Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55224
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Summary

Her presenterer vi en protokoll for disseksjon av human navlestrengen (UC) og føtalt placenta prøven i ledningen foring (CL), Wharton gelé (WJ), ledning-placenta knutepunkt (CPJ), og føtal placenta (FP) for isolering og karakterisering av mesenchymale celler (stromale MSCene) ved hjelp av et utenforliggende kulturteknikk.

Abstract

Den menneskelige navlestreng (UC) og morkaken er ikke-invasiv, primitive og rikelig kilder til mesenchymale stromale celler (MSC) som i økende grad har fått oppmerksomhet fordi de ikke utgjør noen etiske eller moralske bekymringer. Nåværende metoder for å isolere MSC-er fra UC ga små mengder av celler med variable sprednings potensialer. Siden UC er en anatomisk komplekst organ, kan forskjeller i MSC egenskaper være på grunn av forskjeller i de anatomiske regioner i deres isolasjon. I denne studien vi først dissekert snor / placenta prøver i tre adskilte anatomiske regioner: UC, ledning-placenta junction (CPJ), og føtal placenta (FP). For det andre, to distinkte soner, ledning foring (CL) og Wharton gelé (WJ), ble separert. Den utenforliggende kultur teknikken ble deretter anvendt for å isolere celler fra de fire kilder. Den tid som er nødvendig for den primære kultur av celler fra eksplantatene varieres avhengig av kilden av vevet. Utvekst av cellene oppstod innen i 3 - 4 days av CPJ eksplanter, mens vekst ble observert etter 7 - 10 dager og 11 - 14 dager fra CL / WJ og FP eksplantater, henholdsvis. De isolerte cellene var vedheftende til plast og vises fibroblastoid morfologi og overflatemarkører, så som CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 og, på samme måte som benmarg (BM) avledede MSC-er. Imidlertid kolonidannende effektivitet av cellene, varieres, med CPJ-MSCer og WJ-MSC-er som viser høyere effektivitet enn BM-MSC-er. MSC-enheter fra alle fire kilder differensiert i adipogene, chondrogen, og osteogene linjer, noe som indikerer at de var multi. CPJ-MSC differensiert mer effektivt i forhold til andre MSC kilder. Disse resultater antyder at den CPJ er den mest potente anatomisk område og gir den et høyere antall celler, med større spredning og selvfornyelse kapasiteter in vitro. Konklusjonen er at den komparativ analyse av MSC-ene fra de fire kildene indikerte at CPJ er en mer lovende kilde av MSC-ene for celleterapi, regenerativEMEDICINE, og tissue engineering.

Introduction

Stamceller er tilstede i forskjellige organer og vev i legemet. De har regenererende potensial og spille en viktig rolle i å reparere skadet vev i kroppen hele span av menneskeliv en, to. Dette har generert en stor interesse hos voksne stamceller (ASCs), særlig siden, i motsetning til embryonale stamceller (ESCs), har bruk av ASCs ikke utgjør moralske og etiske dilemmaer. Flere studier har rapportert isoleringen av ASC, slik som mesenchymal stromale celler (MSC-er); hematopoetiske stamceller (HSCs); og forskjellige progenitorceller, innbefattende forskjellige voksne kilder som strekker seg fra benmarg (BM) for å fettvev (AT) og tannpulpa 3, 4, 5. Imidlertid er antallet av ASC som er tilstede i de fleste av de voksne nisjene er begrenset, og deres isolasjon omfatter generelt en invasiv og smertefull prosedyre med mulig donornettstedet sykelighet. I tillegg kunne donatorens alder og miljømessig spennings også spille en betydelig rolle i å bestemme kvaliteten og biologisk aktivitet av de isolerte cellene 6, 7, 8. ASCer viser også begrenset, proliferasjon og differensiering potensial under kultur in vitro.

For å overvinne disse ulempene med dagens ASCs har nye kilder blitt forfulgt for å isolere stamceller. Disse anstrengelser har ført til isoleringen av stamceller fra perinatale kilder, inkludert ledningen blod, ledningen vev, placenta, og fostervann 9. Disse kildene har fått oppmerksomhet på grunn av sin enkle og rikelig tilgjengelighet 10, 11, 12, 13. Videre kan perinatale vev oppnås en ikke invasiv, og stamceller avledet fra disse ermer primitive enn ASCer isolert fra voksne kilder 14, 15. De er isolert fra vev oppnådd ved fødselen og anses å ha gjennomgått minimale forandringer i genomet på grunn av aldring og miljømessige påkjenninger 16.

Men de rapporterte egenskapene av stamceller fra perinatale kilder og deres potensial til å fornye seg selv, så vel som for å differensiere variere vidt 11, 17. Dette kan være delvis på grunn av det faktum at det humane navlestreng (UC) er et sammensatt organ. Vi hypotese at de separate områder av perinatal vev lage spesifikke nisjer som er ansvarlige for de variasjoner og mer primitive natur av disse stamcellene i forhold til ASCer avledet fra ikke-perinatale kilder. Denne studien beskriver disseksjon av ledningen / placenta prøver i tre adskilte anatomiske regioner: UC, ledning-placenta junction (CPJs), end føtalt placenta (FP). UC ble videre deles opp i to soner: ledningen foring (CL) og Wharton Jelly (WJ). Analyse av de isolerte celler fra CL, WJ, CPJ, og FP demonstrert at de oppviste alle fibroblastoid morfologi og uttrykt MSC markører, men de skilte seg i sin selvfornyelse og differensiering potensial. CPJ-avledede celler utviste en høyere hastighet av proliferasjon og selvfornyelse potensial som i forhold til UC- og FP-avledede celler, noe som gjør dem til et mer lovende kilde for celleterapi, regenerativ medisin, og regenerering av vev.

Protocol

Prøver (n = 3) ble oppnådd fra samtykkende, friske givere gjennom Beaumont Hospital biobank Royal Oak, MI og Providence Hospital, Southfield, MI henhold HIC- (HIC # 2012-101) og IRB (IRB # 820662- 3), henholdsvis, godkjent protokoller og behandlet som godkjennes av IBC (# 2858) av Oakland University, Rochester, MI.

1. Behandling human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta og Isolere Celler

  1. Aseptisk samle inn prøver av UC ca. 10 cm i lengde, inkludert 5 - 6 cm som er koblet til CPJ og 3 - 4 cm av FP. Umiddelbart plassere hver prøve i en oppsamlingskopp inneholdende medium (DMEM med 4,500 mg / ml glukose og antibiotika-oppløsning (0,1% gentamicin, 0,2% streptomycin og 0,12% penicillin)) og oppbevares ved 4 ° C inntil den blir transportert til laboratoriet etter å plassere den på is i et Styrofoam-boksen. Behandle prøven ved 4 ° C i løpet av 2 - 4 timer etter innsamling.
  2. Plasser prøven i en 150 mm Petri skål holdt påis i en biosikkerhet skap. Ved hjelp av en kanyle og sprøyte, skyll det flere ganger med iskald PBS for å fjerne blodpropper. Sørg for at prøven er holdt våt med PBS under behandlingen, og ikke la det tørke. For å opprettholde sterilitet, behandle prøven aseptisk ved å anvende autoklaverte PBS og kirurgiske verktøy gjennom prøvebehandling.
  3. Omhyggelig undersøke prøven for å identifisere forskjellige anatomiske regioner: UC, CPJ, og FP. Først dissekere UC. Hold foster slutten av UC med pinsett og forsiktig ta det første kuttet bare på toppen av CPJ ved hjelp av en saks. Gjør den andre kutt under den CPJ å skille CPJ (1,5 til 2,0 cm) fra FP. Plasser den separerte UC, CPJ, og FP i separate Petri-skåler for videre behandling.
  4. Skjær UC i lengderetningen ved hjelp av sakser og pinsetter, fullstendig å eksponere blodårene og omgivende WJ uten å forstyrre epitel.
  5. Skrap WJ bort fra blodkar og indre epitelet i subamnionved hjelp av en skalpell og deretter fjerne blodkarene. Sørg for å samle eventuelle gjenværende perivaskulær WJ under og rundt blodårene, og plasser samles WJ i en egen petriskål.
  6. Samle de resterende vev, ledningen foring (CL), i en separat petriskål.
  7. Etter separering av vev som representerer CL, WJ, CPJ, og FP, erstatte PBS med 3 - 5 ml av kommersiell trypsinoppløsning og separat kuttes hvert av vevene i 1 til 2 mm stykker ved hjelp av en saks.
  8. Inkuber vevsstykkene i kommersiell trypsin-løsning ved 37 ° C i 30 minutter i en 5% CO2 inkubator for partiell fordøyelse av prøvene. Observer delvis spaltning ved å visualisere frigjøring av celler under anvendelse av et fasekontrastmikroskop.
  9. Til de delvis fordøyde prøver, tilsettes samme volum dyrkningsmedium (CM, DMEM med 4,500 mg / ml glukose og 2 mM L-glutamin, supplementert med 10% humant serum / FBS og antibiotika-oppløsning (0,1% gentamicin, 0,2% streptomycin og 0,12% p-enicillin)) for å nøytralisere den kommersielle trypsinoppløsning. Overføre innholdet til 50 ml sentrifugerør og la de delvis fordøyd vevsstykkene sedimentere i 3 min.
  10. Aspirere nøye supernatanten, inklusive enkle celler (de ikke utvider effektivt), og platen 15 - 20 delvis fordøyd vevsstykkene på en 75 cm2 vevskulturflaske og legge til 9 ml av CM. Inkuber ved 37 ° C og forstyrrer ikke kulturflasker i 2 - 3 dager for å tillate adhesjon av vev stykker.
    NB: Den gjenværende del av den delvis fordøyde vevsprøver, kan fryses for fremtiden isolering av celler.
  11. Etter 3 dagers inkubasjon, endre CM og ser for utseendet på utvekst av celler fra eksplantering på daglig basis; cellevekst vil være åpenbar fra de adherente eksplantatene etter 3 - 4 dager, 7 - 10 dager, og 11 - 14 dager med inkubasjon i CPJ, CL / WJ, og FP, henholdsvis. Fra dette punktet og utover, endre CM etter hver 3. dag eller sombehov for.
    MERK: Cellevekst når 70% konfluens 7 - 10 dager etter den første celleutvekst fra eksplantatet. Merk at ikke-heft vevsbiter ikke vil gi opphav til en celle utvekst før de holder seg til plast. Hensyn må tas, slik at kolben ikke forstyrres, for å unngå løsgjøring av de adherente vevsstykkene. Hvis det er noen flytende stykkene etter de første 3 dagene med dyrking, kan de bli reddet ved å overføre dem til en ny kolbe for feste.
    MERK: Når cellevekst fra vevseksplantater når 70% samløpet, bør de subkultiveres. Som angitt ovenfor, MSC-er fra CL / WJ, FP, CPJ og vil nå konfluens i 10 - 14 dager, 14 - 20 dager, og 17 - 24 dager, henholdsvis.
  12. For å subkultur vokst celler fra eksplantatene, dissosiere cellene ved anvendelse av 1 - 2 ml av kommersiell trypsinoppløsning / 75 cm2 kulturflaske og inkuber ved 37 ° C i 3 minutter. Nøytraliser med 1 - 2 ml av CM og sentrifuger 1500 x g i 3 min. Gjøresørge for å rotere i kolben under tilsetning av trypsin for selv å spre seg over.
  13. MERK: pelletiserte celler ble anses passasje 0 (P0) og vil bli suspendert i CM, telles og subdyrket ved en pode tetthet på 1 x 10 4 / cm2 for forsterkning, karakterisering, og nedfrysing. De overskytende Cellene kan fryses ned ved P0.

2. Karakterisering av de isolerte cellene

  1. Kolonidannende effektivitet (CFE) assay
    1. Smør 100 mm Petri skåler (overflateareal på 60 cm2) med 0,1% gelatin i 30 minutter og plassere dem i CO2 inkubator ved 37 ° C.
      MERK: Selv om det ikke er nødvendig, forbedrer gelatin-belegg celle adhesjon.
    2. Fjern overskudd av gelatin og frø i den belagte plate med P0-celler ved en konsentrasjon på 1,63 celler / cm2. Tilsett 3 ml av CM og inkuberes i CO2 inkubator ved 37 ° C.
    3. Overvåke seeded plater for klonal vekstved lysmikroskopi (LM) og endre medium hver 3. dag.
    4. Etter 10 - 14 dager for cellevekst, vask petriskåler to ganger med PBS og fikser cellene i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Paraformaldehyde er giftig. Vennligst øve forsiktighet ved bruk av hansker og vernebriller under bruk.
    5. Flekk de fikserte celler med 0,1% krystallfiolett i 1 time ved romtemperatur og skylles platen med vann fra springen inntil den ubundne blå flekken er borte.
    6. Telle antallet kolonier bestående av minst 50 celler ved hjelp av LM.
  2. Ekspresjon av celleoverflatemarkører
    1. Culture de isolerte celler til 70% konfluens, dissosiere med den kommersielle trypsinoppløsning, og vaske og pellet ved sentrifugering ved 1500 x g i 3 min. Suspender cellene i FACS-buffer (1 x PBS med 2% FBS og 0,1% natriumazid).
      MERK: Natriumazid er giftig. Vennligst øve forsiktighet ved bruk av hansker og vernebriller under bruk.
      2. 6) med FITC- eller APC-merkede MSC-spesifikke antistoff (FITC-konjugerte antistoffer mot: CD44 og CD90 eller APC-konjugerte antistoffer mot: CD29, CD73, og CD105) i FACS-buffer i 30 min ved 4 ° C i mørke.
    2. Sentrifuger fargede celler ved 670 xg i 5 minutter, oppsuging av supernatanten og resuspender cellene i 500 ul FACS-buffer.
    3. Analysere de antistoff-fargede celler ved bruk av FACS i henhold til produsentens protokoll.

3. Differensiering Potential

  1. adipogene differensiering
    1. Culture de isolerte celler til 70% konfluens, dissosiere med den kommersielle trypsinoppløsning, og vaske og pellet ved sentrifugering ved 1500 x g i 3 min.
    2. I en CO2 inkubator ved 37 ° C, dyrke cellene i en konsentrasjon på 100.000 celler / brønn i en 6-brønners plate inneholdende 2 ml av CM.
    3. Etter 24 timer, erstatte den med CM adipogENIC differensieringsmedium (0,5 uM isobutyl-metylxantin, 1 uM deksametason, 10 pM insulin, og 200 uM indometacin) og inkuber. Endre differensiering medium hver 3. dag eller så ofte som nødvendig.
    4. Etter 3 ukers inkubering fikser cellene med 2 ml av 4% paraformaldehyd pr brønn i 30 min ved romtemperatur og flekken med Oil Red O for å detektere dannelsen av lipid-dråper for å analysere for adipogene differensiering.
      MERK: Paraformaldehyde er giftig. Vennligst øve forsiktighet ved bruk av hansker og vernebriller under bruk.
    5. Behandle de fikserte celler med 60% isopropanol (2 ml / brønn på 6-brønners plate) i 5 minutter.
    6. Erstatte isopropanol med 2 ml av Oil Red O flekk (filter 3 deler Oil Red O beis og 2 deler destillert vann), inkuberes i 15-30 minutter ved romtemperatur, og vaske i 3 - 4 ganger med vann fra springen for å fjerne eventuelt ubundet flekk .
    7. Visual de rød-farget lipiddråper, som indikerer adipogene cellelinjen, usynge LM.
  2. chondrogen differensiering
    1. Kultur isolerte celler til 70% konfluens, dissosiere med den kommersielle trypsinoppløsning, og vask med PBS.
    2. Å pelletere celler for chondrogen induksjon, sentrifuger 250.000 celler i en 15-mL sentrifugerør med 2 ml CM ved 11.000 x g i 8 min. Inkuber pelletene natten over ved 37 ° C.
    3. Etter 24 timer, forsiktig erstatte CM med chondrogen differensieringsmedium (20 ng TGFβ1, 10 ng insulin, 100 nM deksametason, og 100 mM askorbinsyre) uten å forstyrre pelleten og fortsette inkubasjonen. Endre differensiering medium hver 3. dag eller så ofte som nødvendig.
    4. Etter 3 ukers inkubering fikser cellene med 2 ml av 4% paraformaldehyd pr brønn i 30 min ved romtemperatur. Cryosection og flekken med 1% toluidin blått for å undersøke tilstedeværelsen eller produksjon av ekstracellulær matriks for å bestemme chondrogen differensiering.
      MERK: Paraformaldehyde er giftig. Vennligst øve forsiktighet ved bruk av hansker og vernebriller under bruk.
    5. For cryosectioning, forsiktig vask de høstede cellepellets to ganger med PBS og feste med 1 ml av 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Paraformaldehyde er giftig. Vennligst øve forsiktighet ved bruk av hansker og vernebriller slitasje under bruk.
    6. Vask pelleten to ganger med PBS for å fjerne den paraformaldehyd og overfør til en sukrose / oktober løsning (1: 2, 20% sukrose: OCT). Inkuber ved romtemperatur i 24 timer for å tillate at oppløsningen fullstendig sive inn i cellepelletene; dette vil tillate jevn snitting.
    7. Overfør pelletene inn i OCT-formene. Fryse formene ved -20 ° C i 4 - 6 timer og cryosection ca. 10 - 12 mikron-tykke seksjoner av cellepelletene ved hjelp av en kryostat for toluidinblått farging.
    8. Vask de frysesnitt forsiktig med PBS; legge til noen få dråper av 1% toluidin blått beisemiddel, som dekker pellet seksjoner på sleiden helt; og økUbaté i 1 time ved romtemperatur.
    9. Vask objektglassene med PBS flere ganger for å destain. Fjern overskudd av flekken ved å dyppe objektglasset i HCl-baserte alkohol-løsning (95% alkohol + 0,5 ml HCl) flere ganger til det ubundne blå farge er forsvunnet. Monter beisede seksjoner ved hjelp av 100 ul av monteringsløsning for den langvarige preservering av lysbildene.
      MERK: blåfarging av seksjonene indikerer tilstedeværelse av glykosaminoglykaner og glykoproteiner, og vil kunne observeres ved bruk av LM.
  3. osteogene differensiering
    1. Igjen kultur de isolerte celler til 70% konfluens, dissosiere med den kommersielle trypsinoppløsning, og vaske og pellet ved sentrifugering ved 1500 x g i 3 min.
    2. Subkultur ble cellene i en konsentrasjon på 100.000 celler / brønn på 6-brønners plater inneholdende 2 ml av CM i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
    3. Etter 24 timer, erstatte den med CM osteogene differensieringsmedium (0,1 μ; M deksametason, 10 pM β-glycerofosfat, og 50 uM askorbat fosfat) og fortsett inkuberingen. Endre differensiering medium hver 3. dag eller så ofte som nødvendig.
    4. Etter 3 ukers inkubering fikser cellene med 2 ml av 4% paraformaldehyd pr brønn i 30 min ved romtemperatur og flekken med alizarin rødt for å detektere tilstedeværelsen av et kalsium deponering for å bestemme osteogen differensiering.
      MERK: Paraformaldehyde er giftig. Vennligst øve forsiktighet ved bruk av hansker og vernebriller under bruk.
    5. Forsiktig vaske de fikserte cellene to ganger med destillert vann og behandles med 2% alizarin rød flekk (2 ml / brønn i en 6-brønn plate) i 1 time ved romtemperatur i mørket.
    6. Fjern overflødig flekken ved forsiktig vask med vann fra springen, slik at kalkavleiringer ikke løsne.
    7. Visualiser de rød-farget kalkavleiringer ved hjelp av LM.

4. Kvantitativ revers transkriptase polymerase Chai reaksjon (QRT-PCR) Analyse

  1. Culture de isolerte celler til 70% konfluens, dissosiere med den kommersielle trypsinoppløsning, vaske, og pellet ved sentrifugering ved 1500 x g i 3 minutter for å isolere totalt cellulært RNA.
  2. Vask cellene med PBS for å fjerne spor av FBS, og deretter videre til den RNA-isolering ved hjelp av et kommersielt RNA rensesett, ved å følge produsentens instruksjoner.
  3. Rens isolert total RNA ved behandling med DNase ved 37 ° C i 30 minutter ved hjelp av en termosykler. Syntetisere cDNA ved hjelp av kommersielle kit følge produsentens instruksjoner.
  4. Forbered triplikate 10 pl PCR-reaksjoner i en 96-brønns plate, idet hver reaksjon inneholdende 5 ul av SYBR-grønn PCR Supermix; 3 ul dobbeltdestillert vann; 0,5 ul av hver primer, fremover- og bakover; og 1 pl av den fortynnede (1:10) cDNA.
  5. Utføre PCR under de følgende parametre: 10 min ved 98 ° C, etterfulgt av 44 sykluser av 30 sekunder hver i 98 &# 176; C, 20 s ved 60 ° C og 30 s ved 72 ° C.
  6. Normalisere forsterkning av målgener til referanse gener, GAPDH og β-ACTIN; primersekvensene som er oppført i tabell 1.

5. Statistisk analyse

  1. Utføre alle analyser ved hjelp av statistisk programvare. Presentere dataene som gjennomsnitt ± SEM. Resultater med en p-verdi (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05) ble betraktet som statistisk signifikant.

Representative Results

Disseksjon og isolering av celler fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta

Perinatal vev består av tre adskilte anatomiske regioner. Den første er den UC, inneholdende to arterier og en vene, samt to adskilte soner: CL (den ytre foring av kabelen), og WJ (den gelélignende materiale som omgir blodkarene inne i kabelen). Den andre er CPJ (forbindelsen mellom ledningen og placenta), og den tredje er FP, som er umiddelbart etter CPJ (ledningen setter i placenta, som er festet til livmorveggen av mor). Skissen av den elektroniske isolasjonsprotokoll av celler fra perinatal vev er vist i figur 1. De fire kildene-Cl, WJ CPJ, og FP-er klart identifiserbare og ble separert for å isolere celler fra eksplantatene, som vist i figur 2. THan utseendet celle utvekst fra eksplantering kulturer ble rutinemessig overvåket og registrert av LM. Adherente fibroblastoid celler ble observert etter 3-4 dager med dyrkning CPJ eksplantater. Celler med lignende morfologi dukket 7-8, 9-10 og 11-14 dager etter dyrking av WJ, CL, og FP explants hhv. Den utvekst av celler fra eksplantatene som representerer de forskjellige kildene (CL, WJ CPJ, og FP) er vist i figur 3A. Disse cellene ble ansett som P0. Når P0 celler ble dyrket i subkultur, syntes de å vokse clonally, viser en fibroblastoid morfologi lik som BM-MSC. Imidlertid viste de variasjon i populasjonen doblingstiden, som strekker seg fra 32 timer til 94 timer for celler fra CPJ og FP, slik som vist i figur 3B og C. Celler fra WJ og CL hadde lignende dobling ganger medial til CPJ og FP. Videre analyse av de P0 celler indikerte at de også variert i CFE, som strekker seg fra 16 til 92 kolonier.Celler fra den CPJ hadde den høyeste (92), mens FP-celler hadde lavest (16) CFE. Celler fra CL og WJ hadde CFE-verdier på 59 og 80 kolonier, henholdsvis (figur 4A -C). Cellene fra CL hadde CFE-verdier tilsvarende den BM-MSCene. Disse resultater antyder at CPJs-avledede celler har høyere proliferativ og selvfornyelse evner.

Immunoprofile av de isolerte celler

Celler isolert fra CL, WJ, CPJ, og FP ble undersøkt for ekspresjon av celle-spesifikke markører. P3-5 ende celler positivt uttrykk for MSCS markører, slik som CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 og (Figur 5A og B). Disse cellene er også kjent for å uttrykke store histocompatibility klasse I Marker, HLA-ABC, og uttrykker ikke klasse II markør, HLA-DR 3. Prosentandelene av positive celler for proese utvalgte markører fra alle fire kilder var lik den som er uttrykt ved standard BM-MSC-er. En MFI-forhold indikerer at WJ- og CPJ-avledede celler som er nesten like og er enda høyere enn det Cl- og FP-avledede celler (figur 5c). Interessant, til tross for varierende CFE-verdier, alle celler fra forskjellige kilder uttrykt tilsvarende nivåer av MSC markører. Basert på resultatene av celleoverflatemarkører, ble de isolerte celler fra alle fire kilder betraktes som MSC-er. Ytterligere analyse av disse cellene viste at de også kan uttrykke pluripotency gener, OCT4, Nanog, KLF4 og SOX2, som vist i figur 5D. Den CPJ-MSCene hadde den høyeste ekspresjon av pluripotency markører, etterfulgt av WJ-, Cl- og FP-MSC-er.

Differensiering potensialet i Isolerte MSC

Gullstandarden for å karakterisere MSC er deres evne til differentiate inn i flere linjene. Våre resultater viste at isolerte MSC fra alle de perinatale kilder lett differensiert i adipogene, chondrogen, og osteogene celletyper. Adipogene derivater produsert lipiddråper som ble positivt farget med Oil Red O, som vist i figur 6A. Toluidin blå farging av chondrogen derivat av MSCene viste tilstedeværelse av proteoglykaner og glykoproteiner som hjalp til produksjon av ekstracellulær matriks (figur 6B). Osteogene derivater av MSC-er positivt farget med alizarin rød indikerer tilstedeværelse av kalsiumavleiringer som er involvert i benmineralisering, som vist i Figur 6C.

Som forventet, den transkripsjonelle analyse av isolerte MSCer fra alle kilder viste trelinjet differensiering (figur 6D -F). Men pottenential av differensiering varieres avhengig av kilden til MSC-ene. Adipogene derivater av WJ-MSC-ene hadde 2 ganger høyere ekspresjonsnivå av de valgte adipogene gener (CEBPβ, FABP4, og PPAR-y) i forhold til CPJ-MSC-er. Cl- og FP-MSCene hadde den laveste ekspresjon av disse genene. I tilfelle av chondrogen differensiering, uttrykt CPJ-sentraler MSC-derivater valgt chondrogen gener (SOX9 og kol2) 50-ganger høyere enn de WJ- og FP-MSC-er derivater. I likhet med de dårlig adipogene differensiering av CL-MSCer, hadde de nedre chondrogen potensial, slik det fremgår av den laveste ekspresjon av chondrogen gener. CPJ-MSCene viste også den høyeste osteogene differensiering potensial, som indikert av de to-ganger høyere transkripsjonsnivåer av valgte osteogene gener (COL1, OPN, og OCN). Med uttrykket av progenitor markør RUNX2 var høyest i osteogene derivater av WJ-sentraler MSC, noe som indikerer at disse cellene var treg med å svare til differensierings betingelser. Igjen, CL-MSC viste dårligdifferensiering i osteogene avstamning. Disse resultater antyder at CPJ-MSCer og WJ-MSC-er vist en større differensiering potensial enn Cl- og FP-MSC-er. CL-MSCene hadde den laveste potensial til å differensiere til trelinjet derivater.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk av Isolering av celler fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta. Inspiser samles prøven og fortsette med disseksjon. Trinn 1. Manuelt dissekere og separere snor / placenta prøven inn i tre adskilte områder: navlestreng (UC), ledning-placenta knutepunkt (CPJ), og føtal placenta (FP). Skille de to adskilte soner av UC inn i ledningen foring (CL) og Wharton Jelly (WJ) ved hjelp av sakser og pinsetter. Trinn 2. Skjær hver av de dissekerte vev separat i 1-t-o 2 mm biter med saks og delvis fordøye bitene. Trinn 3. Kultur vevet stykker. Trinn 4. isolere cellene fra eksplantatene ved trypsinbehandling. Subkultur og karakterisere de isolerte celler. Trinn 5. isolert og karakterisert celler kan forsterkes og brukes til forskjellige anvendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Disseksjon og Culture of eksplantater fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta. Det er vist tre forskjellige anatomiske regioner av ledningen / placenta prøve: UC (delt inn i CL og WJ), CPJ, og FP, samt den tilhørende arterier og vener. CL, WJ, CPJ,og FP ble separert ved manuell dissekering for å isolere celler fra eksplantatene. Hver av de dissekerte regionene ble hver for seg kuttet opp i små fragmenter og dyrket i 75 cm 2 plater ved anvendelse av 9 ml av CM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Morfologi av isolerte celler fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta. (A) Celleutvekst fra eksplantatene av CL, WJ, CPJ, og FP, som visualisert ved LM. (B) subkultur av de isolerte celler fra CL, WJ, CPJ, og FP eksplantater viste fibroblastoid morfologi. Skalaen stolpe representerer 100 um (forstørrelse: 4X). (C) populasjons-fordoblingstiden tHan isolerte celler fra CL, WJ, CPJ, og FP. BM-MSC ble brukt som standard. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av de tre målinger (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: kolonidannende effektivitet av celler fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta. (A) Vekst av celler (P0) isolert fra CL, WJ, CPJ, og FP, sådd ut i en klonal tetthet på 1,63 celler / cm2, ble visualisert ved LM. (B) Mikrofotografier av celler farget med krystallfiolett som viser kolonidannende evne. (C) En koloni av celler farget with krystallfiolett. Skalaen søylene representerer 100 um (forstørrelse: 4X). (D) Grafisk representasjon av antall kolonier dannet fra cellene som stammer fra CL, WJ, CPJ, og FP. BM-MSC ble brukt som standard. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av de tre målinger (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Analyse av MSC markører som uttrykkes av celler isolert fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta. (A) Ekspresjon av mesenchymale overflatemarkører (CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105) av cellene fra CL, WJ, CPJ, og FP, som avskrekkeutvunnet ved flow-cytometri. (B og C) grafisk fremstilling av den prosentandelene av positive celler og de midlere fluorescensintensitet (MFI) forhold for de valgte mesenchymal overflatemarkører. MFI-forhold ble beregnet ved å dividere MFI-verdien for den markør (genereres av programvare basert på fluorescens-intensiteten av gated cellepopulasjoner) av MFI-verdien for den isotype. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av de tre målinger. (D) Ekspresjon av pluripotency gener (OCT4, Nanog, KLF4, og SOX2) av cellene fra CL, WJ, CPJ, og FP, som bestemt ved QRT-PCR. (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Genekspresjon ble normalisert til GAPDH og β-ACTIN, og de Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av de tre målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 6: multilineage Differensiering av MSC-ene isolert fra human navlestreng, Cord-placenta Junction, og Fetal Placenta. (A) Celler ble inkubert i adipogene differensiering medium i 3 uker og farget med Oil Red O, noe som indikerer tilstedeværelse av lipid-dråper. (B) Cellepelletene ble inkubert i chondrogen differensiering medium i 3 uker. Histologiske frysesnitt av pellet-kulturer ble farget med toluidinblått, viser tilstedeværelsen av glykosaminoglykaner. (C) Cellene ble inkubert i osteogene differensiering medium i 3 uker og farget med alizarin rød, viser fremstilling av kalkavleiringer som tyder benmineralisering. Alle bildene ble tatt av LM. Skalaen stolpe representerer 100 um (forstørrelse: 4X). BM-MSC vire brukt som en standard. (DF) Ekspresjon av utvalgte gener (CEBPβ, FABP4 og PPARy, SOX9, ACAN, og COL2, og COL1, RUNX2, OPN, og OCN representerer differensiering av MSC-ene til adipogene, chondrogen, og osteogene linjene, henholdsvis), som fastslått ved QRT-PCR-analyse (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Genekspresjon ble normalisert til GAPDH og β-ACTIN, og Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av de tre målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Gene primer sekvenser Produktlengde
OCT4 Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA 97
Reverse-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ Td>
Nanog fremtids AAAGAATCTTCACCTATGCC 110
revers GAAGGAAGAGGAGAGACAGT
KLF4 fremtids CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
revers TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
SOX2 fremtids TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 75
revers CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9 fremtids AGCGAACGCACATCAAGAC 85
revers CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
COL2 fremtids CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
revers CACCAGGTTCACCAGGATTG
EN BOKS fremtids AGCCTGCGCTCCAATGACT 103
COL1 fremtids AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 114
revers GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2 fremtids TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
revers AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN fremtids CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
revers TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN fremtids TAAACAGTGCTGGAGGCTGG 191
revers CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ fremtids TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
revers AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 fremtids TTAGATGGGGGTGTCCTGGT 158
revers GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPAR fremtids GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
revers ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH fremtids ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 101
revers GCCATCACGCCACAGTTTC
ACTIN fremtids AATCTGGCACCACACCTTCTAC 170
revers ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

Tabell 1: Liste over menneske Primer sekvenser brukt i denne studien.

Discussion

Nylige fremskritt innen stamceller ikke bare forbedret forståelse av grunnleggende utviklingsprosessene, men også gitt lovende muligheter for bruk av stamceller i bioteknologisk, farmasøytisk, celle terapi, regenerativ medisin, og vevsmanipuleringsteknikker for 18, 19, 20. Mens pluripotente ESCs isolert fra tidlige embryoer er den mest lovende, de møter tekniske utfordringer og etiske dilemmaer 21, 22, 23. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) avledet fra voksne celler tilveiebringe en alternativ, men også de står overfor tilsvarende tekniske og sikkerhetsmessige problemer 23. Videre iPSCs kan ikke være genetisk stabile, eller kan ha gjennomgått genetiske forandringer og begrenser således deres terapeutiske anvendelse. Stamceller har også blitt rapportert i en rekke postnatal tissaksøker og organer. Den vanligste kilde til disse ASCer er benmargen, adipose, og muskelvev. Imidlertid har ASCer fra postnatale kilder begrenset vekst og differensiering potensial 24, 25. De lider på grunn av aldring og eksponering for miljømessige påkjenninger og således er ikke alltid virkningsfulle for terapeutiske formål 26, 27, 28. Dette har ført oss og andre til å søke etter nye kilder til stamceller som er mer naivt enn ASCs.

Vi har undersøkt perinatale kilder for primitive stamceller som et alternativ til ASCs. I denne rapporten gir vi en pålitelig, robust og enkel metode for å isolere human-MSC fra ledning / placenta-prøver. I forhold til andre kilder og metoder som brukes for isolering av ASC, gir denne fremgangsmåte en effektiv og ikke-invasiv metode for isolering av store mengder av high-kvalitet MSC. Det fremhever videre den høyere vekst og differensiering potensial av perinatale MSCer forhold til MSC-er fra voksne kilder som BM.

UC feste fosteret til placenta er en stor organ med distinkte anatomiske regioner, inkludert to arterier, en vene, Cl, og WJ (vevet rundt blodkar). Flere studier har rapportert isoleringen av MSCene fra hele ledningen, WJ, eller placenta med variabel vekst og differensiering potensialene 25, 29. Ikke desto mindre, til dags dato ingen studie er effektivt undersøkt, med de cellene fra forskjellige anatomiske regioner av ledningen / placenta prøven. Vi gir her en systematisk og enkel metode for disseksjon av UC, CPJ, og tilkoblet FP for isolering av MSCene. Vi viser også en omfattende og enkel protokoll for å karakterisere og evaluere kvaliteten av de isolerte cellene ved å bestemme deres spredning capabilities, samt deres selvfornyelse og differensiering potensialer. Denne fremgangsmåte er reproduserbar og gir en stor mengde av overlegen kvalitet MSC-er.

Vi har funnet at den partielle oppslutning av vevsstykkene 1-2 mm i størrelse ved anvendelse av en kommersiell trypsinoppløsning reproduserbart overgitt celler fra eksplantatene, mens den fullstendige nedbrytning av vev inn i enkeltceller hadde dårlige utbytter av isolerte celler. Men en studie rapporterte at større vevseksplantater av UC omtrent 10 mm i størrelse var optimal for celleisolasjon 30. Omvendt, en annen studie antydet at den vevseksplantatet metoden resulterte i en lengre syklus kultur og lavere utbytte av celler sammenlignet med enzymkutting metode 31. I tidligere rapporter, vev ved behandling av ledningen med kollagenase II og hyaluronidase, hver for seg eller som følge av trypsin, har blitt utført for å isolere ledningen celler 32, 33 34. Ikke bare er det en stor variasjon i fordøyelses metoder for ledningen vev før dyrking, men også de isolerte celler syntes å være heterogene. Bruken av sterke enzymer for lengre tidsperioder kan degradere cellemembranen, som påvirker celle-adhesjon og spredning. Resultatene av denne fremgangsmåte viste at delvis fordøyd perinatale vevseksplantater tilgjengelig utvekst av celler uten å forårsake omfattende celleskade, vedlikeholdes levedyktighet, og ga høyere mengder homogene populasjoner av MSC-er.

Mens protokollen for disseksjon og isolering av celler fra eksplantatene er enkel, kan noen av trinnene vise seg å være utfordrende. Først sikre eksplantat tilslutning ved at deres festing til overflaten av kulturflaske. Dette kan lettes ved anvendelse av en liten mengde av mediet, bare dekker vevsstykkene for de første 2 timer av kulturen, og deretter forsiktig tilsetning av den resterende medium. Second, begrense antall eksplantater til mindre enn 15 per T75-kolbe. For lite mellomrom mellom de stykker eller for mange deler pr kolbe er hemmende for celleutvekst. Tredje, vevsstykkene som ikke kleber til overflaten av dyrkningskolben, etter 3 dagers inkubering skal overføres til en ny flaske, for tilslutning og dyrking. Fjerde, vevsstykkene å dyrkes bør være fri for cellerester, som inhiberer festing. Femte, dyrking av store stykker krever mer medium og ikke forbedrer celle utvekst effektivitet. Til slutt, overvåke eksplantatet kulturene tett, særlig etter utseendet av celleutvekst, som cellene kan raskt blir sammenflytende og differensiere avhengig av vevskilde. Noen få begrensninger ved teknikken omfatter en mangel på kunnskap i dissekere prøvene for å skille CL, WJ, CPJ, og FP; en liten prøvestørrelse, noe som resulterer i lav WJ utbytte; og forsinkede behandlings-prøvene som er nødvendig for å bli behandlet i løpet av 2-4 timer for samling til avoid et tap i cellegjenvinning.

Gullstandarden for karakterisering av MSCene er evnen til å overholde plastisk, danner det fibroblastiske fenotype, og skille ut flere linjene. Dette er også vanlig anvendte kriterier for å definere MSCer som beskrevet av ISCT 35. I denne studien var celler isolert fra alle fire kilder var vedhengende plast og hadde positive uttrykk for MSC-markører (CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105), men negative uttrykk for det hematopoetiske markør CD45. I tillegg er det uttrykt humant leukocyttantigen (HLA) klasse I, men var negative for HLA klasse II. Sammenlignet med BM-MSCer, WJ- og CPJ-avledede celler var høyere. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporter om UC-avledet MSC 33, 36, 37, 38. I tillegg er våre resultater viste at Cl-, WJ-, CPJ-, FP-MSC uttrykt pluripotens gener som OCT4, Nanog, og SOX2; imidlertid, deres ekspresjon var lavere enn for ESCs, som rapportert tidligere 39. Disse resultatene var også i overensstemmelse med en tidligere undersøkelse som rapporterte ekspresjon av pluripotency markører i perinatal-celler avledet fra 40. Interessant nok ble det observert at ekspresjonen av pluripotent markør var høyere i CPJs-MSC-er enn i celler isolert fra andre kilder. Det ble også lagt merke til at UC-MSC viste større selvfornyelse potensial enn BM-MSC 41. Interessant, til tross for likheten i fenotypiske egenskaper, de celler isolert fra de fire kildene hadde variable CFE-verdier. Men bortsett fra FP-MSC, de alle hadde bedre CFE verdier enn BM-MSC. CPJ-MSCene hadde den høyeste CFE-verdi og hastigheten av proliferasjon sammenlignet med alle andre MSC-er. I tillegg WJ- og CPJ-MSC-er vises høyere differensieringspotensialer enn BM-MSC-er. CL-MSC viste minst differensieringpotensiell inn i alle tre cellelinjer (dvs. adipogene, chondrogen, og osteogene), mens CPJ-MSCene hadde den høyeste trelinjet differensiering potensial og FP-MSCene vises det minste adipogene differensiering potensial.

I konklusjonen, våre resultater viste at kvaliteten og kvantiteten av isolerte MSC skilte mellom de fire kilder i ledningen / placenta prøve. CPJ-MSC hadde mer spredning kapasitet og høyere selvfornyelse potensial. De var også potente i deres differensiering i de trelinjet celletyper. På grunn av deres lave doblingstiden, kan CPJ-MSCer være raskt utvidet 1000 ganger og anvendt for high-throughput medikament eller biomateriale screening. Disse cellene kan være en mer lovende kilde for celleterapi og anvendelser av regenerativ medisin.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Studien ble støttet av OU-WB ISCRM, Oakland University og Michigan Head and Spine Institute. N. Beeravolu og C. McKee mottatt Provost Graduate Research Award fra Oakland University. Vi setter pris S. Bakshi for gjennomgang av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM with 4,500 mg/mL glucose Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Tags

Developmental Biology perinatal navlestreng Cord-placenta Junction placenta Mesenchymale stromale celler MSC markører multipotente celler Pluripotent markører
Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri,… More

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter