Summary
ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。
Abstract
ヒト臍帯（UC）および胎盤は、彼らがどんな倫理的あるいは道徳的な懸念を提起していないので、ますます注目を集めている間葉系間質細胞（MSC）の非侵襲的、原始的と豊富な源です。 UCからMSCを分離するための現在の方法は、可変の増殖ポテンシャルを有する細胞の低量が得られます。 UCは、解剖学的に複雑な器官であるため、MSCの特性の違いは、それらの単離の解剖学的領域の違いに起因し得ます。 UC、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）：本研究では、最初の3つの別個の解剖学的領域にコード/胎盤サンプルを解剖しました。第二に、二つの異なるゾーン、コードライニング（CL）及びウォートンゼリー（WJ）は、分離しました。外植片培養技術は、その後4つの源から細胞を単離するのに使用しました。外植片からの細胞の初代培養に必要な時間は、組織の供給源に依存して変化しました。 4ダ - 細胞の増殖は、3以内に発生しましたCPJ外植片のYS、成長が7の後に観察された - それぞれ、CL / WJ及びFP外植片から14日 - 10日及び11。単離された細胞はプラスチックに付着したと同様に、骨髄（BM）由来のMSCに、例えばCD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105などの線維芽細胞様形態および表面マーカーを、表示しました。しかしながらCPJ-MSCおよびBM-MSCのより高い効率を示すWJ-MSCを用いて、変化した細胞を、コロニー形成効率。 4つのすべてのソースからのMSCは、それらが多能性であったことを示す、脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成系統に分化しました。 CPJ-MSCは、他のMSC源と比較して、より効率的に分化しました。これらの結果は、CPJは、最も強力な解剖学的領域であり、in vitroでのより大きな増殖と自己複製能力を有する細胞の高い数を、生み出すことを示唆しています。結論では、4つのソースからのMSCの比較分析は、CPJは、細胞療法のためのMSCのより有望な源、regenerativであることを示し電子薬、および組織工学。
Introduction
幹細胞は様々な臓器や身体の組織に存在します。彼らは再生能力を有し、人間の生命1、2のスパンを通じて体内に損傷を受けた組織の修復に大きな役割を果たしています。これは、特に以来、成体幹細胞（ASCに）、で大きな関心を生成した胚性幹細胞（ESC）とは異なり、ASCの使用は道徳的、倫理的ジレンマをもたらすことはありません。いくつかの研究は、間葉系間質細胞（MSC）のように、ASCの単離を報告しています。造血幹細胞（HSC）;骨髄（BM）から脂肪組織（AT）および歯髄3、4、5の範囲の様々な大人のソースを含むと異なる前駆体、。しかし、成人のニッチのほとんどに存在するASCの数は限られており、それらの単離は、一般的に可能ドナーと侵襲性と痛みを伴う手順を含みますサイトの罹患率。また、ドナーの年齢や環境ストレスも単離された細胞6、7、8の品質および生物学的活性を決定する上で重要な役割を果たすことができます。 ASCはまた、in vitroでの培養中に限られた増殖と分化能を表示します。
現在のASCのこれらの欠点を克服するために、新しいソースは、幹細胞を単離するために追求されてきました。これらの努力は、臍帯血、臍帯組織、胎盤、羊水9を含む周産期のソースからの幹細胞の単離、につながっています。これらのソースは、その簡単で、豊富な可用性10、11、12、13の注目を集めています。また、周産期組織は、非侵襲的に得られ、それらから誘導された幹細胞ことができます成人源14,15から単離されたASCよりプリミティブ。彼らは、出生時に得られた組織から分離されており、経年変化や環境ストレス16にゲノムに最小限の変化を受けていると考えられます。
しかし、自己複製ならびに分化するように周産期源及びそれらの可能性からの幹細胞の報告された特性は、17、11広く変えます。これは、ヒト臍帯（UC）は複雑な器官であるという事実に一部である可能性があります。私たちは、周産期の組織の別個の領域がバリエーションと非周産期源由来のASCと比較してこれらの幹細胞のより原始的な性質を担当する特定のニッチを作成すると仮定しました。 UC、臍帯胎盤接合（CPJ）：この研究は、三の別個の解剖学的領域にコード/胎盤サンプルの解剖を説明しますD胎児の胎盤（FP）。コードライニング（CL）とウォートンのゼリー（WJ）：UCは、さらに2つのゾーンに解剖しました。 CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞の分析は、それら全てが線維芽細胞様の形態を示し、MSCマーカーを発現することを実証したが、彼らは彼らの自己再生および分化能が異なります。 CPJ由来の細胞は、それらの細胞治療、再生医療、および組織工学のためのより多くの有望なソース作り、UC-とFP由来細胞と比較して高い増殖率と自己複製能を示しました。
Protocol
サンプル（N = 3）IRB＃820662-（ボーモント病院バイオバンク、ロイヤルオーク、MI及びプロビデンス病院、サウスフィールド、MI HIC-下（HIC番号2012から101）とIRB-を通じて同意、健康なドナーから得ました。 3）、それぞれのプロトコルを承認し、オークランド大学、ロチェスター、MIのIBC（＃2858）によって承認されたとして処理します。
1.処理ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤および細胞を単離
- CPJに接続された6センチメートル及び3 - - FPの4センチメートル無菌的には、UCのサンプル5を含む、長さが約10cmを集めます。それにより研究室に搬送されるまで、直ちに4℃で培地（4,500ミリグラム/ mLのグルコース及び抗生物質溶液を含むDMEM（0.1％ゲンタマイシン、0.2％ストレプトマイシン、および0.12％のペニシリン））とストアを含むコレクションカップに各試料を置き発泡スチロールの箱に氷の上に置きます。収集の4時間 - 2内に4℃でサンプルを処理します。
- 150 mmのペトリ皿に試料を置きに保っバイオセーフティキャビネット内の氷。針およびシリンジを用いて、血餅を除去するために、氷冷PBSでそれを複数回リンス。サンプルは、処理中にPBSで濡れ保たれていると、それを乾燥させないようにしてください。無菌性を維持するために、サンプル処理全体のオートクレーブ処理PBSおよび外科ツールを使用して無菌的にサンプルを処理します。
- UC、CPJ、およびFP：慎重に異なる解剖学的領域を識別するためのサンプルを調べます。まず、UCを分析。ピンセットでUCの胎児の端を持ち、慎重にハサミを使用してちょうどCPJの上部にある最初のカットを作ります。 FPから - （2.0センチメートル1.5）CPJ以下第二カットCPJを分離することを可能にします。さらなる処理のために別々のペトリ皿に分離UC、CPJ、及びFPを配置します。
- 完全に血管を露出し、上皮を乱すことなくWJを取り囲む、はさみと鉗子の助けを借りて、長手方向にUCを切ります。
- 血管やsubamnionの内側の上皮から離れWJをこすりメスを使用して、血管を削除します。下の血管の周りに残っている血管周囲のWJを収集し、別のペトリ皿に収集したWJを配置するようにしてください。
- 別々のペトリ皿に、残りの組織、臍帯ライニング（CL）を集めます。
- CL、WJ、CPJ、及びFPを表す組織を分離した後、3を含むPBSを置き換える - 商業トリプシン溶液5mLと別々にハサミを使用して、1〜2mmの断片に組織のそれぞれを切断しました。
- サンプルの部分消化のための5％CO 2インキュベーター内で37℃で30分間商業トリプシン溶液中に組織片をインキュベートします。位相差顕微鏡を用いて細胞の放出を可視化することにより部分消化を観察します。
- 10％ヒト血清/ FBSおよび抗生物質溶液（0.1％ゲンタマイシン、0.2％ストレプトマイシンを補充した4,500ミリグラム/ mLのグルコースおよび2mMのL-グルタミンを含むDMEM;部分的に消化した試料に、培養培地（CMの等量を追加、及び0.12％Penicillin））、市販のトリプシン溶液を中和します。 50mLの遠心分離管にコンテンツを転送し、部分的に消化された組織片を3分間沈降させ。
- 注意深く単一細胞（それらは効率的に展開していない）を含む、上清を吸引し、15プレート- 75-cm 2の組織培養フラスコに20部分的に消化された組織片とCMの9 mLを加え。 37℃でインキュベートし、2培養フラスコを妨げない - 組織片の付着を可能にするために3日間。
注：部分的に消化された組織サンプルの残りの部分は、細胞の将来の単離のために凍結保存することができます。 - インキュベーションの3日後、CMを変更し、日常的に外植片からの細胞の成長の様子を探して。それぞれ、CPJ、CL / WJ、及びFPのインキュベーションの14日 - 4日、7 - - 10日、及び11細胞増殖は、3後に接着外植片から明らかです。この時点以降、3日ごとに後、またはとしてCMを変更必要に応じて。
注： - 10日植片からの最初の細胞成長後に細胞増殖は7 70％コンフルエンスに達しました。彼らはプラスチックに付着するまで、非付着性組織片は、任意の細胞成長を生じさせないことに注意してください。フラスコに付着組織片の剥離を避けるために邪魔されないように注意しなければなりません。培養の最初の3日後に任意の浮動部分がある場合は、それらを取り付けるための新しいフラスコにそれらを転送することによって救出することができます。
注：組織外植片から細胞増殖を70％コンフルエンスに達したとき、彼らは継代培養されなければなりません。それぞれ、24日 - 14日、14 - - 20日、および17以上のように、CL / WJ、FP、CPJからMSCは10でコンフルエンスに到達します。 - 外植片から脱却する細胞を継代培養するために、1使用して細胞を解離-商業トリプシン溶液/ 75-cm 2の培養フラスコの2ミリリットルを、3分間37℃でインキュベートします。 3分間CM遠心1500×gでの2mLの - 1で中和します。作りますでも全体に拡散するため、トリプシンを添加しながら、フラスコを回転させるようにしてください。
- 注：ペレット化した細胞は、継代0（P0）と見なされると、CM中に懸濁し、計数し、そして増幅、特徴付け、および凍結保存のために1×10 4個 / cm 2の播種密度で継代培養します。過剰の細胞は、P0で凍結保存することができます。
2.単離された細胞の特徴付け
- コロニー形成効率（CFE）アッセイ
- 30分間、0.1％ゼラチンでコート100 mmのペトリ皿（60センチメートル2の表面積）と37℃でCO 2インキュベーターに置きます。
注：必要ではないが、ゼラチンコート細胞接着を向上させることができます。 - 過剰のゼラチンを除去及び/ cm 2で1.63個の細胞の濃度で、P0細胞で被覆したプレートに播種。 CMの3 mLを加え、37℃でCO 2インキュベーター中でインキュベートします。
- クローンの成長のために播種したプレートを監視光学顕微鏡（LM）によると、3日ごとに培地を変更します。
- 10後 - 細胞増殖の14日間、PBSで2回ペトリ皿を洗浄し、室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 - 室温で1時間、0.1％クリスタルバイオレットで固定した細胞を染色し、結合していない青色染色がなくなるまで水道水でプレートをすすぎます。
- LMを用いて、少なくとも50個の細胞で構成されるコロニーの数を数えます。
- 30分間、0.1％ゼラチンでコート100 mmのペトリ皿（60センチメートル2の表面積）と37℃でCO 2インキュベーターに置きます。
- 細胞表面マーカーの発現
- 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。 （2％FBSおよび0.1％アジ化ナトリウムを含む1×PBS）FACS緩衝液で細胞を停止します。
注：アジ化ナトリウムは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。
- 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。 （2％FBSおよび0.1％アジ化ナトリウムを含む1×PBS）FACS緩衝液で細胞を停止します。
- 、5分間670×gで染色された細胞を遠心分離し、上清を吸引し、FACS緩衝液500μLに細胞を再懸濁。
- 製造業者のプロトコルに従ってFACSを用いて抗体染色細胞を分析します。
3.分化能
- 脂肪細胞への分化
- 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。
- 37℃でCO 2インキュベーター中で、培養100,000細胞の濃度で細胞/ウェルのCMの2 mLを含む6ウェルプレート。
- 24時間後、adipogでCMを置き換えますENIC分化培地（0.5μMイソブチル - メチルキサンチン、1μMのデキサメタゾン、10μMのインスリン、および200μMインドメタシン）とインキュベートします。 3日ごとに分化培地を変更するか、できるだけ頻繁に必要としていました。
- インキュベーションの3週間後、脂肪細胞への分化のために分析するために、脂質滴の産生を検出するためにオイルレッドOを用いて室温と染色で30分間、ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド2mLで細胞を固定。
注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 - 5分間、60％イソプロパノール（6ウェルプレートの2ミリリットル/ウェル）で固定した細胞を治療します。
- オイルレッドO染色の2mLの（フィルタ3部のオイルレッドO染色および2部の蒸留水）とイソプロパノールを交換し、室温で15-30分間インキュベートし、そして3洗浄 - 未結合の汚れを除去するために、水道水で4回。
- 脂肪生成細胞系譜を示す赤に染色された脂肪滴を、可視化、ULMを歌います。
- 軟骨形成分化
- 70％のコンフルエンスまで培養単離された細胞は、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そしてPBSで洗浄します。
- 8分間、11,000×gで軟骨誘導、遠心機CMの2 mlを15 mL遠心管中250,000細胞のための細胞をペレット化します。 37°Cで一晩ペレットをインキュベートします。
- 24時間後、穏やかにペレットを乱すことなく、軟骨形成分化培地（20 ngのTGFβ1、10ngのインスリン、100nMのデキサメタゾン、および100μMアスコルビン酸）を用いてCMを交換し、インキュベーションを続けます。 3日ごとに分化培地を変更するか、できるだけ頻繁に必要としていました。
- インキュベーションの3週間後、室温で30分間、ウェル当たり4％パラホルムアルデヒド2mLで細胞を固定。 1％トルイジンブルーで染色凍結切片とは、軟骨形成分化を決定するために、細胞外マトリックスの存在または生産を調べました。
注：Paのraformaldehydeは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 - 凍結切片化のために、穏やかにPBSで2回採取し、細胞ペレットを洗浄し、室温で30分間、4％パラホルムアルデヒド1mLで固定します。
注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋、目の摩耗を身に着けていることによって、注意を練習してください。 - パラホルムアルデヒドを除去し、スクロース/ octの溶液に転送するためにPBSで2回ペレットを洗浄（1：2、20％スクロース：OCT）。溶液が完全に細胞ペレットに浸透することを可能にするために室温で24時間インキュベートします。これは、スムーズな区分けが可能になります。
- 10月の金型にペレットを転送します。 6時間および凍結切片約10 - - トルイジンブルー染色のためにクライオスタットを用いて細胞ペレットの12ミクロン厚の切片4 -20℃で金型を凍結します。
- PBSで穏やかに凍結切片を洗浄します。完全スライド上ペレットセクションを覆う、1％トルイジンブルー染色の数滴を加えます。そして、株式会社室温で1時間ubate。
- 脱色するPBS複数回スライドを洗浄します。 （95％のHClのアルコール+ 0.5 mL）に複数回結合していない青色がなくなるまでHClをベースアルコール溶液中にスライドを浸漬することにより、過剰な汚れを取り除きます。スライドの長期保存のための取付溶液の100μLを用いて染色した切片をマウント。
注：セクションの青い染色は、グリコサミノグリカンおよび糖タンパク質の存在を示すとLMを用いて観察可能であろう。
- 骨形成分化
- 再び、70％コンフルエンスまで培養単離された細胞を、商業的なトリプシン溶液を用いて解離し、そして3分間、1500×gで遠心分離することにより洗浄し、ペレット。
- 100,000細胞/ウェルの37℃でCO 2インキュベーター内でCMの2 mLを含む6ウェルプレートの濃度で細胞を継代培養。
- 24時間後に、骨形成分化培地でCMを交換（0.1μ; Mデキサメタゾン、βグリセロリン酸10μM、及び50μMアスコルビン酸リン酸）とのインキュベーションを続けます。 3日ごとに分化培地を変更するか、できるだけ頻繁に必要としていました。
- インキュベーションの3週間後に、骨形成分化を決定するために、カルシウム沈着の存在を検出する室温とアリザリンレッドで染色で30分間、ウェルあたり2mLの4％のパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
注：パラホルムアルデヒドは有毒です。使用中に手袋やメガネを身に着けていることによって、注意を練習してください。 - 穏やかに蒸留水で2回固定した細胞を洗浄し、暗所で室温で1時間2％のアリザリンレッド染色（6ウェルプレート中の2 mLの/ウェル）を用いて治療します。
- カルシウム堆積物が剥がれないように穏やかに水道水で洗浄することにより過剰の染色を除去。
- LMを用いて赤色に染色されたカルシウム沈着を可視化します。
4.定量的逆転写酵素ポリメラーゼチャ反応（QRT-PCR）分析に
- 培養70％コンフルエンスに単離された細胞は、全細胞RNAを単離するために3分間1500×gで遠心分離することによって商業トリプシン溶液、洗浄、及びペレットと解離します。
- FBSの痕跡を除去し、次いで製造業者の指示に従って、商業RNA精製キットを用いてRNA単離に進むためにPBSで細胞を洗浄します。
- サーモサイクラーを用いて37℃で30分間DNaseで処理することによって単離された全RNAを精製します。製造業者の指示に従って市販のキットを用いてcDNAを合成します。
- SYBRグリーンPCRスーパーミックスの5μLを含む各反応を、96ウェルプレートに三重10μLPCR反応を準備します。二重蒸留水の3μL;各プライマーの0.5μL、フォワードおよびリバース。希釈（1:10）cDNAの1μL。
- 以下のパラメータの下でPCRを行う：30秒毎の44サイクル、続いて98℃で10分間、98＆に＃176; C、60°Cで20秒、及び72℃で30秒。
- 参照遺伝子、GAPDH、およびβアクチンに対する標的遺伝子の増幅を正規化します。プライマー配列を表1に列挙されています。
5.統計解析
- 統計ソフトウェアを使用してすべての分析を行います。平均±SEMとしてデータを提示します。 p値（0.05≤** P≤0.01と* P）との結果は統計的に有意であると考えられました。
Representative Results
解剖およびヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの細胞の単離
周産期の組織は3つの個別の解剖学的領域から構成されています。 CL（紐の外側ライニング）とWJ（臍帯内部の血管を取り囲むゼリー状物質）：最初は、二つの動脈と一つ静脈、ならびに二つの別個のゾーンを含む、UCです。第二は、CPJ（臍帯および胎盤の間の接続）であり、第3は、（コードが母親の子宮壁に取り付けられた胎盤に挿入）CPJ直後であるFP、です。周産期組織からの細胞の単離プロトコールの概略を図1に示されています。 4つのソース-CL、WJ、CPJ、そして明確に識別FPは、であり、 図2に示すように、外植片から細胞を単離するために分離しました。 T外植片培養物からの細胞伸長の彼の外観は、定期的に監視し、LMによって記録されました。接着性線維芽細胞は、CPJの外植片を培養の3~4日後に観察されました。同様の形態を有する細胞は、それぞれ、WJ、CL、及びFP外植片を培養した後、7-8、9-10、および11-14日目に見えました。様々なソース（CL、WJ、CPJ、及びFP）を表す外植片からの細胞の成長は、図3Aに示されています。これらの細胞は、P0としました。 P0細胞を継代培養したところ、BM-MSCのと同様の線維芽細胞様の形態を示す、クローンに成長するように見えました。しかし、それらは、 図3B及びCに示すように、32時間からCPJ及びFPからの細胞のために94時間の範囲、集団倍加時間の変化を示しました。 WJとCLからの細胞は、CPJとFPと同様の倍加時間の内側を持っていました。 P0細胞のさらなる分析は、彼らはまた、16から92個のコロニーの範囲、CFEに変化することを示しました。FP細胞が最低（16）CFEを有していたCPJからの細胞は、最高（92）を有していました。 CL及びWJからの細胞（ 図4A〜C）は、それぞれ、59および80個のコロニーのCFE値を有していました。 CLからの細胞は、BM-MSCのに似CFE値を有していました。これらの結果は、CPJ由来細胞が高い増殖と自己複製能力を有することを示唆しています。
単離された細胞のImmunoprofile
CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞は、細胞特異的マーカーの発現について調べました。 P3-5細胞は、CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105（ 図5AおよびB）としてのMSCマーカーについて陽性発現を示しました。これらの細胞はまた、私はマーカ主要組織適合性クラス、HLA-ABCを発現することが知られており、クラスIIマーカー、HLA-DR 3を発現しません。目のための陽性細胞の百分率4つのすべてのソースから選択されたマーカーをESE標準BM-MSCので表さものと同様でした。しかし、MFI比はWJ-とCPJ由来細胞がほぼ類似しており、CL-とFP由来細胞（ 図5C）よりも高いことを示しています。興味深いことに、CFE値を変化させるにもかかわらず、異なるソースからのすべての細胞は、MSCマーカーの類似のレベルを発現しました。細胞表面マーカーの結果に基づいて、4つのすべての供給源から単離された細胞を、MSCのとみなしました。これらの細胞のさらなる分析は、 図5Dに示すように、それらはまた、多能性遺伝子、OCT4、NANOG、KLF4、およびSOX2を発現することが明らかになりました。 CPJ-MSCはWJ-、CL-とFP-MSCの続く多能性マーカーの最も高い発現を、持っていました。
孤立MSCの分化能
MSCを特徴付けるためのゴールドスタンダードは、diffeする能力であります複数の系統にrentiate。我々の結果は、周産期源の全てから単離されたMSCが容易脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成性細胞型に分化することが示されました。脂肪生成誘導体は、図6（a）に示すように正、オイルレッドOで染色した脂肪滴を生成しました。 MSCの軟骨形成誘導体のトルイジンブルー染色は、細胞外マトリックス（ 図6B）の産生を支援プロテオグリカンおよび糖タンパク質の存在を実証しました。 図6Cに示すように、積極的にアリザリンレッドで染色されたMSCの骨形成性誘導体としては、骨の石灰化に関与するカルシウム沈着物の存在を示します。
予想されたように、すべてのソースから単離されたMSCの転写分析はtrilineage分化（ 図6D -F）を示しました。しかし、ポット分化のentialは、MSCのソースに依存して変化しました。 WJ-MSCの脂肪生成誘導体はCPJ-のMSCに比べ選択脂肪生成遺伝子（CEBPβ、FABP4、およびPPARγ）の2倍より高い発現レベルを有していました。 CL-とFP-MSCは、これらの遺伝子の最低の表現を持っていました。軟骨形成分化の場合には、CPJ-MSCの誘導体はWJ-とFP-MSCの誘導体よりも50倍高い選択軟骨の遺伝子（SOX9およびCOL2）を発現しました。 CL-MSCの乏しい脂肪生成分化と同様に、それらは軟骨の遺伝子の最も低い発現によって明らかなように、低い軟骨形成潜在能力を有していました。選択された骨形成遺伝子（COL1、OPN、およびOCN）の2倍より高い転写レベルによって示されるようにCPJ-MSCはまた、最も高い骨形成分化能を示しました。しかしながら、前駆細胞マーカーRUNX2の発現は、これらの細胞は、分化条件に応答における遅かったことを示し、WJ-MSCの骨原性誘導体で最も高かったです。ここでも、CL-MSCは、貧しい示しました。骨形成系列への分化。これらの結果は、CPJ-MSCおよびWJ-MSCはCL-とFP-MSCのより大きな分化能を表示することを示唆しています。 CL-MSCはtrilineage誘導体に分化する最低の可能性がありました。
図1： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの細胞の単離の概略。収集したサンプルを検査し、解剖を進めます。臍帯（UC）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）： ステップ1.手動3つの離散領域にコード/胎盤サンプルを分析し、分離します。ハサミとピンセットを用いて臍帯ライニング（CL）にUC 2つの異なるゾーンを分離し、ウォートンゼリー（WJ）。 ステップ2。 1- Tに別々に解剖した組織の各々をカットO 2 mmの片は、はさみを使用して、部分的に片を消化します。 ステップ3.文化に組織片。 ステップ4は、トリプシン処理により、外植片から細胞を分離します。単離された細胞を継代培養し、特徴づけます。 ステップ5.単離および特徴づけ細胞が増幅され、様々な用途に使用することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの解離及び外植片の培養。図示コード/胎盤試料の三つの異なる解剖学的領域である：UC（CLおよびWJに分割）、CPJ、およびFP、ならびに関連する動脈および静脈。 CL、WJ、CPJ、そしてFPは、外植片から細胞を単離するために手動切開により分離しました。解剖領域の各々は、別々にCMの9 mLのを使用して2枚のプレートを小さな断片に切断し、75-CM中で培養しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤から単離された細胞の形態。 LMにより可視化（A）CL、WJ、CPJ、及びFPの外植片からの細胞成長、。 CL、WJ、CPJ、及びFP外植片から単離された細胞の（B）継代培養は、線維芽細胞様形態を示しました。スケールバーは100μmの（：4X倍率）を表しています。 Tの倍加時間（C）人口彼はCL、WJ、CPJ、およびFPから細胞を単離しました。 BM-MSCは、標準として用いました。エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表す（** P≤0.05≤0.01 * P）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： コロニー形成ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤からの細胞の効率。 1.63細胞/ cm 2のクローン密度で播種CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞（P0）の（A）の成長は、LMによって可視化しました。コロニー形成能力を表示バイオレット（B）結晶で染色された細胞の顕微鏡写真。 （C）細胞を染色したウィットの単一コロニーHクリスタルバイオレット。スケールバーは100μmで（：4X倍率）を示します。 （D）CL、WJ、CPJ、及びFPに由来する細胞から形成されたコロニーの数のグラフ表示。 BM-MSCは、標準として用いました。エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表す（** P≤0.05≤0.01 * P）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤から単離された細胞によって発現MSCマーカーの分析。 （A）CL、WJ、CPJ、及びFPから細胞による間葉表面マーカー（CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105）の発現、抑止としてフローサイトメトリーによって採掘。 （B及びC）陽性細胞のパーセンテージおよび選択された間葉表面マーカーについてのメジアン蛍光強度（MFI）比のグラフ表示。 MFI比はアイソタイプのMFI値によって（ゲーティングされた細胞集団の蛍光強度に基づいてソフトウェアによって生成される）マーカーのMFI値を割ることにより計算しました。エラーバーは三連の測定の平均値の標準誤差を表します。 QRT-PCRにより決定される（D）CL、WJ、CPJ、及びFPから細胞による多能性遺伝子（OCT4、NANOG、KLF4、およびSOX2）の発現、。 （** P≤0.01と* P≤0.05）。遺伝子発現は、GAPDHおよびβアクチンに対して正規化し、エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： ヒト臍帯、臍帯胎盤ジャンクション、および胎児胎盤から単離さMSCの多系列分化。 （A）細胞は、脂質滴の存在を示す、3週間、脂肪生成分化培地中でインキュベートし、オイルレッドOで染色しました。 （B）細胞ペレットを3週間にわたって軟骨形成分化培地中でインキュベートしました。ペレット培養物の組織学的凍結切片は、グリコサミノグリカンの存在を表示し、トルイジンブルーで染色しました。 （C）細胞は、骨の石灰化を示唆しているカルシウム沈着物の生産を表示する、3週間、骨形成分化培地中でインキュベートし、アリザリンレッドで染色しました。すべての画像はLMによって得られました。スケールバーは100μmの（：4X倍率）を表しています。 BM-MSCは、我々標準として再利用。選択された遺伝子の（DF）式（CEBPβ、FABP4、およびPPARγ、SOX9、ACAN、及びCOL2;それぞれとCOL1、RUNX2、OPN、およびOCN脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成系統へのMSCの分化を表す）、決定されQRT-PCR分析によって（** P≤0.01 * P≤0.05）。遺伝子発現は、GAPDHおよびβアクチンに対して正規化し、エラーバーは三重測定の平均の標準誤差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 遺伝子 | プライマー配列 | 製品長さ |
| OCT4 | フォワード-CCCCTGGTGCCGTGAA | 97 |
| 逆GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG | </ TD> | |
| NANOG | 将来をAAAGAATCTTCACCTATGCC | 110 |
| 逆GAAGGAAGAGGAGAGACAGT | ||
| KLF4 | 将来をCGAACCCACACAGGTGAGAA | 94 |
| 逆TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC | ||
| SOX2 | 将来をTTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA | 75 |
| 逆CTGGGGCTCAAACTTCTCTC | ||
| SOX9 | 将来をAGCGAACGCACATCAAGAC | 85 |
| 逆CTGTAGGCGATCTGTTGGGG | ||
| COL2 | 将来をCTCGTGGCAGAGATGGAGAA | 252 |
| 逆CACCAGGTTCACCAGGATTG | ||
| ACAN | 将来をAGCCTGCGCTCCAATGACT | 103 |
| COL1 | 将来をAAGGTCATGCTGGTCTTGCT | 114 |
| 逆GACCCTGTTCACCTTTTCCA | ||
| RUNX2 | 将来をTGCTTCATTCGCCTCACAAA | 111 |
| 逆AGTGACCTGCGGAGATTAAC | ||
| OPN | 将来をCATACAAGGCCATCCCCGTT | 112 |
| 逆TGGGTTTCAGCACTCTGGTC | ||
| OCN | 将来をTAAACAGTGCTGGAGGCTGG | 191 |
| 逆CTTGGACACAAAGGCTGCAC | ||
| CEBPβ | 将来をTATAGGCTGGGCTTCCCCTT | 94 |
| 逆AGCTTTCTGGTGTGACTCGG | ||
| FABP4 | 将来をTTAGATGGGGGTGTCCTGGT | 158 |
| 逆GGTCAACGTCCCTTGGCTTA | ||
| PPARγ | 将来をGGCTTCATGACAAGGGAGTTTC | 74 |
| 逆ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG | ||
| GAPDH | 将来をACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | 101 |
| 逆GCCATCACGCCACAGTTTC | ||
| アクチン | 将来をAATCTGGCACCACACCTTCTAC | 170 |
| 逆ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC |
表1：本研究で用いたヒトプライマー配列のリスト。
Discussion
幹細胞研究の最近の進歩は、基本的な開発プロセスの理解を改善だけでなく、バイオテクノロジー、製薬、細胞治療、再生医療、および組織工学アプリケーション18、19、20における幹細胞の使用のための有望な機会を提供していないだけ。初期胚から分離された多能性ESCのが最も有望であるが、それらは技術的な課題と倫理的ジレンマ21、22、23に直面しています。成体細胞由来誘導多能性幹細胞（性IPSC）は、代替手段を提供しますが、彼らはあまりにも同様の技術的および安全性の問題に直面している23。さらに、性IPSCは、遺伝的に安定ではないかもしれないか、従って、それらの治療的使用を制限し、遺伝的変化を受けていてもよいです。幹細胞は、出生後のTISの様々な報告されています訴えると臓器。これらのASCの最も一般的な発生源は、骨髄、脂肪、および筋肉組織です。しかし、出生後の発生源からのASCは、増殖および分化の可能性24、25が限られています。彼らはまた、経年や環境ストレスへの暴露に苦しむので、常に治療への応用26、27、28のために有効ではありません。これは、ASCをよりナイーブである幹細胞の新しいソースを検索するために、私たちと他の人をリードしてきました。
当社は、ASCをの代替として原始的な幹細胞の周産期情報源を調査しました。本稿では、コード/胎盤サンプルからヒトMSCを単離するために、信頼性の高い堅牢、かつ簡単な方法を提供します。 ASCの単離のために使用される他の供給源および方法と比較して、この方法は、HIGを大量に単離するための効率的かつ非侵襲的な方法を提供しますH-品質のMSC。それは、さらに、BMとして大人のソースからのMSCに比べて周産期のMSCのより高い増殖および分化の可能性を強調する。
胎盤に胎児を取り付けるUCは、二つの動脈、静脈、CL、及びWJ（血管の周囲の組織）を含む別個の解剖学的領域と大きい器官です。いくつかの研究は、可変の増殖および分化ポテンシャル25で、29の全体のコードからのMSCの単離、WJ、または胎盤を報告しています。それにもかかわらず、現在までに、何の研究では、効果的に調査しないとコード/胎盤試料の異なる解剖学的領域から細胞を比較しました。ここではMSCの単離のためのUC、CPJ、および接続されたFPの解剖のための体系的かつ簡単な方法を提供します。また、その増殖のcapabilを決定することによって、特徴づけ、単離された細胞の品質を評価するために、包括的かつシンプルなプロトコルを表示しますities、並びにそれらの自己複製と分化ポテンシャル。この方法は、再現性があり、かつ、優れた品質のMSCの大規模な量を生み出します。
我々は、単一の細胞内への組織の完全な消化が単離された細胞の低い収率を持っていたのに対し、市販のトリプシン溶液を使用して、サイズが組織片の部分消化1〜2ミリメートルの再現性、外植片から細胞をもたらしたことがわかりました。しかし、ある研究は、UCの大きな組織外植片のサイズの約10mmの細胞の単離30のために最適であったことを報告しました。逆に、別の研究では、組織外植片法は、酵素消化法31と比較してより長い培養周期と細胞のより低い収率をもたらしたことを示唆しました。以前の報告では、コードの処理は、コラゲナーゼIIおよびヒアルロニダーゼ、別々に、またはトリプシンを以下で組織、臍帯細胞32、33を単離するために行われてきました
外植片からの細胞の解離および分離するためのプロトコルは簡単であるが、ステップのいくつかは、困難になるかもしれません。まず、培養フラスコの表面への付着を可能にすることによって、外植片の付着を確実にします。これは培養の最初の2時間のために組織片をカバーする、媒体の少量を使用し、次いで注意深く残りの培地を添加することによって容易にすることができます。 Second、T75フラスコあたり15未満に外植片の数を制限します。フラスコあたりピースまたはあまりにも多くの作品の間にあまりにも小さなスペースでは、細胞成長のために抑制されています。インキュベーションの3日後に培養フラスコの表面に付着しない第三に、組織片を遵守し、培養のために新しいフラスコに転送する必要があります。第四に、培養される組織片は、添付ファイルを阻害する細胞破片の自由でなければなりません。第五に、大部分の培養は、より多くのメディアを必要とし、細胞の伸長効率を改善しません。細胞が急速にコンフルエントになり、組織源に応じて区別できるように最後に、特に細胞成長の出現後に、密接に外植片培養物をモニターします。技術のいくつかの制限がCL、WJ、CPJ、及びFPを分離するために試料を解剖の専門知識の欠如が挙げられます。低WJの収率で得られたサンプルサイズが小さいです、。そして遅延加工試料をAVOする収集の2~4時間以内に処理する必要がありますID細胞回復の損失。
MSCの特徴づけのためのゴールドスタンダードは、プラスチックに付着線維芽細胞の表現型を形成し、複数の系統に分化する能力です。これらはまた、ISCT 35によって記載されるようにMSCを定義するための一般的に使用される基準です。本研究では、4つ全ての供給源から単離された細胞はプラスチックに付着しており、MSCマーカー（CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105）造血マーカーCD45について陰性発現について陽性発現が認められました。加えて、それらは、ヒト白血球抗原（HLA）クラスIを発現するがHLAクラスIIについて陰性でした。 BM-MSCは、WJ-とCPJ由来細胞に比べて高かったです。これらの結果は、UC由来MSC 33、36、37、38の以前の報告と一致しています。加えて、我々の結果は、CL-、WJ-、CPJ-は、FP-MSCは多能発現することを示しましたそのようなOCT4、NANOG、およびSOX2として効力遺伝子;以前に報告されたように39しかし、彼らの表現は、ESCのそれよりも低かったです。これらの結果は、周産期由来細胞40における多能性マーカーの発現を報告した以前の研究と一致してもいました。興味深いことに、それは多能性マーカーの発現は、他の供給源から単離された細胞におけるよりCPJ-MSCの中に高かったことが観察されました。また、UC-MSCがBM-MSCの41を上回る自己複製能を示したことに気づきました。興味深いことに、表現型の特徴の類似性にもかかわらず4つの供給源から単離された細胞は、可変CFE値を有していました。しかし、FP-MSCを除き、それらはすべてBM-MSCのより良いCFE値を有していました。他のすべてのMSCと比較するとCPJ-MSCは増殖の最高CFE値とレートを持っていました。また、WJ-とCPJ-MSCがBM-MSCのより高い分化能を示しました。 CL-MSCは少なくとも分化を示しました。すべての3つの系統（ すなわち、脂肪生成、軟骨、および骨形成）への潜在的な、CPJ-MSCは最高trilineageの分化能を有しており、FP-MSCは少なくとも脂肪生成分化能を表示するのに対し。
結論として、我々の結果は、単離されたMSCの質と量がコード/胎盤サンプルの4つのソース間で異なることを示しました。 CPJ-MSCは、より多くの増殖能力と大きな自己再生能力を持っていました。彼らはtrilineage細胞型への分化にも強力でした。それらの低倍加時間に、CPJ-MSCは、急速に1000倍に拡大することができ、高スループット薬物または生体材料のスクリーニングのために使用します。これらの細胞は、細胞治療や再生医療アプリケーションのためのより多くの有望な供給源である可能性があります。
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
研究は、OU-WB ISCRM、オークランド大学とミシガン頭と背骨研究所によってサポートされていました。 N・ベアーラボルとC・マッキーオークランド大学から学長大学院研究賞を受賞しました。私たちは、原稿を見直すためS.バクシを感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM with 4,500 mg/mL glucose | Invitrogen | 11995065 | |
| FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
| Insulin | Prospec | CYT-270 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
| Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
| TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
| GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| DNase | Promega | M6101 | |
| iScript kit | Biorad | 1708891 | |
| Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
| Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
| Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
| Crystal violet | Sigma | C3886 | |
| Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
| APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
| APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
| FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
| APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
| FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
| APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
| Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
| Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
| Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
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