Summary
Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av human navelsträng (UC) och fetal placenta provet i sladden belägget (CL), Wharton s gelé (WJ), sladd-placenta-övergång (CPJ), och fetal placenta (FP) för isolering och karaktärisering av mesenkymala stromaceller (MSC) med användning explantatet odlingstekniken.
Abstract
Den mänskliga navelsträngen (UC) och placenta är icke-invasiva, primitiva och rikliga källor till mesenkymala stromaceller (MSC) som alltmer har fått uppmärksamhet eftersom de inte utgör någon etiska eller moraliska betänkligheter. Nuvarande metoder för att isolera MSC: er från UC ge låga mängder av celler med variabel spridningspotentialer. Eftersom UC är en anatomiskt-komplext organ, kan skillnader i MSC egenskaper bero på skillnaderna i de anatomiska regioner i deras isolering. I denna studie, första dissekerade vi de sladd / placenta proverna i tre diskreta anatomiska regioner: UC, sladd-placenta junction (CPJ), och fetal placenta (FP). Andra, två distinkta zoner, sladd foder (CL) och Wharton gelé (WJ), separerades. Explantatet odlingstekniken användes sedan för att isolera celler från de fyra källor. Den tid som krävs för den primära kulturen av celler från explantaten varieras beroende på källan för vävnaden. Utväxt av cellerna skedde inom 3 - 4 days av CPJ explantat, medan tillväxt observerades efter 7 - 10 dagar och 11 - 14 dagar från CL / WJ och FP explantat, respektive. De isolerade cellerna var vidhäftande till plast och visas fibroblastoid morfologi och ytmarkörer, såsom CD29, CD44, CD73, CD90, och CD105, på liknande sätt som benmärgen (BM) -härledda MSCs. Emellertid den kolonibildande effektiviteten hos cellerna varierade, med CPJ-MSC: er och WJ-MSC: er som visar högre verkningsgrad än BM-MSC: er. MSCs från alla fyra källor differentieras till adipogena, kondrogena och osteogena linjer, vilket indikerar att de var multi. CPJ-MSCs differentierade mer effektivt i jämförelse med andra MSC källor. Dessa resultat antyder att CPJ är den mest potenta anatomiska regionen och ger ett högre antal celler, med större spridning och självförnyelsekapaciteten in vitro. Avslutningsvis, den jämförande analysen av MSCs från de fyra källorna indikerade att CPJ är ett mer lovande källa till MSC-celler för cellterapi, regenerativemedicine, och vävnadsteknik.
Introduction
Stamceller är närvarande i olika organ och vävnader i kroppen. De har regenerativ potential och spelar en viktig roll i att reparera skadade vävnader i kroppen under loppet av mänskligt liv 1, 2. Detta har genererat ett stort intresse hos vuxna stamceller (ASC), särskilt eftersom, till skillnad från embryonala stamceller (ESC), har användningen av ASC: er inte utgör moraliska och etiska dilemman. Flera studier har rapporterat isoleringen av ASC: er, såsom mesenkymala stromaceller (MSC); hematopoetiska stamceller (HSCs); och olika progenitorer, inklusive olika vuxna källor sträcker sig från benmärg (BM) till fettvävnad (AT) och tandpulpa 3, 4, 5. Emellertid antalet ASC: er som finns i de flesta av de vuxna nischer är begränsad, och deras isolering i allmänhet innebär en invasiv och smärtsam procedur med möjlig donatorsite sjuklighet. Dessutom kunde donator ålder och miljöstress också spela en viktig roll vid bestämning av kvaliteten och den biologiska aktiviteten hos de isolerade cellerna 6, 7, 8. ASC visar också begränsad proliferation och differentiering potential under odling in vitro.
För att övervinna dessa nackdelar med nuvarande DSK har nya källor bedrivits för att isolera stamceller. Dessa ansträngningar har lett till isolering av stamceller från perinatala källor, inklusive navelsträngsblod, sladd vävnad, placenta och fostervatten 9. Dessa källor har fått uppmärksamhet på grund av deras lätt och riklig tillgång 10, 11, 12, 13. Dessutom kan perinatala vävnader erhållas icke-invasivt, och stamceller som härrör från dem ärmer primitiva än ASCs isolerade från vuxna källorna 14, 15. De är isolerade från vävnader erhållna vid födseln och anses ha genomgått minimala förändringar i genomet på grund av åldrande och miljöspänningar 16.
Men de rapporterade egenskaperna hos stamceller från perinatala källor och deras möjligheter att själv förnya samt att skilja varierar kraftigt 11, 17. Detta skulle kunna vara delvis beroende på det faktum att det mänskliga navelsträngen (UC) är en komplext organ. Vår hypotes är att de diskreta regionerna perinatal vävnad skapa specifika nischer som är ansvariga för de variationer och mer primitiva arten av dessa stamceller i jämförelse med DSK: er som härrör från icke-perinatala källor. Denna studie beskriver dissektion av sladden / placenta proverna i tre diskreta anatomiska regioner: UC, sladd-placenta junction (CPJ), end fetal placenta (FP). UC ades vidare dissekeras i två zoner: sladd foder (CL) och Wharton Jelly (WJ). Analys av de isolerade celler från CL, WJ, CPJ, och FP visat att de alla uppvisade fibroblastoid morfologi och uttryckte MSC markörer, men de skilde sig i sin självförnyelse och differentiering potential. CPJ-härledda celler uppvisade en högre frekvens av proliferation och självförnyelse potential jämfört med UC-och FP-härledda celler, vilket gör dem en mer lovande källa för cellterapi, regenerativ medicin, och vävnadsteknik.
Protocol
Prover (n = 3) erhölls från samtyckande, friska givare genom Beaumont Hospital Biobank, Royal Oak, MI och Providence Hospital, Southfield, Ml enligt HIC- (HIC # 2012-101) och IRK (IRB # 820662- 3), respektive, godkända protokoll och bearbetades såsom godkänts av IBC (# 2858) av Oakland University, Rochester, MI.
1. Bearbetning human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta och isolering av celler
- Aseptiskt samla prover av UC ca 10 cm i längd, inklusive 5 - 6 cm anslutna till CPJ och 3 - 4 cm av FP. Omedelbart placera varje prov i en uppsamlingskopp innehållande medium (DMEM med 4500 mg / ml glukos och antibiotikalösning (0,1% gentamicin, 0,2% streptomycin och 0,12% penicillin)) och förvara vid 4 ° C tills det transporteras till laboratoriet genom placera den på is i en frigolitlåda. Bearbeta provet vid 4 ° C inom till 2 - 4 h för insamlingen.
- Placera provet i en 150-mm Petri skål som hålls påis i en biosäkerhet skåp. Med hjälp av en nål och spruta, skölj det flera gånger med iskall PBS för att avlägsna blodproppar. Se till att provet hålls fuktig med PBS under bearbetning och inte låta det torka. För att bibehålla sterilitet, hantera prov aseptiskt med hjälp av autoklave PBS och kirurgiska instrument under provbearbetning.
- Noggrant undersöka provet för att identifiera olika anatomiska regioner: UC, CPJ, och FP. Först dissekera UC. Håll foster änden av UC med pincett och försiktigt göra det första snittet bara på toppen av CPJ med hjälp av en sax. Göra det andra snittet nedanför CPJ att separera CPJ (1,5-2,0 cm) från FP. Placera den separerade UC, CPJ, och FP i separata petriskålar för vidare bearbetning.
- Skär UC i längdled med hjälp av sax och pincett, helt utsätta blodkärlen och omgivande WJ utan att störa epitel.
- Skrapa WJ bort från blodkärl och inre epitel av subamnionmed hjälp av en skalpell och ta bort blodkärlen. Var noga med att samla alla kvarvarande perivaskulär WJ under och runt blodkärlen, och placera den insamlade WJ i en separat petriskål.
- Uppsamling av resterande vävnaden, sladd foder (CL), i en separat petriskål.
- Efter separation av vävnaderna som representerar CL, WJ, CPJ, och FP, ersätta PBS med 3 - 5 ml av kommersiell trypsinlösning och separat skär var och en av vävnaderna i 1- till 2-mm bitar med sax.
- Inkubera vävnaden bitar inom kommersiell trypsinlösning vid 37 ° C under 30 min i en 5% CO 2 inkubator för partiell spjälkning av proverna. Observera partiell digerering genom att visualisera frisättning av celler med användning av ett faskontrastmikroskop.
- Till de partiellt digererade proven, tillsätt en lika volym av odlingsmedium (CM; DMEM med 4500 mg / ml glukos och 2 mM L-glutamin, kompletterat med 10% humant serum / FBS och antibiotikalösning (0,1% gentamicin, 0,2% streptomycin och 0,12% penicillin)) för att neutralisera den kommersiella trypsinlösning. Överföra innehållet i 50-ml centrifugrör och låt de partiellt digererade vävnadsbitar nöja 3 min.
- Försiktigt aspirera supernatanten, inklusive enstaka celler (de inte expandera effektivt), och plattan 15 - 20 delvis digererade vävnadsbitar på en 75-cm 2 vävnadsodlingskolv och tillsätt 9 ml CM. Inkubera vid 37 ° C och stör inte odlingskolvarna under 2 - 3 dagar för att möjliggöra vidhäftning av vävnadsbitar.
OBS: Den återstående delen av de partiellt digererade vävnadsprover kan kryokonserveras för framtida isolering av celler. - Efter 3 dagars inkubation, ändra CM leta efter uppkomsten av utväxt av celler från Explantation dagligen; celltillväxt bör vara uppenbart från de adherenta explantat efter 3 - 4 dagar, 7 - 10 dagar, och 11 - 14 dagars inkubation för CPJ, CL / WJ, och FP, respektive. Från denna punkt och framåt, ändra CM efter varje 3 dagar eller såbehövs.
OBS: Celltillväxt når 70% konfluens 7 - 10 dagar efter den initiala cellutväxt från explantatet. Observera att icke-vidhäftande vävnadsbitar kommer inte att ge upphov till någon cell utväxt förrän de ansluter sig till plasten. Man måste vara försiktig så att flaskan inte störs för att undvika avskiljandet av de angränsande vävnad bitar. Om det finns några flytande bitar efter de 3 första dagarna av odling, kunde de räddas genom att överföra dem till en ny kolv för fastsättning.
OBS! När celltillväxt från vävnadsexplantat når 70% sammanflödet, bör de subkultiveras. Såsom angivits ovan, MSCs från CL / WJ, FP, CPJ och kommer att nå konfluens i 10 - 14 dagar, 14 - 20 dagar, och 17 - 24 dagar, respektive. - Att subkultur urvuxna celler från explantaten, dissociera cellerna genom användning av 1 - 2 ml kommersiell trypsinlösning / 75-cm 2 odlingskolv och inkubera vid 37 ° C under 3 min. Neutralisera med 1 - 2 ml av CM och centrifugera 1500 xg under 3 min. GöraSe till att rotera kolven samtidigt lägga trypsin för jämn spridning över hela.
- OBS: De pelleterade celler anses passagen 0 (P0) och kommer att vara suspenderad i CM, räknades och subodlades med en såddtäthet av 1 x 10 4 / cm 2 för amplifiering, karakterisering, och kryokonservering. Överskottet celler kan kryokonserveras vid P0.
2. Karakterisering de isolerade cellerna
- Kolonibildande effektivitet (CFE) analysen
- Belägga de 100-mm Petri skålar (ytarea av 60 cm 2) med 0,1% gelatin för 30 min och placera dem i CO 2 inkubator vid 37 ° C.
OBS: Även om det inte är nödvändigt, förbättrar gelatin-beläggning cell följsamhet. - Avlägsna överskottet gelatin och ympa den belagda plattan med P0 celler vid en koncentration av 1,63 celler / cm 2. Lägg 3 ml CM och inkubera i CO-2-inkubator vid 37 ° C.
- Övervaka seedade plattor för klonal tillväxtgenom ljusmikroskop (LM) och ändra mediet var 3 dagar.
- Efter 10 - 14 dagar av celltillväxt, tvätta Petri-skålarna två gånger med PBS och fixera cellerna i 4% paraformaldehyd under 30 min vid rumstemperatur.
OBS: Paraformaldehyd är giftigt. Vänligen öva försiktighet genom att bära handskar och glasögon under användning. - Färga de fixerade cellerna med 0,1% kristallviolett i 1 h vid rumstemperatur och skölj plattan med kranvatten tills den obundna blånad är borta.
- Räkna antalet kolonier som består av åtminstone 50 celler med användning av LM.
- Belägga de 100-mm Petri skålar (ytarea av 60 cm 2) med 0,1% gelatin för 30 min och placera dem i CO 2 inkubator vid 37 ° C.
- Uttryck av cellytemarkörer
- Kultur de isolerade cellerna till 70% konfluens, dissociera med den kommersiella trypsin lösningen och tvätta och pellet genom centrifugering vid 1500 xg under 3 min. Suspendera cellerna i FACS-buffert (1 x PBS med 2% FBS och 0,1% natriumazid).
OBS! Natriumazid är giftigt. Vänligen öva försiktighet genom att bära handskar och glasögon under användning.
- Kultur de isolerade cellerna till 70% konfluens, dissociera med den kommersiella trypsin lösningen och tvätta och pellet genom centrifugering vid 1500 xg under 3 min. Suspendera cellerna i FACS-buffert (1 x PBS med 2% FBS och 0,1% natriumazid).
- Centrifugera de färgade cellerna vid 670 xg under 5 min, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 mikroliter av FACS-buffert.
- Analysera de antikropps färgade celler med användning av FACS enligt tillverkarens protokoll.
3. Differentiering Potential
- adipogen differentiering
- Kultur de isolerade cellerna till 70% konfluens, dissociera med den kommersiella trypsin lösningen och tvätta och pellet genom centrifugering vid 1500 xg under 3 min.
- I en CO2-inkubator vid 37 ° C, odla cellerna vid en koncentration av 100.000 celler / brunn i en 6-brunnars platta innehållande 2 ml CM.
- Efter 24 timmar, byt ut CM med adipogENIC differentieringsmedium (0,5 uM isobutyl-metylxantin, 1 uM dexametason, 10 uM insulin och 200 | iM indometacin) och inkubera. Ändra differentieringsmediet var 3 dagar eller så ofta som behövs.
- Efter 3 veckors inkubation, fixera cellerna med 2 ml av 4% paraformaldehyd per brunn för 30 min vid rumstemperatur och fläcken med Oil Red O för att detektera produktionen av lipiddroppar för att analysera för adipogen differentiering.
OBS: Paraformaldehyd är giftigt. Vänligen öva försiktighet genom att bära handskar och glasögon under användning. - Behandla de fixerade cellerna med 60% isopropanol (2 ml / brunn av 6-brunnsplatta) under 5 min.
- Ersätta isopropanol med 2 ml av Oil Red O stain (filter 3 delar Oil Red O stain och 2 delar destillerat vatten), inkubera i 15-30 min vid rumstemperatur, och tvätta 3 - 4 gånger med kranvatten för att avlägsna eventuellt obundet fläck .
- Visualisera de röda-färgade lipiddroppar, som är indikativa för adipogen cellhärstamning, usjunga LM.
- kondrogen differentiering
- Kultur isolerade celler till 70% konfluens, dissociera med den kommersiella trypsin-lösning, och tvätta med PBS.
- För att pelletera celler för kondrogen induktion, centrifug 250.000 celler i ett 15-ml centrifugrör med 2 ml CM vid 11 tusen xg under 8 min. Inkubera pelletsen över natten vid 37 ° C.
- Efter 24 h, försiktigt ersätta CM med kondrogen differentieringsmedium (20 ng TGFβ1, 10 ng insulin, 100 nM dexametason, och 100 uM askorbinsyra) utan att störa pelleten och fortsätt inkuberingen. Ändra differentieringsmediet var 3 dagar eller så ofta som behövs.
- Efter 3 veckors inkubation, fixera cellerna med 2 ml av 4% paraformaldehyd per brunn för 30 min vid rumstemperatur. Kryosnitt och fläcken med en% toluidinblått för att undersöka närvaron eller produktion av extracellulär matris i syfte att bestämma kondrogen differentiering.
OBS: Paraformaldehyde är giftigt. Vänligen öva försiktighet genom att bära handskar och glasögon under användning. - För cryosectioning, försiktigt tvätta de skördade cellpelletarna två gånger med PBS och fäst med 1 ml av 4% paraformaldehyd för 30 min vid rumstemperatur.
OBS: Paraformaldehyd är giftigt. Vänligen öva försiktighet genom att bära handskar och skyddsglasögon vid användning. - Tvätta nämnda pellets två gånger med PBS för att avlägsna paraformaldehyden och överför till en sackaros / oct-lösning (1: 2, 20% Sackaros: OCT). Inkubera vid rumstemperatur i 24 h för att tillåta lösningen att helt sippra in i de cellpellets; detta gör det möjligt smidig sektionering.
- Överföra pelletsen in i OCT-formarna. Frysa formarna vid -20 ° C under 4 - 6 timmar och kryosnitt ca 10-12 mikron tjocka sektioner av cellpellets med användning av en kryostat för toluidinblåfärgning.
- Tvätta kryosnitt försiktigt med PBS; lägga några droppar 1% toluidinblått fläck, som täcker pellet avsnitten på sliden helt; och incUbate under 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna med PBS flera gånger för att avfärgning. Avlägsna överskottet fläcken genom doppning av objektglas i HCl-baserade alkohollösning (95% alkohol + 0,5 ml HCl) flera gånger tills den obundna blå färgen är borta. Montera de färgade sektioner med hjälp 100 pl av lösning för montering av den långsiktigt bevarande av bilderna.
OBS: Den blå färgning av sektionerna indikerar närvaron av glykosaminoglykaner och glykoproteiner och kommer att vara observerbara med hjälp av LM.
- osteogen differentiering
- Igen, odla de isolerade cellerna till 70% konfluens, dissociera med den kommersiella trypsin lösningen och tvätta och pellet genom centrifugering vid 1500 xg under 3 min.
- Subkultur av cellerna vid en koncentration av 100.000 celler / brunn i 6-brunnsplattor innehållande 2 ml CM i en CO2-inkubator vid 37 ° C.
- Efter 24 h, ersätt CM med osteogent differentieringsmedium (0,1 μ; M dexametason, 10 uM β-glycerofosfat, och 50 uM askorbat fosfat) och fortsätt inkuberingen. Ändra differentieringsmediet var 3 dagar eller så ofta som behövs.
- Efter 3 veckors inkubation, fixera cellerna med 2 ml 4% paraformaldehyd per brunn under 30 min vid rumstemperatur och fläcken med alizarin röd för att detektera närvaron av en kalciumavsättning för att bestämma osteogen differentiering.
OBS: Paraformaldehyd är giftigt. Vänligen öva försiktighet genom att bära handskar och glasögon under användning. - tvätta försiktigt de fixerade cellerna två gånger med destillerat vatten och behandla med 2% alizarin röd fläck (2 ml / brunn i en 6-brunnsplatta) under 1 h vid rumstemperatur i mörker.
- Avlägsna överflödigt fläcken genom att försiktigt tvättning med kranvatten så att kalkavlagringar inte rubba.
- Visualisera röda färgade kalkavlagringar med hjälp av LM.
4. Kvantitativ Reverse Transcriptase Polymerase Chai Reaktions (QRT-PCR) Analys
- Kultur de isolerade cellerna till 70% konfluens, dissociera med den kommersiella trypsin-lösning, tvätta, och pelleten genom centrifugering vid 1500 xg under 3 min för att isolera cellulärt total-RNA.
- Tvätta cellerna med PBS för att avlägsna spår av FBS, och fortsätt sedan till RNA-isolering med användning av ett kommersiellt RNA-reningskit, enligt tillverkarens instruktioner.
- Rena den isolerade totalt RNA genom behandling med DNas vid 37 ° C under 30 min med användning av en termocykler. Syntetisera cDNA med hjälp av kommersiellt kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbereda triplikat 10-mikroliter PCR-reaktioner i en 96-brunnsplatta, varvid varje reaktion innehållande 5 mikroliter av SYBR-grön PCR Supermix; 3 | il av dubbeldestillerat vatten; 0,5 pl av varje primer, framåt och bakåt; och 1 mikroliter av den utspädda (1:10) cDNA.
- Utföra PCR under följande parametrar: 10 min vid 98 ° C, följt av 44 cykler av 30 s vardera vid 98 &# 176; C, 20 s vid 60 ° C, och 30 s vid 72 ° C.
- Normalisera amplifiering av målgener till referensgener, GAPDH och β-aktin; primersekvenserna är listade i tabell 1.
5. Statistisk analys
- Utför alla analyser med hjälp av statistiska program. Presentera data som medelvärde ± SEM. Resultat med ett p-värde (** p ≤ 0,01 och * p ≤ 0,05) ansågs vara statistiskt signifikant.
Representative Results
Dissekering och isolering av celler från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta
Perinatal vävnad består av tre diskreta anatomiska regioner. Den första är UC, innehållande två artärer och en ven, samt två distinkta zoner: CL (den yttre beklädnaden av sladden) och WJ (den geléliknande material som omger blodkärlen inne i sladden). Den andra är CPJ (förbindelsen mellan sladden och moderkakan), och den tredje är FP, som är omedelbart efter CPJ (sladden införs i moderkakan, som är fäst till livmoderväggen hos modern). Den schematiska av isoleringsprotokollet för celler från perinatal vävnad avbildas i figur 1. De fyra källorna-CL, WJ, CPJ, och FP-är klart identifierbara och separerades för att isolera cellerna från explantaten, såsom visas i fig 2. Than utseende av cellutväxt från explantatkulturer övervakades rutinmässigt och registreras av LM. Vidhäftande fibroblastoid celler observerades efter 3-4 dagars odling av CPJ explantaten. Celler med liknande morfologi verkade 7-8, 9-10 och 11-14 dagar efter odling av WJ, CL, och FP explants, respektive. Utväxt av celler från explantaten som representerar de olika källorna (CL, WJ, CPJ, och FP) avbildas i figur 3A. Dessa celler betraktades som P0. När P0 celler subodlades, de verkade växa kloner, visar en fibroblastoid morfologi liknande den i BM-MSC. Uppvisade emellertid de variation i populationsfördubblingstid, som sträcker sig från 32 h till 94 h för celler från CPJ och FP, såsom visas i figur 3B och C. Celler från WJ och CL hade liknande dubbleringstider medial till CPJ och FP. Ytterligare analys av P0 celler indikerade att de varierade också i CFE, som sträcker sig från 16 till 92 kolonier.Celler från CPJ hade den högsta (92), medan FP-celler hade den lägsta (16) CFE. Celler från CL och WJ hade CFE värden av 59 och 80 kolonier, respektive (figur 4A-C). Cellerna från CL hade CFE värden liknar BM-MSC. Dessa resultat tyder på att CPJ-härledda celler har högre proliferativa och självförnyelse kapacitet.
Immunoprofile av de isolerade cellerna
Celler isolerade från CL, WJ, CPJ, och FP undersöktes för uttryck av cellspecifika markörer. P3-5 celler uppvisade positivt uttryck för MSCs markörer såsom CD29, CD44, CD73, CD90, och CD105 (figur 5A och B). Dessa celler är också kända för att uttrycka major histocompatibility klass I Marker, HLA-ABC, och uttrycker inte klass II markör, HLA-DR 3. De procenttal av positiva celler för these utvalda markörer från alla fyra källor var liknande den som uttrycks av standard BM-MSC: er. Emellertid de MFI-förhållanden indikerar att WJ- och CPJ-härledda celler är nästan lika och är till och med högre än den CL- och FP-härledda celler (figur 5C). Interestingly, trots varierande CFE värden, alla celler från olika källor uttryckte liknande nivåer av MSC-markörer. Baserat på resultaten av cellytmarkörer ades de isolerade cellerna från alla fyra källor betraktas som MSCs. Ytterligare analys av dessa celler visade att de uttrycker också pluripotensbestämmande gener, OCT4, NANOG, Klf4 och SOX2, såsom visas i figur 5D. Den CPJ-MSC hade det högsta uttrycket för pluripotens markörer, följt av WJ-, CL- och FP-MSC.
Differentiering potential Isolerade MSCs
Guldmyntfoten för att karakterisera MSC är deras förmåga att differentiate i flera härstamningar. Våra resultat visade att isolerade MSC: er från alla de perinatala källor lätt differentieras till adipogena, kondrogena och osteogena celltyper. Adipogena derivat producerade lipiddroppar som var positivt färgade med Oil Red O, såsom visas i figur 6A. Toluidinblåfärgning av den kondrogena derivatet av MSCs visade närvaron av proteoglykaner och glykoproteiner som understödda i produktion av extracellulär matrix (Figur 6B). Osteogena derivat av MSCs positivt färgade med alizarin röd indikera närvaron av kalkavlagringar är involverade i benmineralisering, såsom visas i fig 6C.
Som väntat, den transkriptionella analys av isolerade MSC: er från alla källor visade trilineage differentiering (Figur 6D -F). Emellertid pottenential av differentiering varieras beroende på källan av MSC. Adipogena derivat av WJ-MSC: er hade två-faldigt högre expressionsnivåer av de valda adipogena gener (CEBPβ, FABP4 och PPARy) jämfört med CPJ-MSC: er. CL- och FP-MSC hade den lägsta uttrycket av dessa gener. I fallet med kondrogen differentiering uttalade CPJ-MSCs derivat valda kondrogena gener (SOX9 och Col2) 50-faldigt högre än de WJ- och FP-MSCs derivat. Liknande den dåliga adipogen differentiering av CL-MSC: er, de hade lägre kondrogen potential, såsom framgår av den lägsta expressionen av kondrogena gener. CPJ-MSCs visade också den högsta osteogen differentieringspotential, såsom indikeras av de två-faldigt högre transkriptionsnivåer av utvalda osteogena gener (COL1, OPN, och OCN). Var emellertid expressionen av progenitor markör RUNX2 högst i osteogena derivat av WJ-MSC: er, vilket indikerar att dessa celler var långsam med att svara på differentieringsbetingelser. Igen, visade CL-MSC: er dåligdifferentiering till osteogena linjen. Dessa resultat tyder på att CPJ-MSC och WJ-MSCs visade större differentiering potential än CL- och FP-MSC. CL-MSC hade den lägsta potentialen att differentiera till trilineage derivat.
Figur 1: Schematisk av isolering av celler från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta. Inspektera insamlade provet och fortsätta med dissekering. Steg 1. Manuellt dissekera och separera sladd / placenta provet i tre diskreta regioner: navelsträng (UC), sladd-placenta-övergång (CPJ), och fetal placenta (FP). Separera de två distinkta zoner av UC i sladden foder (CL) och Wharton Jelly (WJ) med användning av sax och pincett. Steg 2. Skär var och en av de dissekerade vävnaderna separat i 1-to 2-mm stycken med sax och delvis smälta bitarna. Steg 3. Kultur vävnadsbitar. Steg 4. Isolera cellerna från explantaten genom trypsinbehandling. Subkultur och karakterisera de isolerade cellerna. Steg 5. isolerades och karakteriserades celler kan amplifieras och användas för olika tillämpningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dissektion och Kultur av Explantat från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta. Visat finns tre olika anatomiska regioner i sladden / placenta provet: UC (split in i CL och WJ), CPJ, och FP, samt den associerade artärer och vener. CL, WJ, CPJ,och FP separerades genom manuell dissektion för att isolera cellerna från explantaten. Var och en av de dissekerade områdena ades separat skuren i små fragment och odlades i 75-cm 2 plattor med användning av 9 ml av CM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Morfologi av isolerade celler från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta. (A) Cell utväxt från explantat av CL, WJ, CPJ, och FP, som visualiserades genom LM. (B) subkultur av de isolerade cellerna från CL, WJ, CPJ, och FP-explantat visade fibroblastoid morfologi. Skalstrecket representerar 100 ^ m (förstoring: 4X). (C) Population dubbleringstid av than isolerade celler från CL, WJ, CPJ, och FP. BM-MSC användes som standard. Felstaplarna representerar standardfelet av medelvärdet av de tredubbla mätningar (** p ≤ 0,01 och * p ≤ 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kolonibildande Effektivitet av celler från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta. (A) Odling av cellerna (P0) isolerade från CL, WJ, CPJ, och FP, ströks ut med en klonal täthet av 1,63 celler / cm 2, visualiserades genom LM. (B) Mikrofotografier av celler färgade med kristallviolett visning kolonibildande kapacitet. (C) Single koloni av celler färgas with kristallviolett. Skalstrecken representerar 100 ^ m (förstoring: 4X). (D) Grafisk representation av antalet kolonier bildade av celler härledda från CL, WJ, CPJ, och FP. BM-MSC användes som standard. Felstaplarna representerar standardfelet av medelvärdet av de tredubbla mätningar (** p ≤ 0,01 och * p ≤ 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av MSC Markörer som uttrycks av celler som isolerats från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta. (A) Expression av mesenkymala ytmarkörer (CD29, CD44, CD73, CD90, och CD105) av cellerna från CL, WJ, CPJ, och FP, som avskräckamined med flödescytometri. (B och C) Grafisk representation av procentandelarna av positiva celler och median fluorescensintensitet (MFI) -förhållanden för de valda mesenkymala ytmarkörer. MFI-förhållanden beräknades genom division av MFI-värdet av markören (som genereras av programvara baserad på fluorescensintensiteten hos grindade cellpopulationer) genom MFI-värde av isotypen. Felstavarna representerar standardfelet av medelvärdet av trefaldiga mätningar. (D) Expression av pluripotens gener (OCT4, Nanog, Klf4 och Sox2) av cellerna från CL, WJ, CPJ, och FP, enligt bestämning med QRT-PCR. (** p ≤ 0,01 och * p ≤ 0,05). Genuttryck normaliserades till GAPDH och β-aktin och felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet av trefaldiga mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: multilinjär Differentiering av MSCs isolerades från human navelsträng, Cord-placenta Junction, och Fetal Placenta. (A) Celler inkuberades i adipogen differentieringsmedium i 3 veckor och färgades med Oil Red O, vilket indikerar närvaron av lipiddroppar. (B) Cellpelletar inkuberades i kondrogen differentieringsmedium under 3 veckor. Histologiska kryosnitt av pellets kulturer färgades med toluidinblått och visar närvaron av glykosaminoglykaner. (C) Celler inkuberades i osteogent differentieringsmedium i 3 veckor och färgades med alizarin röd, visar produktion av kalkavlagringar tyder benmineralisering. Alla bilder erhölls genom LM. Skalstrecket representerar 100 ^ m (förstoring: 4X). BM-MSC vire användes som standard. (DF) Expression av utvalda gener (CEBPβ, FABP4 och PPARy; SOX9, ACAN, och COL2; och COL1, RUNX2, OPN, och OCN representerar differentieringen av MSC: er in i adipogen, kondrogena och osteogena linjer, respektive), såsom bestämts av QRT-PCR-analys (** p ≤ 0,01 och * p ≤ 0,05). Genuttryck normaliserades till GAPDH och β-aktin och felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet av trefaldiga mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen | primersekvenserna | produkt~~POS=TRUNC |
| OCT4 | Framåt CCCCTGGTGCCGTGAA | 97 |
| Omvänd GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG | </ Td> | |
| NANOG | framåt AAAGAATCTTCACCTATGCC | 110 |
| Reverse- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT | ||
| Klf4 | framåt CGAACCCACACAGGTGAGAA | 94 |
| Reverse- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC | ||
| SOX2 | framåt TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA | 75 |
| Reverse- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC | ||
| SOX9 | framåt AGCGAACGCACATCAAGAC | 85 |
| Reverse- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG | ||
| COL2 | framåt CTCGTGGCAGAGATGGAGAA | 252 |
| Reverse- CACCAGGTTCACCAGGATTG | ||
| EN BURK | framåt AGCCTGCGCTCCAATGACT | 103 |
| COL1 | framåt AAGGTCATGCTGGTCTTGCT | 114 |
| Reverse- GACCCTGTTCACCTTTTCCA | ||
| RUNX2 | framåt TGCTTCATTCGCCTCACAAA | 111 |
| Reverse- AGTGACCTGCGGAGATTAAC | ||
| OPN | framåt CATACAAGGCCATCCCCGTT | 112 |
| Reverse- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC | ||
| OCN | framåt TAAACAGTGCTGGAGGCTGG | 191 |
| Reverse- CTTGGACACAAAGGCTGCAC | ||
| CEBPβ | framåt TATAGGCTGGGCTTCCCCTT | 94 |
| Reverse- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG | ||
| FABP4 | framåt TTAGATGGGGGTGTCCTGGT | 158 |
| Reverse- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA | ||
| PPARy | framåt GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC | 74 |
| Reverse- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG | ||
| GAPDH | framåt ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | 101 |
| Reverse- GCCATCACGCCACAGTTTC | ||
| ACTIN | framåt AATCTGGCACCACACCTTCTAC | 170 |
| Reverse- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC |
Tabell 1: Förteckning över de mänskliga primersekvenser används i denna studie.
Discussion
Senaste framstegen inom forskning på stamceller inte bara förbättrat förståelsen för grundläggande utvecklingsprocesser utan också tillgänglig lovande möjligheter för användningen av stamceller i biotekniska, farmaceutiska, cellterapi, regenerativ medicin, och vävnadskonstruktionsapplikationer 18, 19, 20. Medan pluripotenta ekonomiska och sociala råd som isolerats från tidiga embryon är den mest lovande, möter de tekniska utmaningar och etiska dilemman 21, 22, 23. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) härledda från vuxna celler tillhandahålla ett alternativ, men de också möter liknande tekniska och säkerhetsproblem 23. Vidare kan iPSCs inte vara genetiskt stabila eller kan ha genomgått genetiska förändringar, vilket begränsar deras terapeutiska användning. Stamceller har också rapporterats i en mängd olika postnatal tisstämmer och organ. De vanligaste källorna till dessa DSK: er är benmärgen, fett och muskelvävnad. Emellertid har ASC från postnatal källor begränsad tillväxt och differentiering potential 24, 25. De lider också på grund av åldrande och exponering för miljöpåfrestningar och därmed är inte alltid effektiva för terapeutiska tillämpningar 26, 27, 28. Detta har lett oss och andra för att söka efter nya källor till stamceller som är mer naiv än ASCs.
Vi har undersökt perinatala källor för primitiva stamceller som ett alternativ till DSK: er. I denna rapport ger vi en pålitlig, robust och enkel metod för att isolera humana MSCs från sladden / placenta prover. I jämförelse med andra källor och metoder som används för isolering av ASC: er, ger denna metod en effektiv och icke-invasiv metod för att isolera stora mängder av high-kvalitet MSCs. Det accentuerar ytterligare högre tillväxt och differentieringspotential av perinatala MSCs jämfört med MSC: er från vuxna källor såsom BM.
UC fästa fostret för moderkakan är en stor orgel med distinkta anatomiska regioner, inklusive två artärer, en ven, CL, och WJ (vävnad som omger blodkärlen). Flera studier har rapporterat isolering av MSC-celler från hela sladd, WJ, eller moderkakan, med variabel tillväxt och differentiering potentialer 25, 29. Icke desto mindre, till dags dato, ingen studie har effektivt undersökas och jämförde celler från olika anatomiska regioner i sladden / placenta prov. Vi ger här en systematisk och enkel metod för dissektion av UC, CPJ, och anslutna FP för isolering av MSC. Vi visar också en omfattande och enkelt protokoll för att karakterisera och utvärdera kvaliteten på de isolerade cellerna genom att bestämma deras spridning capabilheterna, samt deras självförnyelse och differentiering potential. Denna metod är reproducerbar och ger en stor mängd av överlägsen kvalitet MSCs.
Vi fann att den partiella digerering av vävnadsbitar 1-2 mm i storlek med användning av en kommersiell trypsinlösning reproducerbart gav cellerna från explantaten, medan fullständig spjälkning av vävnad i enstaka celler hade dåliga utbyten av isolerade celler. Emellertid rapporterade en studie att större vävnads explantat av UC ungefär 10 mm i storlek var optimala för cellisolering 30. Omvänt, föreslog en annan studie att vävnadsexplantat metod resulterade i en längre odlingscykel och lägre utbyte av celler jämfört med den enzymdigeremetoden 31. I tidigare rapporter, behandlingen av sladden vävnader med kollagenas II och hyaluronidas, separat eller efter trypsin, har utförts för att isolera sladd celler 32, 33
Medan protokollet för dissekering och isolering av celler från explantaten är enkel, kan en del av de åtgärder som visar sig vara en utmaning. Först, se till explantat vidhäftning genom att tillåta deras fastsättning till ytan av odlingskolven. Detta kan underlättas genom användning av en liten mängd medium, endast täcker vävnaden bitar för de första 2 h av odling, och sedan försiktigt tillsätta det kvarvarande mediumet. Second, begränsa antalet explantat till mindre än 15 per T75-kolv. För lite utrymme mellan styckena eller alltför många bitar per kolv är inhibitoriska för cellutväxt. Tredje, vävnadsbitar som inte fastnar på ytan av odlingskolven efter 3 dagars inkubation ska överföras till en ny kolv för vidhäftning och odling. Fjärde, bitar vävnad odlas bör vara fri från cellfragment, som hämmar fastsättning. Femte, odling av stora bitar kräver mer medium och förbättrar inte cell utväxt effektivitet. Slutligen, övervaka explantatodlingarna noggrant, i synnerhet efter det att utseendet på cellutväxt, eftersom cellerna snabbt kan bli sammanflytande och differentiera beroende på vävnadskällan. Några begränsningar av tekniken inkluderar en brist på expertis i dissekera proven att separera CL, WJ, CPJ, och FP; en liten provstorlek, vilket resulterar i låg WJ utbyte; och fördröjda behandlings-proverna måste bearbetas inom 2-4 h från insamling till avoid en förlust i cellutvinning.
Den gyllene standarden för karakterisering av MSCs är förmågan att vidhäfta till plast, bilda den fibroblastisk fenotyp, och differentierar till flera härstamningar. Dessa är också ofta använda kriterier för att definiera MSCs såsom beskrivs av ISCT 35. I denna studie celler som isolerats från alla fyra källor var anhängare till plast och hade positivt uttryck för MSC-markörer (CD29, CD44, CD73, CD90 och CD105) men negativ uttryck för hematopoetisk markören CD45. Dessutom uttryckte de humana leukocytantigen (HLA) klass I men var negativa för HLA klass II. Jämfört med BM-MSC: er, WJ- och CPJ-härledda celler var högre. Dessa resultat överensstämmer med de tidigare rapporterna från UC-härledda MSCs 33, 36, 37, 38. Dessutom har våra resultat visade att CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs uttryckte mångpotens gener såsom OCT4, NANOG, och SOX2; Men deras uttryck var lägre än för ekonomiska och sociala råd, som tidigare 39 rapporterats. Dessa resultat var också överens med en tidigare studie som rapporterade ett uttryck för pluripotens markörer i perinatala-härledda celler 40. Interestingly, observerades det att uttrycket av pluripotenta markör var högre i CPJ-MSC: er än i celler som isolerats från andra källor. Det var också märkt att UC-MSCs uppvisade större självförnyelse potential än BM-MSC 41. Interestingly, trots likheten i fenotypiska egenskaper, de celler som isolerats från de fyra källorna hade variabla CFE-värden. Med undantag för FP-MSC, hade de alla bättre CFE värden än BM-MSC. CPJ-MSC hade den högsta CFE värdet och graden av proliferation jämfört med alla andra MSC. Dessutom WJ- och CPJ-MSC: er som visas högre differentieringspotentialer än BM-MSC: er. CL-MSCs visade den minsta differentieringpotential i alla tre linjer (dvs adipogena, kondrogena och osteogena), medan CPJ-MSC hade den högsta trilineage differentieringspotential och FP-MSCs visade minst adipogena differentieringspotential.
Sammanfattningsvis våra resultat visade att kvaliteten och kvantiteten av isolerade MSC skilde mellan de fyra källor i sladden / placenta prov. CPJ-MSC hade mer spridning kapacitet och högre självförnyelse potential. De var också potenta i deras differentiering till typerna trilineage cell. Grund av deras låga dubbleringstid, kunde CPJ-MSC: er vara snabbt expanderade 1000-faldigt och användes för hög genomströmning läkemedel eller biomaterial screening. Dessa celler kan vara mer lovande källa för cellterapi och regenerativ medicin applikationer.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Studien stöddes av OU-WB ISCRM, Oakland University och Michigan huvud och Spine Institute. N. Beeravolu och C. McKee fick Provost Graduate Research Award från Oakland University. Vi uppskattar S. Bakshi för att granska manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM with 4,500 mg/mL glucose | Invitrogen | 11995065 | |
| FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
| Insulin | Prospec | CYT-270 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
| Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
| TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
| GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| DNase | Promega | M6101 | |
| iScript kit | Biorad | 1708891 | |
| Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
| Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
| Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
| Crystal violet | Sigma | C3886 | |
| Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
| APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
| APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
| FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
| APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
| FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
| APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
| Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
| Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
| Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
References
- Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
- English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
- Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
- Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
- Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
- Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
- Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
- Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
- Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
- Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
- Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
- Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
- Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
- Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
- Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
- Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
- Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
- Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
- Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
- Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
- Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
- Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
- Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
- Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
- Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
- Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
- Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
- Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
- Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
- Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
- Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).
