones 16.
Sin embargo, las características reportados de células madre procedentes de fuentes perinatales y su potencial de auto-renovación, así como para diferenciar varían ampliamente 11, 17. Esto podría ser en parte debido al hecho de que el cordón umbilical humano (UC) es un órgano complejo. Se postula que las regiones discretas de tejido perinatal crear nichos específicos responsables de las variaciones y la naturaleza más primitiva de estas células madre en comparación con las ASC derivadas de fuentes no perinatales. Este estudio describe la disección de las muestras de cable / placenta en tres regiones discretas anatómicas: UC, Junction cordón placenta (CPJ), unad placenta fetal (FP). La UC se diseccionó además en dos zonas: forro de cable (CL) y gelatina de Wharton (WJ). Análisis de las células aisladas a partir de CL, WJ, CPJ, y FP demostró que todos ellos exhiben morfología fibroblastoide y expresaron marcadores MSC, pero que diferían en su auto-renovación y potencial de diferenciación. células derivadas de CPJ exhiben una mayor tasa de proliferación y la auto-renovación potencial en comparación con UC y células derivadas de FP, haciéndolos una fuente más prometedora para la terapia celular, medicina regenerativa, y la ingeniería de tejidos.
Protocol
Las muestras (n = 3) se obtuvieron del consentimiento, donantes sanos a través del Beaumont Hospital de BioBanco, Royal Oak, MI y el Hospital Providence, Southfield, MI bajo HIC- (HIC # 2012-101) y IRB- (IRB # 820662- 3), respectivamente, aprobaron protocolos y procesadas según lo aprobado por el IBC (# 2858) de la Universidad de Oakland, Rochester, MI.
Cord 1. Procesamiento umbilical humana, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta y células de aislamiento
- Asépticamente recoger muestras de UC aproximadamente 10 cm de longitud, incluyendo 5 - 6 cm conectados a la CPJ y 3 - 4 cm de FP. Colocar inmediatamente cada muestra en un medio de recipiente de recogida que contiene (DMEM con 4.500 mg / ml de glucosa y solución de antibióticos (0,1% de gentamicina, 0,2% de estreptomicina, y 0,12% de penicilina)) y se almacena a 4 ° C hasta que se transporta al laboratorio por colocándola en hielo en una caja de espuma de poliestireno. Procesar la muestra a 4 ° C dentro de 2 - 4 h de la recogida.
- Colocar la muestra en una placa de Petri de 150 mm siguióhielo en una cabina de bioseguridad. Usando una aguja y una jeringa, enjuagar varias veces con PBS enfriado en hielo para eliminar coágulos de sangre. Asegúrese de que la muestra se mantiene húmeda con PBS durante el proceso y no deje que se seque. Para mantener la esterilidad, manejar la asépticamente muestra usando herramientas de PBS y se quirúrgicos tratados en autoclave largo de procesamiento de la muestra.
- examinar cuidadosamente la muestra para identificar las diferentes regiones anatómicas: UC, el CPJ, y FP. En primer lugar diseccionar la UC. Mantenga el extremo fetal de la UC con pinzas y con cuidado hacer el primer corte justo en la parte superior del CPJ, con un par de tijeras. Hacer que el segundo corte por debajo de la CPJ para separar el CPJ (1,5 - 2,0 cm) de la FP. Coloque la UC separado, CPJ, y FP en placas de Petri separadas para su posterior procesamiento.
- Cortar la UC longitudinalmente con la ayuda de tijeras y fórceps, exponiendo completamente los vasos sanguíneos y que rodea WJ sin perturbar el epitelio.
- Raspe la WJ lejos de los vasos sanguíneos y el epitelio interior del subamnionusando un escalpelo, y luego eliminar los vasos sanguíneos. Asegúrese de recoger cualquier WJ perivascular que queda debajo y alrededor de los vasos sanguíneos, y colocar el WJ recogido en una placa de Petri separada.
- Recoger el tejido restante, forro de cable (CL), en una placa de Petri independiente.
- Después de la separación de los tejidos que representan CL, WJ, CPJ, y FP, reemplace el PBS con 3 - 5 ml de solución de tripsina comercial y cortar por separado cada uno de los tejidos en de 1 a trozos de 2 mm con tijeras.
- Incubar las piezas de tejido en solución de tripsina comercial a 37 ° C durante 30 min en un incubador de CO2 al 5% para la digestión parcial de las muestras. Observe la digestión parcial mediante la visualización de liberación de células utilizando un microscopio de contraste de fase.
- Para las muestras digeridas parcialmente, añadir un volumen igual de medio de cultivo (CM; DMEM con 4.500 mg / ml de glucosa y 2 mM L-glutamina, suplementado con 10% de suero humano / FBS y solución de antibióticos (0,1% de gentamicina, 0,2% de estreptomicina , y 0,12% penicillin)) para neutralizar la solución de tripsina comercial. Transferir el contenido en tubos de centrífuga de 50 ml y dejar que las piezas de tejido parcialmente digeridos se conforman con 3 min.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, incluyendo las células individuales (que no se expanden de manera eficiente), y la placa 15 - 20 trozos de tejido parcialmente digeridos en un 75-cm matraz de cultivo de 2 tejido y añadir 9 ml de CM. Incubar a 37 ° C y no molestar a los matraces de cultivo durante 2 - 3 días para permitir la adherencia de las piezas de tejido.
NOTA: La parte restante de las muestras de tejido parcialmente digeridos puede ser criopreservados para el futuro aislamiento de células. - Después de 3 días de incubación, cambiar el CM y buscar la aparición de derivación de células del explante sobre una base diaria; crecimiento celular debe ser evidente a partir de los explantes adherentes después de 3 - 4 días, 7 - 10 días, y 11 - 14 días de incubación para CPJ, CL / WJ, y FP, respectivamente. Desde este punto en adelante, cambiar el CM después de cada 3 días o comonecesario.
NOTA: El crecimiento celular alcanza el 70% de confluencia 7 - 10 días después de la excrecencia celular inicial a partir del explante. Tenga en cuenta que las piezas de tejido no adherentes no dar lugar a ninguna excrecencia celular hasta que se adhieren al plástico. Se debe tener cuidado para que el frasco no se altera con el fin de evitar el desprendimiento de las piezas de tejido adherentes. Si hay algún piezas flotantes después de los 3 primeros días de cultivo, podrían ser rescatados por su transferencia a un nuevo matraz para fijación.
NOTA: Cuando el crecimiento celular a partir de los explantes de tejido alcanza el 70% de confluencia, deben ser subcultivadas. Como se indicó anteriormente, las MSC de CL / WJ, FP, CPJ y alcanzarán confluencia en 10 - 14 días, 14 - 20 días, y 17 - 24 días, respectivamente. - Para subcultivar células superado de los explantes, disociar las células mediante el uso de 1 - 2 ml de solución de tripsina comercial / 75-cm 2 matraz de cultivo y se incuba a 37 ° C durante 3 min. Neutralizar con 1 - 2 ml de CM y centrifugar 1500 xg durante 3 min. HacerAsegúrese de girar el frasco mientras que la adición de tripsina durante un reparto homogéneo en todas partes.
- NOTA: Las células sedimentadas se consideran paso 0 (P0) y se suspendieron en CM, se contaron, y se subcultivaron a una densidad de siembra de 1 x 10 4 / cm 2 para la amplificación, la caracterización y la crioconservación. Las células exceso puede ser criopreservado en P0.
2. Caracterización de las células aisladas
- La eficiencia de formación de colonias (CFE) de ensayo
- Escudo los platos de 100 mm de Petri (superficie de 60 cm 2) con 0,1% de gelatina durante 30 min y colocarlos en el incubador de CO2 a 37 ° C.
NOTA: Aunque no es necesario, gelatina de recubrimiento mejora la adherencia celular. - Eliminar el exceso de gelatina y sembrar la placa revestida con células P0 a una concentración de 1,63 células / cm2. Añadir 3 ml de CM e incubar en el incubador de CO2 a 37 ° C.
- Supervisar las placas sembradas para crecimiento clonalpor microscopía de luz (ML) y cambiar el medio cada 3 días.
- Después de 10 - 14 días de crecimiento de las células, se lavan las placas de Petri dos veces con PBS y fijar las células en 4% de paraformaldehído durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. - Tinción de las células fijadas con 0,1% de cristal violeta durante 1 h a temperatura ambiente y enjuagar la placa con agua del grifo hasta que la mancha azul no unido se ha ido.
- Contar el número de colonias que constan de al menos 50 células usando LM.
- Escudo los platos de 100 mm de Petri (superficie de 60 cm 2) con 0,1% de gelatina durante 30 min y colocarlos en el incubador de CO2 a 37 ° C.
- La expresión de marcadores de superficie celular
- Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min. Suspender las células en tampón FACS (1x PBS con FBS al 2% y azida sódica al 0,1%).
NOTA: La azida sódica es tóxica. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso.
- Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min. Suspender las células en tampón FACS (1x PBS con FBS al 2% y azida sódica al 0,1%).
- Centrifugar las células teñidas a 670 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 500 l de tampón FACS.
- Analizar las células con anticuerpos teñidas utilizando FACS de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Potencial 3. Diferenciación
- diferenciación adipogénica
- Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min.
- En un incubador de CO2 a 37 ° C, cultivar las células a una concentración de 100.000 células / pocillo de una placa de 6 pocillos que contiene 2 ml de CM.
- Después de 24 h, sustituir la CM con adipogmedio de diferenciación enic (0,5 M isobutil-metilxantina, 1 dexametasona? M, 10? M de insulina, y 200? M de indometacina) e incubar. Cambiar el medio de diferenciación cada 3 días o tan a menudo como sea necesario.
- Después de 3 semanas de incubación, fijar las células con 2 ml de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente y mancha con Oil Red O para detectar la producción de gotitas de lípidos con el fin de analizar para la diferenciación adipogénica.
NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. - Tratar las células fijadas con 60% de isopropanol (2 ml / pocillo de placa de 6 pocillos) durante 5 min.
- Sustituir el isopropanol con 2 ml de Oil Red O mancha (filtro 3 partes Oil Red O mancha y 2 partes de agua destilada), se incuba durante 15-30 min a temperatura ambiente, y lavar 3 - 4 veces con agua del grifo para eliminar cualquier mancha no unido .
- Visualizar las gotas de lípidos rojos manchados, indicativo de linaje celular adipogénica, ucantar LM.
- diferenciación condrogénica
- aislado Cultura células a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y se lavan con PBS.
- Para sedimentar las células para la inducción condrogénica, centrifugar a 250.000 células en un tubo de centrífuga de 15 ml con 2 ml de CM a 11.000 xg durante 8 min. Incubar los gránulos durante la noche a 37 ° C.
- Después de 24 h, reemplazar suavemente el CM con medio condrogénica diferenciación (20 ng TGFß1, 10 insulina ng, 100 nM de dexametasona, y 100? M de ácido ascórbico) sin alterar el sedimento y continuar la incubación. Cambiar el medio de diferenciación cada 3 días o tan a menudo como sea necesario.
- Después de 3 semanas de incubación, fijar las células con 2 ml de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. Cryosection y mancha con 1% de azul de toluidina para examinar la presencia o producción de matriz extracelular con el fin de determinar la diferenciación condrogénica.
NOTA: Paraformaldehyde es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. - Para cryosectioning, lavar suavemente los sedimentos celulares cosechados dos veces con PBS y fijar con 1 ml de paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. - Lavar los pellets dos veces con PBS para eliminar el paraformaldehído y transferir en una solución / PTU sacarosa (1: 2, 20% de sacarosa: OCT). Incubar a temperatura ambiente durante 24 h para permitir que la solución se filtre por completo en los sedimentos celulares; esto permitirá seccionamiento suave.
- La transferencia de las pastillas en los moldes de OCT. Congelar los moldes a -20 ° C durante 4 - 6 h y cryosection aproximadamente 10 - 12 secciones de micras de espesor de los sedimentos celulares usando un criostato para toluidina tinción azul.
- Lavar las criosecciones suavemente con PBS; añadir algunas gotas de 1% azul de toluidina, que cubren las secciones de pellets en la diapositiva completamente; y aumUbaté durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos con PBS varias veces para destain. Eliminar el exceso de tinción por inmersión de la diapositiva en solución de alcohol a base de HCl (95% de alcohol + 0,5 ml de HCl) varias veces hasta que el color azul no unido se ha ido. Montar las secciones teñidas utilizando 100 l de solución para la conservación a largo plazo de las diapositivas de montaje.
NOTA: La tinción con azul de las secciones indica la presencia de glicosaminoglicanos y glicoproteínas y será observable utilizando LM.
- La diferenciación osteogénica
- Una vez más, cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min.
- Subcultivo las células a una concentración de 100.000 células / pocillo de placas de 6 pocillos que contiene 2 ml de CM en un incubador de CO2 a 37 ° C.
- Después de 24 h, reemplace el CM con medio de diferenciación osteogénica (0,1 μ; M dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, y 50 mM de fosfato de ascorbato) y continuar la incubación. Cambiar el medio de diferenciación cada 3 días o tan a menudo como sea necesario.
- Después de 3 semanas de incubación, fijar las células con 2 ml de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente y mancha con rojo de alizarina para detectar la presencia de un depósito de calcio con el fin de determinar la diferenciación osteogénica.
NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. - Lavar suavemente las células fijadas dos veces con agua destilada y se trata con 2% mancha roja de alizarina (2 ml / pocillo en una placa de 6 pocillos) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Retire el exceso de colorante lavando suavemente con agua del grifo para que los depósitos de calcio no desplazan.
- Visualizar los depósitos de calcio teñidas de rojo utilizando LM.
4. cuantitativa Polimerasa de Transcriptasa Inversa ChaEn la reacción (qRT-PCR) Análisis
- Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, lavado, y pellet por centrifugación a 1500 xg durante 3 min para aislar el ARN celular total.
- Lavar las células con PBS para eliminar las trazas de FBS, y luego proceder al aislamiento de ARN usando un kit de purificación de ARN comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Se purifica el ARN total aislado por tratamiento con DNasa a 37 ° C durante 30 min usando un termociclador. Sintetizar ADNc utilizando el kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Preparar reacciones de 10 l de PCR por triplicado en una placa de 96 pocillos, conteniendo cada reacción 5 l de SYBR Green Supermix-PCR; 3 l de agua bidestilada; 0,5! L de cada cebador, directo e inverso; y 1 l de la cDNA diluido (1:10).
- Realizar PCR bajo los siguientes parámetros: 10 min a 98 ° C, seguido por 44 ciclos de 30 s cada uno a 98 y# 176; C, 20 s a 60 ° C, y 30 s a 72 ° C.
- Normalizar la amplificación de los genes diana a los genes de referencia, GAPDH y β-actina; las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1.
5. Análisis estadístico
- Realizar todos los análisis utilizando el software estadístico. Presentar los datos como la media ± SEM. Los resultados con un valor de p (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05) se consideraron estadísticamente significativos.
Representative Results
La disección y el aislamiento de células de cordón umbilical humano Umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta
tejido Perinatal consiste en tres regiones anatómicas discretas. La primera es la UC, que contiene dos arterias y una vena, así como dos zonas distintas: CL (el revestimiento exterior del cable) y WJ (el material gelatinoso que rodea a los vasos sanguíneos dentro del cordón). El segundo es CPJ (la conexión entre el cable y la placenta), y el tercero es FP, que es inmediatamente después de la CPJ (el cable se inserta en la placenta, que está unido a la pared del útero de la madre). El esquemática del protocolo de aislamiento de células a partir de tejido perinatal se representa en la Figura 1. Las cuatro fuentes-CL, WJ, CPJ, y FP-son claramente identificables y se separaron para aislar células de los explantes, tal como se muestra en la Figura 2. Tél aparición del crecimiento de células a partir de cultivos de explantes se controló rutinariamente y grabada por LM. se observaron células fibroblastoides adherentes después de 3-4 días de cultivo de los explantes del CPJ. Las células con morfología similar apareció 7-8, 9-10, y 11-14 días después de cultivar los explantes WJ, Cl, y FP, respectivamente. La derivación de células de los explantes que representan las diversas fuentes (CL, WJ, CPJ, y FP) se representa en la figura 3A. Estas células fueron considerados como P0. Cuando se subcultivaron células P0, que parecían crecer clonal, mostrando una morfología fibroblastoid similar a la de BM-MSC. Sin embargo, ellos exhiben variación en el tiempo de duplicación de la población, que van desde 32 h a 94 h para células de CPJ y FP, como se muestra en la Figura 3B y C. Las células de WJ y CL tuvieron tiempos de duplicación similares medial a CPJ y FP. Un análisis más detallado de las células P0 indicó que también variaron en el CFE, que van desde 16 a 92 colonias.Las células de la CPJ tenía el más alto (92), mientras que las células de PF tenían el más bajo (16) CFE. Las células de CL y WJ tenían valores de CFE de 59 y 80 colonias, respectivamente (Figura 4A) -C. Las células de CL tuvieron valores de CFE similares a la BM-MSC. Estos resultados sugieren que las células CPJ derivados tienen capacidades proliferativas y de auto-renovación más altas.
Immunoprofile de las células aisladas
Las células aisladas de la CL, WJ, CPJ, y FP se investigaron para la expresión de marcadores específicos de célula. Células P3-5 muestran expresión positiva para los marcadores de MSCs tales como CD29, CD44, CD73, CD90, y CD105 (Figura 5A y B). También se sabe que estas células para expresar principal de histocompatibilidad de clase I marcador, HLA-ABC, y no expresan clase marcador II, HLA-DR 3. Los porcentajes de células positivas para el thESE marcadores seleccionados de las cuatro fuentes fueron similares a la expresada por la norma BM-MSC. Sin embargo, las relaciones de las IFM indican que WJ y células derivadas de CPJ son casi similares y son incluso más alta que la CL- y células derivadas de FP (Figura 5C). Curiosamente, a pesar de la variación de los valores de CFE, todas las células de diferentes fuentes expresaron niveles similares de marcadores MSC. Basándose en los resultados de los marcadores de la superficie celular, las células aisladas a partir de las cuatro fuentes fueron considerados como MSCs. El análisis adicional de estas células reveló que también expresan genes pluripotencia, Oct4, NANOG, KLF4, y SOX2, como se muestra en la Figura 5D. El CPJ-MSCs tenía la más alta expresión de marcadores de pluripotencia, seguido por WJ, Cl- y FP-MSC.
Potencial de diferenciación de las MSC aisladas
El estándar de oro para la caracterización de las MSC es su capacidad para diferentiate en múltiples linajes. Nuestros resultados mostraron que las MSC aisladas de todas las fuentes perinatales fácilmente diferenciarse en tipos de células adipogénicas, condrogénicas y osteogénicas. Derivados adipogénica producen gotitas de lípidos que se tiñeron positivamente con Oil Red O, como se muestra en la Figura 6A. Azul de toluidina tinción del derivado condrogénica de las MSC demostró la presencia de proteoglicanos y glicoproteínas que ayudaron en la producción de matriz extracelular (Figura 6B). Derivados osteogénica de las MSC teñidas positivamente con rojo de alizarina indican la presencia de los depósitos de calcio que participan en la mineralización ósea, como se muestra en la Figura 6C.
Como era de esperar, el análisis de la transcripción de las MSC aisladas de todas las fuentes mostró diferenciación trilinaje (Figura 6D -F). Sin embargo, el boteential de diferenciación variarse dependiendo de la fuente de MSCs. derivados adipogénica de WJ-MSC tenían 2 veces mayores niveles de expresión de los genes adipogénicos seleccionados (CEBPβ, FABP4, y PPAR) en comparación con CPJ-MSC. CL- y FP-MSC tenían la menor expresión de estos genes. En el caso de la diferenciación condrogénica, derivados CPJ-MSC expresaron seleccionan genes condrogénicas (SOX9 y COL2) 50 veces mayor que los derivados de WJ y FP-MSC. Similar a la pobre diferenciación adipogénica de CL-MSC, que tenían un menor potencial condrogénica, como es evidente por la expresión de los genes más bajo condrogénicas. CPJ-MSC también mostró el más alto potencial de diferenciación osteogénica, como se indica por las 2 veces mayores niveles de transcripción de genes osteogénicas seleccionadas (COL1, OPN, y OCN). Sin embargo, la expresión de RUNX2 marcador progenitor fue más alta en los derivados osteogénica de WJ-MSC, lo que indica que estas células eran lentos en responder a condiciones de diferenciación. Una vez más, CL-MSC mostró una pobrela diferenciación en el linaje osteogénico. Estos resultados sugieren que CPJ-MSCs y WJ-MSC muestran mayor potencial de diferenciación de CL- y FP-MSC. La CL-MSC tenía el menor potencial de diferenciarse en derivados trilinaje.
Figura 1: Representación esquemática de la Aislamiento de células de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. Inspeccionar la muestra recogida y proceder con la disección. Paso 1. diseccionar y separar la muestra de cable / placenta en tres regiones discretas Manualmente: cordón umbilical (CU), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP). Separar las dos zonas distintas de la UC en forro de cable (CL) y de Wharton Jelly (WJ) usando tijeras y pinzas. Paso 2. Cortar cada uno de los tejidos diseccionados por separado en 1- to trozos de 2 mm con tijeras y digerir parcialmente las piezas. Paso 3. Cultura las piezas de tejido. Paso 4. aislar las células de los explantes por tratamiento con tripsina. Subcultivo y caracterizar las células aisladas. Paso 5. Las células aisladas y caracterizadas pueden amplificarse y usarse para diversas aplicaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La disección y Cultura de explantes de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. Se muestran las tres regiones diferentes anatómicas de la muestra de cordón / placenta: UC (split en la CL y WJ), CPJ, y FP, así como las arterias y venas asociado. CL, WJ, CPJ,y FP se separaron por disección manual para aislar las células de los explantes. Cada una de las regiones disecadas se cortó por separado en pequeños fragmentos y se cultivaron en 75-cm 2 placas usando 9 ml de CM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología de células aisladas de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. (A) excrecencia de la célula a partir de los explantes de CL, WJ, CPJ, y FP, como se visualiza por LM. (B) El subcultivo de las células aisladas a partir de CL, WJ, CPJ, y explantes FP mostró morfología fibroblastoide. La barra de escala representa 100 m (ampliación: 4X). (C) Población tiempo de t duplicarél aislaron células de CL, WJ, CPJ, y FP. BM-MSC se utiliza como un estándar. Las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Colonia formador de eficiencia de las células de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. (A) Crecimiento de las células (P0) aisladas de CL, WJ, CPJ, y FP, en placas a una densidad clonal de 1,63 células / cm2, se visualizaron por LM. (B) Las fotomicrografías de células teñidas con cristal violeta se presentan la capacidad de formación de colonias. (C) de colonias individuales de células ingenio manchadoh cristal violeta. Las barras de escala representan 100 m (ampliación: 4X). (D) Representación gráfica del número de colonias formadas a partir de las células derivadas de CL, WJ, CPJ, y FP. BM-MSC se utiliza como un estándar. Las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de MSC marcadores expresados por las células aisladas de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. (A) Expresión de marcadores de superficie mesenquimales (CD29, CD44, CD73, CD90, y CD105) por las células de CL, WJ, CPJ, y FP, como disuadirminado por citometría de flujo. (B y C) Representación gráfica de los porcentajes de células positivas y los ratios de la mediana de intensidad de fluorescencia (MFI) para los marcadores de superficie mesenquimales seleccionados. ratios de IMF se calcularon dividiendo el valor MFI del marcador (generada por el software basado en la intensidad de fluorescencia de poblaciones de células cerradas) por el valor MFI del isotipo. Las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado. (D) Expresión de los genes de pluripotencia (OCT4, NANOG, Klf4, y SOX2) por las células de CL, WJ, CPJ, y FP, según se determina mediante qRT-PCR. (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). La expresión génica se normalizó a GAPDH y β-actina, y las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: multilinaje La diferenciación de las MSC aisladas del cordón umbilical humana, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. Las células (A) se incubaron en medio de diferenciación adipogénica durante 3 semanas y se tiñeron con Oil Red O, lo que indica la presencia de gotitas de lípidos. (B) Los sedimentos celulares se incubaron en medio de diferenciación condrogénica durante 3 semanas. criosecciones histológico de los cultivos de pellets se tiñeron con azul de toluidina, que muestra la presencia de glicosaminoglicanos. (C) Las células se incubaron en medio de diferenciación osteogénica durante 3 semanas y se tiñeron con rojo de alizarina, mostrando la producción de depósitos de calcio que sugieren la mineralización ósea. Todas las imágenes fueron obtenidas por LM. La barra de escala representa 100 m (ampliación: 4X). BM-MSC nosre utilizado como un estándar. (DF) La expresión de genes seleccionados (CEBPβ, FABP4, y PPAR; SOX9, ACAN, y COL2; y COL1, RUNX2, OPN, y OCN que representa la diferenciación de las MSCs en adipogénica, condrogénica, y linajes osteogénicos, respectivamente), como se determina por análisis de QRT-PCR (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). La expresión génica se normalizó a GAPDH y β-actina, y las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gene | Las secuencias de cebadores | Longitud del producto |
| Oct4 | Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA | 97 |
| Reverse-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG | </ Td> | |
| NANOG | orientadas hacia el AAAGAATCTTCACCTATGCC | 110 |
| GAAGGAAGAGGAGAGACAGT inversa | ||
| KLF4 | orientadas hacia el CGAACCCACACAGGTGAGAA | 94 |
| TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC inversa | ||
| Sox2 | orientadas hacia el TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA | 75 |
| CTGGGGCTCAAACTTCTCTC inversa | ||
| SOX9 | orientadas hacia el AGCGAACGCACATCAAGAC | 85 |
| CTGTAGGCGATCTGTTGGGG inversa | ||
| col2 | orientadas hacia el CTCGTGGCAGAGATGGAGAA | 252 |
| CACCAGGTTCACCAGGATTG inversa | ||
| UNA LATA | orientadas hacia el AGCCTGCGCTCCAATGACT | 103 |
| col1 | orientadas hacia el AAGGTCATGCTGGTCTTGCT | 114 |
| GACCCTGTTCACCTTTTCCA inversa | ||
| RUNX2 | orientadas hacia el TGCTTCATTCGCCTCACAAA | 111 |
| AGTGACCTGCGGAGATTAAC inversa | ||
| OPN | orientadas hacia el CATACAAGGCCATCCCCGTT | 112 |
| TGGGTTTCAGCACTCTGGTC inversa | ||
| OCN | orientadas hacia el TAAACAGTGCTGGAGGCTGG | 191 |
| CTTGGACACAAAGGCTGCAC inversa | ||
| CEBPβ | orientadas hacia el TATAGGCTGGGCTTCCCCTT | 94 |
| AGCTTTCTGGTGTGACTCGG inversa | ||
| FABP4 | orientadas hacia el TTAGATGGGGGTGTCCTGGT | 158 |
| GGTCAACGTCCCTTGGCTTA inversa | ||
| PPAR? | orientadas hacia el GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC | 74 |
| ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG inversa | ||
| GAPDH | orientadas hacia el ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | 101 |
| GCCATCACGCCACAGTTTC inversa | ||
| actina | orientadas hacia el AATCTGGCACCACACCTTCTAC | 170 |
| ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC inversa |
Tabla 1: Lista de Secuencias de los Cebadores humanos utilizados en este estudio.
Discussion
Los recientes avances en la investigación de células madre no sólo mejoró la comprensión de los procesos de desarrollo básicas, pero también proporcionan oportunidades prometedoras para el uso de células madre en biotecnológica, farmacéutica, la terapia celular, medicina regenerativa, y las aplicaciones de ingeniería de tejidos 18, 19, 20. Mientras que los CES pluripotentes aisladas de embriones tempranos son los más prometedores, se enfrentan a desafíos técnicos y dilemas éticos 21, 22, 23. Las células inducidas pluripotentes madre (iPSCs) derivadas de células adultas proporcionan una alternativa, pero ellos también se enfrentan a problemas técnicos y de seguridad similar 23. Además, iPSCs puede no ser genéticamente estable o puede tener cambios genéticos sido sometidos, limitando así su uso terapéutico. Las células madre también se han reportado en una variedad de tis posnatalsues y órganos. Las fuentes más comunes de estos ASCs son la médula ósea, tejido adiposo, y el tejido muscular. Sin embargo, las ASC de fuentes postnatales han potencial de crecimiento y diferenciación 24, 25 limitado. También sufren debido al envejecimiento y la exposición a las tensiones ambientales y por lo tanto no siempre son eficaces para aplicaciones terapéuticas 26, 27, 28. Esto nos y otros ha llevado a buscar nuevas fuentes de células madre que son más ingenuo que ASC.
Hemos investigado las fuentes perinatal para las células madre primitivas como alternativa a la ASC. En este informe, se proporciona un método fiable, robusta y sencilla para aislar MSC humanas a partir de muestras de cable / placenta. En comparación con otras fuentes y métodos utilizados para el aislamiento de las ASC, este método proporciona un método eficiente y no invasiva para el aislamiento de grandes cantidades de higMSC h calidad. Se acentúa aún más el mayor potencial de crecimiento y la diferenciación de las MSC perinatales en comparación con las MSC de fuentes de adultos tales como BM.
La UC unir el feto a la placenta es un órgano grande con regiones anatómicas distintas, incluyendo dos arterias, una vena, Cl, y WJ (tejido que rodea los vasos sanguíneos). Varios estudios han reportado el aislamiento de MSCs de todo el cable, el WJ, o la placenta, con un crecimiento variable y diferenciación potenciales 25, 29. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha investigado de manera eficaz y en comparación las células de diferentes regiones anatómicas de la muestra de cordón / placenta. Ofrecemos aquí un método sistemático y sencillo para la disección de la UC, el CPJ y conectados FP para el aislamiento de MSC. También mostramos un protocolo completo y sencillo para caracterizar y evaluar la calidad de las células aisladas mediante la determinación de su proliferación capabildades, así como su potencial de auto-renovación y diferenciación. Este método es reproducible y produce una gran cantidad de MSCs calidad superior.
Hemos encontrado que la digestión parcial de piezas de tejido de 1-2 mm de tamaño usando una solución de tripsina comercial células reproducible producido a partir de los explantes, mientras que la digestión completa del tejido en células individuales tuvo pobres rendimientos de células aisladas. Sin embargo, un estudio informó que explantes de tejido más grandes de UC aproximadamente 10 mm de tamaño fueron óptimos para el aislamiento de células 30. Por el contrario, otro estudio sugirió que el método de explante de tejido resultó en un ciclo de cultivo más larga y menor rendimiento de las células en comparación con el método de digestión con enzimas de 31. En informes anteriores, el tratamiento de cable de tejidos con colagenasa II y hialuronidasa, por separado o después de la tripsina, se han realizado para aislar células de cordón 32, 33
Mientras que el protocolo para la disección y el aislamiento de las células de los explantes es sencillo, algunos de los pasos que puede llegar a ser un reto. En primer lugar, garantizar la adhesión explante al permitir su fijación a la superficie del matraz de cultivo. Esto se puede facilitar mediante el uso de una pequeña cantidad de medio, solamente cubre las piezas de tejido para las primeras 2 h de cultivo, y después añadiendo cuidadosamente el medio restante. Segundo, limitar el número de explantes a menos del 15 por matraz T75. Demasiado poco espacio entre las piezas o demasiadas piezas por matraz son inhibidora para la excrecencia celular. En tercer lugar, las piezas de tejido que no se adhieren a la superficie del frasco de cultivo después de 3 días de incubación deben ser transferidos a un nuevo matraz para la adherencia y el cultivo. En cuarto lugar, las piezas de tejido a ser cultivadas deben estar libres de restos de células, que inhibe la unión. En quinto lugar, el cultivo de piezas de gran tamaño requiere más medio y no mejora la eficiencia de crecimiento externo celular. Por último, monitorizar los cultivos de explantes de cerca, particularmente después de la aparición del crecimiento de células, como las células pueden rápidamente ser confluente y diferenciar dependiendo de la fuente de tejido. Unas pocas limitaciones de la técnica incluyen la falta de experiencia en la disección de las muestras para separar la CL, WJ, CPJ, y FP; un pequeño tamaño de la muestra, lo que resulta en un rendimiento bajo WJ; y se requieren retraso de procesamiento-las muestras para ser procesados dentro de 2-4 h de la recogida a evIdentificación una pérdida en la recuperación de células.
El estándar de oro para la caracterización de MSCs es la capacidad de adherirse al plástico, formar el fenotipo fibroblástico, y diferenciarse en múltiples linajes. Estos son también criterios utilizados comúnmente para la definición de las MSC como se describe por el ISCT 35. En este estudio, las células aisladas a partir de las cuatro fuentes eran adherentes a plástico y tenía expresión positiva para los marcadores de MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, y CD105), pero la expresión negativa para el marcador CD45 hematopoyéticas. Además, expresaron el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I pero fueron negativos para HLA de clase II. En comparación con el BM-MSC, WJ y células derivadas de CPJ eran más altos. Estos resultados son coherentes con los informes anteriores de UC derivado-MSC 33, 36, 37, 38. Además, nuestros resultados mostraron que CL-, WJ, CPJ-, FP-MSC expresó plurigenes potencia, tales como Oct4, Nanog, y Sox2; Sin embargo, su expresión era más bajo que el de los CES, como se informó anteriormente 39. Estos resultados fueron también de acuerdo con un estudio previo que informó de la expresión de marcadores de pluripotencia en células-perinatales derivado 40. Curiosamente, se observó que la expresión de marcador pluripotente fue mayor en CPJ-MSCs que en las células aisladas a partir de otras fuentes. También se observó que la UC-MSC exhibió un mayor potencial de auto-renovación de BM-MSC 41. Curiosamente, a pesar de la similitud en las características fenotípicas, las células aisladas a partir de las cuatro fuentes tenían valores de CFE variables. Sin embargo, a excepción de FP-MSC, todos ellos tenían mejores valores de CFE que BM-MSC. CPJ-MSCs tenía el valor más alto CFE y tasa de proliferación en comparación con todos los otros MSCs. Además, WJ y CPJ-MSCs muestran potenciales de diferenciación más altas que BM-MSC. CL-MSC mostró la menor diferenciaciónpotencial en los tres linajes (es decir, adipogénica, condrogénica y osteogénica), mientras que CPJ-MSCs tuvo el mayor potencial de diferenciación trilinaje y FP-MSCs muestra el potencial de diferenciación adipogénica menos.
En conclusión, nuestros resultados mostraron que la calidad y cantidad de las MSC aisladas fueron diferentes entre las cuatro fuentes de la muestra de cordón / placenta. CPJ-MSC tenía más capacidad de proliferación y un mayor potencial de auto-renovación. También eran potentes en su diferenciación en los tipos de células trilinaje. Debido a su tiempo bajo duplicación, CPJ-MSC podría ser rápidamente ampliado 1000 veces y se utiliza para el fármaco de alto rendimiento o de cribado biomaterial. Estas células podrían ser una fuente más prometedora para la terapia celular y aplicaciones de la medicina regenerativa.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por la OU-WB ISCRM, Oakland University y Michigan cabeza y Spine Institute. N. Beeravolu y C. McKee recibieron el Premio de Investigación de Graduados Provost de la Universidad de Oakland. Apreciamos S. Bakshi por la revisión del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM with 4,500 mg/mL glucose | Invitrogen | 11995065 | |
| FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
| Insulin | Prospec | CYT-270 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
| Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
| TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
| GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| DNase | Promega | M6101 | |
| iScript kit | Biorad | 1708891 | |
| Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
| Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
| Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
| Crystal violet | Sigma | C3886 | |
| Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
| APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
| APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
| FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
| APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
| FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
| APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
| Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
| Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
| Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
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