Introduction
Volgens de World Health Organization (WHO), influenza infecteren 5-10% van de volwassenen en 20-30% van de kinderen en veroorzaken jaarlijks 3-5.000.000 ernstig ziek maken en tot 500.000 sterfgevallen wereldwijd 1. Jaarlijkse inentingen tegen griep blijft de beste optie om de ziekte te voorkomen. Inspanningen, zoals de WHO Global Action Plan hebben seizoensgebonden vaccin gebruik, de productie van vaccins capaciteit, en onderzoek en ontwikkeling verhoogd naar meer potente vaccins strategieën om de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met seizoensgebonden influenza-uitbraken 2 te verminderen. Antivirale middelen zoals neuraminidase-remmers (bijv Zanamivir en Oseltamivir) zijn verkrijgbaar in sommige landen en bij het verminderen van de symptomen effectief zijn gebleken, wanneer het wordt toegediend binnen de eerste 48 uur na het optreden 3, 4, 5. Ondanks de wereldwijde inspanningen, inperking van seizoensgriep outbreaks blijft een geweldige uitdaging op dit moment, zoals influenzavirus antigene drift overschrijdt vaak actuele vermogen aan te passen aan de veranderende genoom van het virus 6. Vaccin strategieën gericht op nieuwe stammen van het virus moeten worden ontwikkeld op voorhand en zijn soms minder dan optimaal effectief gemaakt door onvoorziene veranderingen in de aard van de stammen die uiteindelijk de overhand hebben in een influenza-seizoen. Daarom is er duidelijk behoefte aan alternatieve therapeutische strategieën die infecties en vermindering van sterfte ontwikkelen. Door een beter begrip van de host-virus interactie, kan het mogelijk zijn om nieuwe anti-influenza medicijnen en adjuvante therapieën 7, 8 ontwikkelen.
De menselijke gastheer-influenza A virus (IAV) interactie complex. Verschillende diermodellen van menselijke besmetting IAV zijn ontwikkeld om inzicht te krijgen in de host-virus interactie, including muizen, cavia's, katoen ratten, hamsters, fretten, en makaken 9. Terwijl het verstrekken van belangrijke gegevens die het begrip van gastheer-IAV dynamiek hebben verbeterd, elk model organisme bezit belangrijke nadelen die moeten worden overwogen bij een poging om de bevindingen te vertalen naar de humane geneeskunde. Bijvoorbeeld, muizen, die de meest gebruikte model zijn, niet gemakkelijk te ontwikkelen IAV-geïnduceerde infectie symptomen wanneer besmet met humane influenza-isolaten 9. Dit komt omdat muizen niet de natuurlijke tropisme voor humane influenza-isolaten sinds muis epitheelcellen tot expressie α-2,3 siaalzuurkoppelingen plaats van de α-2,6 siaalzuurkoppelingen uitgedrukt op menselijke epitheelcellen 10. De hemagglutinine eiwitten die in humane isolaten IAV gunstig binden en voer gastheer cellen die α-2,6 siaalzuurkoppelingen doorgaande receptor veroorzaakte endocytose 9, 11, 12, 13. Bijgevolg wordt nu aangenomen dat bij de ontwikkeling muismodellen voor humane influenza, zorg moet worden afgegeven bij een stam van muis paren met de geschikte stam van influenza om ziekte fenotypes die aspecten van de menselijke ziekte recapituleren bereiken. Daarentegen epitheelcellen in de bovenste luchtwegen van fretten bezitten α-2,6 siaalzuurkoppelingen dat menselijke cellen 14 lijken. Geïnfecteerde fretten hebben veel van de pathologische en klinische kenmerken waargenomen in de menselijke ziekten, met inbegrip van de pathogeniteit en overdraagbaarheid van de menselijke en het vogelgriepvirus 14, 15. Ze zijn ook zeer vatbaar zijn voor werkzaamheid van het vaccin studies. Toch is de fret model voor humane influenza heeft een aantal nadelen voornamelijk verband houden met hun omvang en de kosten van de veehouderij die overname te maken van statistisch significant data uitdagend. Bovendien hebben fretten eerder weergegeven verschillen in farmacokinetica drug, biobeschikbaarheid en toxiciteit die bepaling van de doelmatigheid bemoeilijken. Bijvoorbeeld, fretten vertonen toxiciteit voor de M2 ionkanalen inhibitor amantadine 16. Aldus is het duidelijk dat de keuze van een diermodel om vragen over menselijke iav infecties te bestuderen, is het belangrijk de inherente voordelen en beperkingen, en het aspect van de host-virus interactie die wordt onderzocht overwegen.
De zebravis, Danio rerio, een diermodel dat unieke mogelijkheden biedt voor het onderzoeken van microbiële infectie, gastheer immuunrespons en potentieel geneesmiddel therapieën 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. De aanwezigheid van α-2,6-gekoppelde siaalzuren aan het oppervlak van cellen in de zebravis voorgesteld de gevoeligheid voor IAV, die in infectie studies werd gedragen en afgebeeld in vivo onder toepassing van een fluorescerende reporter stam van IAV 19. In IAV geïnfecteerde zebravis, verhoogde expressie van de antivirale ifnphi1 en MXA transcripten aangegeven dat een aangeboren immuunreactie werd gestimuleerd en de pathologie weergegeven IAV geïnfecteerde zebravis, waaronder oedeem en weefsel, vergelijkbaar met dat voor humaan influenza . Bovendien is de IAV antivirale neuraminidase remmer Zanamivir beperkte mortaliteit en verminderde virale replicatie in de zebravis 19.
In dit rapport, een protocol voor het initiëren van het systeemic IAV infecties in de zebravis embryo's wordt beschreven. Het gebruik van zanamivir bij klinisch relevante doses als een proof-of-principle, is het nut van deze zebravis IAV infectie model voor het screenen van verbindingen voor antivirale activiteit aangetoond. Daarnaast is een protocol voor het genereren van een gelokaliseerde infectie epitheliaal IAV in de zebravis zwemblaas, een orgaan dat wordt beschouwd als anatomisch en functioneel analoog aan het zoogdier longen 21, 29, 30, 31 zijn beschreven. Gebruik van deze gelokaliseerde iav infectiemodel kunnen neutrofiel rekrutering van de plaats van infectie worden gevolgd, zodat onderzoek naar de rol van neutrofielen biologie IAV infecties en ontstekingen. Deze zebravismodellen vult bestaande diermodellen van humane IAV infecties en zijn bijzonder bruikbaar voor het testen van kleine moleculen en immuuncel respons vanwege de mogelijkheid van verhoogde sTATISTISCHE vermogen, vermogen tot matige hoge throughput assays en het vermogen om immuuncellen gedrag en functie volgen met lichtmicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd met behulp bioveiligheidsniveau 2 (of BSL2) standaarden beschreven door de Amerikaanse Centers for Disease Control (CDC) en in overeenstemming met de door Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) richtlijnen. Gelieve te overleggen met de juiste ambtenaren om de veiligheid en de naleving te waarborgen.
1. zebravis Onderhoud
- Paaien zebravis en verzamel het vereiste aantal embryo's voor de experimenten. Indien nodig, massa kweekbakken, zoals die beschreven door Adatto et al. 32, kan worden gebruikt om grote aantallen ontwikkelingsgebied-gefaseerde embryo's te verzamelen.
- Laat embryo's te ontwikkelen tot de gewenste ontwikkelingsstadium (48 uur na de bevruchting voor een systematische IAV infectie [deel 3] of 5 dagen na de bevruchting voor een gelokaliseerde, blaasontsteking zwemmen [deel 4]) in diepe petrischaaltjes bij lage dichtheid (< 100 embryo's / gerecht) bij 28 ° C in steriel ei water met 60 ug / ml zeezout (bijvoorbeeld Instant Oceaan) in gedestilleerd water.
- Het verwijderen van dode embryo's met plastic overdracht pipetten en verander ei water per dag om een optimale gezondheid en ontwikkeling te waarborgen.
2. Voorbereiding van de materialen en reagentia
- Bereid een 4 mg / ml voorraad oplossing van tricaïne-S (de pH instellen op 7,0-7,4) in gedestilleerd water en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C.
- Trek borosilicaatglas capillairen met filamenten met behulp van een micropipet trekker (bijv Micropipet Puller met de volgende instellingen: drukinstelling = 100, warmte = 550, trekt = [geen waarde], snelheid = 130, time = 110).
OPMERKING: Vóór knippen van de naald, de lengte waar de naald begint taps naar de punt van de naald zou ongeveer 12-15 mm. Dit kan echter variëren op basis van voorkeur en toepassing. Een langere, meer geleidelijke tapsheid kan meer de voorkeur vanwege de toegenomen vermogen om de embryo doorboren en de verlaagde risk van de naald buigen of breken. - Smelt 2 g agarose in 100 ml ei water met behulp van een magnetron. Maak platen waarop line-up en injecteer de embryo's door het gieten van gesmolten agarose in diepe petrischalen en te laten stollen.
- Maak een 10 mg / ml voorraad van zanamivir in nuclease-vrij water. Aliquot en bevriezen bij -20 ° C.
- Smelt 0,5 g agarose in 50 ml ei water met behulp van een magnetron te maken embryo montage agarose. Handhaven waterbad van 50 ° C tot gebruik bij beeldvorming.
3. Systemische IAV Infection (48 uur na de bevruchting)
LET OP: Alle onderzoek personeel moeten overleggen met hun begeleiders en artsen met betrekking tot de vaccinatie vóór de aanvang van de werkzaamheden met de IAV.
- Handmatig dechorionate embryo op de dag van het experiment met behulp van # 5 tang. Zorg verwijderen en inslapen embryo's die zijn geblesseerd tijdens het proces 200 ug / ml tricaïne oplossing.
- voorbereiding of IAV voor Micro-injectie
OPMERKING: Stammen die is aangetoond dat zebravis embryo infectieziekten influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) en de fluorescente reporter influenza stam NS1-GFP 33. Details over APR8 en X-31, en andere stammen, kan gevonden worden op de Influenza Onderzoek Databank- Propageren NS1-GFP-stam van IAS op geëmbryoneerde kippeneieren zoals eerder beschreven 34, 35. Verzamelen aliquot en het titreren allantoïsvocht dat iav en bewaar bij -80 ° C. Pre-getitreerd APR8 en X-31 virussen kunnen commercieel worden aangeschaft.
- Net voor infectie, snel ontdooien een IAV hoeveelheid in gehandschoende handen en vervolgens snel te plaatsen op ijs om het verlies van titer te verminderen.
- viral verdunning
- Als u de APR8 of X-31 virussen, te verdunnen tot 3,3 x 10 6 ei infectieuze dosis 50% (EID50) / ml in steriele, ijskoude PBS supplemteerde met 0,25% fenol rood (om te helpen bij de visualisatie) in een laminaire stroming kap. Tegelijkertijd het opzetten van een controle met steriele PBS met 0,25% fenol rood.
- Bij gebruik NS1-GFP-stam 33 verdund tot ~ 1,5 x 10 2 plaquevormende eenheden (PFU) per nl in steriele, ijskoude PBS met 0,25% fenolrood (om te helpen bij visualisatie) in een laminaire stroming kap. Tegelijkertijd het opzetten van een controlegroep met allantoïsvocht van geïnfecteerde kippeneieren verdund als het virus in steriele PBS met 0,25% fenol rood.
- Handhaaf IAV op ijs pas klaar voor gebruik.
- Pipet virusoplossing in micro-injectie naalden gebruikt microloader tips vlak voor gebruik. Steek micro-injectie naald in de juiste houder van de injectie-inrichting (bijv MPPI-3 druk injectiesysteem).
- Tijdens het bekijken van onder de stereo microscoop, voorzichtig clip de micro-injectie naald met scherpe, gesteriliseerde # 5 tang.
NB: Het is recommenDED dat de micro-injectie tip geleidelijk worden afgekapt. - Druk het voetpedaal van de druk inspuitsysteem en injecteer in een daling van de microscoop immersie olie op een kalibratie micrometer. Meet de diameter van de druppel. Bereken het volume van de druppel met de formule V = 4 / 3πr 3, waarbij V het volume nl en r de straal in urn.
OPMERKING: Als de daling diameter te klein is, kunnen extra glas worden geknipt of de druk en de timing instellingen kunnen worden aangepast. Als de druppel diameter te groot is, kan de druk en timing instellingen worden aangepast. - Bandenspanning en timinginstellingen van de druk injector en / of reclip de naaldpunt tot het gewenste injectievolume is bereikt (gewoonlijk 1-3 nl). Drukinstellingen tussen 20 en 30 psi en pulsduur omgeving tussen 40 en 80 msec zijn typisch. Stel tegendruk zodat het tellers capillaire druk, maar niet lek IAV (netto nul druk).
- Propageren NS1-GFP-stam van IAS op geëmbryoneerde kippeneieren zoals eerder beschreven 34, 35. Verzamelen aliquot en het titreren allantoïsvocht dat iav en bewaar bij -80 ° C. Pre-getitreerd APR8 en X-31 virussen kunnen commercieel worden aangeschaft.
- Lijn Embryo's voor injectie
- Verdoven dechorionated embryo's in 200 ug / ml tricaïne.
- Zodra de beweging ophoudt, transfer 10-20 embryo's tot een 2% agarose plaat (opgesteld in paragraaf 2.3) met een plastic pipet. Gebruik plastic pipet om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Voorzichtig uitlijnen embryo's voor micro-injectie met een brand-gepolijst en verzegeld borosilicaatglas capillair. Met behulp van een stereo-microscoop, voorzichtig oriënteren embryo's, zodat het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal is in lijn met de micro-injectie naald (Figuur 1A).
- IAV Micro-injectie
- Steek de micro-injectie naald in het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal. Druk voetpedaal om de gewenste hoeveelheid IAV injecteren in de bloedsomloop van het embryo (Figuur 1A). Embryo's kunnen meerdere keren worden geïnjecteerd indien nodig.
LET OP: De injectie bolus moet worden geveegd in de circulatie en distribbijge- hele lichaam. Als injectievolume verzamelt op de plaats van injectie, verwijder embryo van experiment en euthanaseren. - Herhaal injecties op verschillende embryo controleoplossing specifiek voor de stam van het virus gekozen. Voor APR8 en X-31, gebruik maken van de in paragraaf 3.2.2.1 beschreven controle; voor de NS1-GFP, gebruik maken van de in paragraaf 3.2.2.2 beschreven controle.
- Steek de micro-injectie naald in het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal. Druk voetpedaal om de gewenste hoeveelheid IAV injecteren in de bloedsomloop van het embryo (Figuur 1A). Embryo's kunnen meerdere keren worden geïnjecteerd indien nodig.
- Transfer embryo's gelabelde platen met steriel ei water en plaats in incubators bij 33 ° C.
OPMERKING: Geïnfecteerde embryo's worden gekweekt bij 33 ° C om verbeterde virale replicatie ondersteunen. Bovendien, incubatie bij 33 ° C beter bootst de temperatuur van het menselijke bovenste luchtwegen, die in nauw contact met lagere temperaturen in de externe omgeving en is waar iav besmettingen. Embryo's kunnen wennen aan een breed temperatuurbereik 34.
4. Gelokaliseerde, Swim Blaas IAV Infectie in Tg (MPX: mCherry)
- Bereiding van IAV voor Microinjection
- Verdun de NS1-GFP-stam en controle oplossing voor injectie zoals beschreven in paragraaf 3.2.
- Bereid naalden zoals beschreven in paragraaf 2.2.
- Lijn Tg (MPX: mCherry) 35 larven die opgeblazen zwemblazen zoals beschreven in paragraaf 3.3 met de volgende uitzondering. Lijn larven zodanig dat de naald de zwemblaas kunnen doorboren en het virus kan worden gestort op de achterkant van de zwemblaas, zoals eerder beschreven 36 (Figuur 2A).
- IAV Micro-injectie
- Steek de micro-injectie naald in de zwemblaas en injecteer het gewenste volume (bv 5 nl) naar de achterkant van de structuur (Figuur 2A).
OPMERKING: De injectie bolus te verzamelen in de richting van het achterste en de zwemblaas van de luchtbel moet be verplaatst naar voren. GFP expressie moet beginnen worden waargenomen op 3 uur na injectie. - Herhaalde injecties controleoplossing specifiek voor de virusstam gekozen, zoals beschreven in paragraaf 3.4.2.
- Steek de micro-injectie naald in de zwemblaas en injecteer het gewenste volume (bv 5 nl) naar de achterkant van de structuur (Figuur 2A).
- Transfer larven platen met steriel ei water en plaats in incubators bij 33 ° C.
5. Antivirale Drug Treatment
NB: De onderstaande protocol beschrijft de Zanamivir behandeling eerder aangetoond in Gabor et al. 19. Dit protocol kan worden aangepast om andere antivirale middelen screenen en het potentieel worden aangepast om meerdere verbindingen in een 96 wells plaat, high-throughput screening format.
- Op 3 uur na infectie, vervang ei water van NS1-GFP-and-control besmette vis met steriel ei water met 0, 16,7 of 33,3 ng / ml Zanamivir.
Opmerking: Deze concentraties werden gekozen om te trachten de fysiologische niveaus bereikt fo replicerenllowing toediening van zanamivir bij menselijke patiënten (100, 200, of 600 mg, iv, tweemaal daags of 10 mg geïnhaleerd, tweemaal daags). De serumconcentraties bij menselijke patiënten varieerde 9,83-45,3 ng / ml 36. - In de loop van 5 dagen, veranderen ei water elke 12 uur en te vervangen door steriele ei water met daarin de juiste hoeveelheid zanamivir.
- Track Course van infectie.
- Verdoven zebravis in 200 ug / ml tricaïne. Monitor GFP expressie door stereo fluorescentiemicroscopie verschillen in infectie patronen tussen IAV-geïnfecteerde en controle vis en tussen de vis ondergedompeld in de verschillende concentraties van geneesmiddelen visueel observeren.
- Volg morbiditeit en mortaliteit in de loop van 5 dagen.
- Record observaties over infectie dynamiek gerelateerd aan de ziekte pathologie, waaronder tekenen van lethargie en het bewijs van oedeem, verschillen in pigmentatie, oculaire en craniofaciale misvormingen, en lordose. pathologietypisch blijkt controle geïnfecteerde vissen bij 24-48 uur na injectie, afhankelijk van de hoeveelheid virus ingespoten. Verzamel beelden 24 uur na injectie.
- Om de 24 uur gedurende 5 dagen na infectie, noteert u het aantal doden, ziekelijk, en gezonde larven. De dood wordt bepaald door de afwezigheid van een merkbare hartslag. Plot gegevens zoals gewenst. Bijvoorbeeld plotgegevens als gestapelde staafdiagram met percentages van gezonde, ziekelijk of dode vissen uitgezet op de y-as en de behandelde groep op de x-as. 19
LET OP: De sterfte kan worden gescoord door Kaplan-Meier survival schattingen. Afhankelijk van de toepassing, kan het zinvol zijn om alternatieve benaderingen voor het scoren vis morbiditeit, met inbegrip van een scoring matrix die de mate van morbiditeit op basis van de eerder genoemde pathologische kenmerken waargenomen kunnen kwantificeren ontwikkelen. - Neem contact op met een statisticus te zijn om de juiste statistische analyses toe te passen.
6. neutrofielen migratie
LET OP: De onderstaande protocol beschrijft een methode voor het bijhouden van neutrofielen migratie naar de zwemblaas na een gelokaliseerde, epitheliale IAV infectie. De beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om de effecten van genetische en chemische manipulaties testen. Met deze techniek is het mogelijk om de onderliggende mechanismen neutrofiel karakteriseren, bij een IAV infectie.
- Montage zebravis for Imaging
- Verdoven larven te beelden in 200 ug / ml tricaïne.
- Transfer een individuele Tg (MPX: mCherry) larve die is geïnfecteerd met NS1-GFP een putje van een 24 goed, glazen bodemplaat in een kleine druppel ei water (~ 50-100 pi). Herhaal dit met andere IAV-geïnfecteerde en controle vis.
- Voeg langzaam 1% agarose embryo montage media aan elk putje (paragraaf 2.5), het verzorgen grote luchtbellen te introduceren.
- Voorzichtig de positie van de larve passen zodat het op zijn kant is geplaatst.Goody en Henry 37 beschrijven hoe probes die goed functioneren in deze applicatie gebruik van insect pinnen die in borosilicaatglas capillairen met filamenten zijn gemonteerd en superglued in de plaats te maken.
- Zodra de agarose verhardt, voorzichtig de afzonderlijke putjes te vullen met ei water die 200 ug / ml tricaïne.
- Met een confocale microscoop, capture az stack reeks helderveld en fluorescentie beelden met behulp van een 20x doelstelling gericht op de zwemblaas.
- Stel de boven- en ondergrens zodat ze allemaal zichtbaar waarneembare groene en rode fluorescentie vangen.
- Maak foto's op 2,0 psec / pixel met de stappen die zijn ≤ 4 micrometer. Het verhogen van de tijd per pixel en het verminderen van de afstand tussen de stappen (bv 0,5-1,0 pm) verhoogt de beeldresolutie en kwaliteit.
- Genereer een twee-dimensionaal beeld door het samenvoegen van lagen.
- Vergelijk het aantal MPX-mCherry-positieve neutrofielen aanwezig in de zwemblazen van IAV-geïnfecteerde and-control geïnjecteerd zebravis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier elementen waaruit blijkt hoe IAV systemische infectie bij zebravis kan worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen (Figuur 1A) testen worden voorzien. Embryo's in 48 uur na de bevruchting zijn geïnjecteerd met APR8 (figuren 1C, 1F), X-31 (figuren 1D, 1G) of NS1-GFP (Figuur 1H-1I) via het kanaal van Cuvier een virale infectie initiëren. Een ander cohort van embryo's op 48 uur na de bevruchting werden geïnjecteerd om te dienen als controles voor virale infectie (Figuren 1B, 1E). Bij 48 uur na infectie, zebravis geïnjecteerd met IAV vertoonden bewijs van pericardiale oedeem (figuren 1C, 1D) en circulatiestilstand (Figuur 1F), met erytrocyten gehele hartzakje (figuur 1G) aanwezig. Gebruik NS1-GFP, de initiële expressie van GFP door fluorescentiemicroscopie al 3 uur na de infectie werd waargenomen. Op dat moment werden blootgesteld aan een zebravis 33,3 ng/ Ml dosis van het neuraminidase remmer Zanamivir. Deze dosis is ongeveer gelijk aan de 200 mg dosis aan humane patiënten. Controle besmette vis niet blootgesteld aan zanamivir (figuren 1H, 1H) vertoonde kenmerken van oedeem en systemische GFP expressie. Verminderde bruto pathologie en GFP fluorescentie (figuren 1I, 1I ') in het NS1-GFP-geïnfecteerde larven blootgesteld aan zanamivir waargenomen. De vermindering van GFP was het meest merkbaar in de lichamen van larven, terwijl zeer weinig verandering in de dooier zakken werd waargenomen. Vis behandeld met zanamivir vertoonden minder morbiditeit, zoals blijkt uit een verbeterde zwemmen beweeglijkheid en verminderde niveaus van oedeem in het hart, en een verbeterde overleving. Deze bevindingen aanvulling op een meer uitgebreide studie en 19 tonen de waarde van dit model voor drug screening.
Een gelokaliseerde zebravis zwemblaas infectie model 31 is aangepast voor IAV Infectie. NS1-GFP virus werd geïnjecteerd in de zwemblazen van 5 d post-bevruchting Tg (MPX: mCherry) larven van een gelokaliseerde, epitheliale infectie (Figuur 2A) te starten. PBS werd geïnjecteerd in de zwemblaas als controle om de specificiteit van neutrofielen rekrutering richting IAV-geïnfecteerde cellen vertonen. De werving van mCherry-gelabelde neutrofielen in de zwemblaas werd bijgehouden. Op 20 uur na infectie een aanzienlijke migratie van neutrofielen in de zwemblazen van IAV geïnfecteerde vis ten opzichte van PBS-geïnjecteerde controles (figuur 2B, 2B, 2C, 2C) waargenomen. Deze gegevens tonen aan dat neutrofielen IAV kan rekruteren van de zwemblaas, zoals het rekruteert neutrofielen de menselijke long.
Figuur 1: Antivirale medicamenteuze behandeling vermindert de ernst van IAV infectie in de zebravis. (A (B - I) Bruto pathologie en GFP-fluorescentie van de zebravis embryo geïnjecteerd in het kanaal van Cuvier met IAV. (BG) Vis geïnfecteerd met IAV en onderzocht op 48 uur na infectie tekenen van virale infecties en ziekten. (B - D) Single focale vliegtuigen van de controle of IAV-besmette vis werden verzameld (zijkant gemonteerde, voorste linker, dorsale top, 4x vergroting, schaal bar = 500 pm). (B) controlevissen werden geïnjecteerd met PBS en normale morfologie weergegeven. (C - D) Embryo's geïnfecteerd met APR8 (C) of X-31 (D) gewoonlijk vertoonde pericardiale oedeem (gevulde pijl). Embryo's hadden ook necrose, duidelijk in (C). (E) controlevissen werden geïnjecteerd met PBS en geen aanwijzingen voor pathologie (schaalbalk = 250 pm) weergegeven. (F) Embryo's die besmet zijn met APR8 toont circulatiestilstand (gekerfd pijlpunt, schaal bar = 250 pm). (G) Embryo geïnjecteerd met X-31 influenza geeft zowel pericardiale oedeem (pijl) en samengevoegd erytrocyten in heel het hartzakje (gekerfd pijlpunt, schaal bar = 100 pm). (H, I) Vertegenwoordiger beelden die effecten van een antiviraal geneesmiddel op IAV-geïnfecteerde zebravis (schaal bar = 200 pm). (H) Helderveld en (H ') image fluorescentie toont een embryo geïnjecteerd met NS1-GFP (geen antivirale behandeling met geneesmiddelen). Let op oedeem en GFP expressie in het bijzonder in de gemeenschappelijke kardinaal ader regio. (I, I ') behandeling met een antiviraal geneesmiddel verkleinde infecterenion, zoals blijkt uit verminderde pathologie, zoals verminderde oedeem, en verminderde GFP expressie in de witte gestippelde omtrek van het lichaam, met name in de vasculatuur, wat duidt op de virale belasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: neutrofielen worden gerekruteerd naar sites van gelokaliseerde IAV infectie. (A) Schematische het aantonen van de injectie aanpak die nodig is om een gelokaliseerde IAV infectie te starten in een opgeblazen zebravis zwemblaas 5 d post-bevruchting. (B, C) neutrofielen werving voor de zwemblaas volgende NS1-GFP infectie. Z-stack beelden (4 micrometer stappen) werden verzameld door confocale microscopie (20x vergroting). Beelden werden platgeschroefd zijn in twee dimensies (de zijkant gemonteerde, voorste links, dorsale boven). Tg (MPX: mCherry) zebravis (5 d na de bevruchting) werden geïnjecteerd met (B, B ') Allantoïsvocht verdund met PBS en 0,25% fenol rood of (C, C') NS1-GFP (7,2 x 10 2 PFU / embryo) verdund in allantoïsvocht en PBS met 0,25% fenol rood. Op 16 uur na infectie, neutrofielen aanwezig in een IAV-geïnfecteerde zwemblaas waren (C, C ': groene fluorescentie toont gelokaliseerde infectie; C': rode bloedcellen zijn neutrofielen, witte pijl identificeert vertegenwoordiger neutrofielen). (B, B ') Geen bewijs van GFP expressie indicatief IAV infectie en geen rekrutering van neutrofielen naar de zwemblaas waargenomen in de larven geïnjecteerd met het allantois in PBS. Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de voordelen verkregen uit een klein proefdiermodel voor menselijke gastheer-pathogeen interacties modelleren maximaliseren, is het belangrijk om vraagstellingen en testen hypothesen die kapitaliseren op de inherente voordelen van het modelsysteem omlijsten. Als model voor de menselijke IAV infectie, de zebravis heeft een aantal sterke punten, met inbegrip van hoge vruchtbaarheid, optische helderheid, ontvankelijkheid voor drug discovery, en de beschikbaarheid van transgene lijnen die immuuncellen zoals neutrofielen labelen. De zebravis is ontwikkeld als een steeds krachtig alternatief voor het muismodel voor de studie van ontsteking en aangeboren immuniteit. Omdat ze niet een goed functionerende adaptieve immuunrespons in de eerste 4-6 weken van de ontwikkeling, de zebravis mount aangeboren immuunrespons te beschermen tegen verwondingen en infecties 37. Gedurende deze vroege periode in de ontwikkeling, is het mogelijk om te isoleren en te bestuderen mechanismen van de antivirale respons die door de aangeboren immuunrespons alleen. ThiHet werk is vergemakkelijkt door de ontwikkeling van transgene zebravis lijnen zoals Tg (MPX: mCherry), die neutrofielen labels met een fluorescerende eiwit.
Zebravis modellen voor IAV infectie die ziekte bij de mens lijken werden onlangs beschreven 19. Aangetoond werd dat zebravis bezitten α-2,6-gekoppeld siaalzuur residuen op de cellen die voorzien IAV virussen het tropisme te binden, hechten en in cellen. In dit manuscript en Gabor et al. 19, is gebleken dat twee verschillende stammen van IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] en X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), alsmede de recombinant NS1-GFP-stam die resulteert in GFP vertaling in geïnfecteerde cellen kunnen infecteren, repliceren en mortaliteit bij injectie in de bloedsomloop van larvale zebravis. Injectie van het virus is essentieel voor deze infectie methode blootstelling aan IAV via onderdompeling niet betrouwbaar. Besmette vis moet de overdracht zijnrode een 33 ° C incubator om virale replicatie te waarborgen. Het is belangrijk op te merken dat de menselijke luchtwegen, waarbij influenza infecties optreden, typisch 33 ° C. Incubatie bij 28 ° C, wat typischer gedurende zebravis incubatie nalaat een betrouwbare infecties. Voorts is het essentieel om testen elk door de fabrikant of de partij IAV partij geproduceerd voor gebruik in een experiment van de variabiliteit die infectiviteit en ziekteprogressie treft bij de zebravis. Wanneer de infectieve dosis correct getitreerd moet de meeste zebravis geïnfecteerd met deze stammen van IAV grove ziekte fenotypes gekenmerkt door oedeem vertonen, reeds 24 uur na infectie, die progressief verergeren, craniofaciale afwijkingen van 48 uur na infectie, lordose van 72 uur na infectie, en ongeveer 50% moeten bezwijken voor de infectie door 5 d na infectie. Histopathologie op 48 uur na infectie moet het bewijs van Gill, hoofd nieren, en omvattenlevernecrose, evenals indicaties van vocht in het hartzakje. Bij het vaststellen van deze bevindingen de voorspelbare resultaat van een IAV infectie bij zebravis is het mogelijk om het scherm kandidaat anti-influenza geneesmiddelverbinding kandidaten. Met dit in het achterhoofd, een proof-of-principle protocol voor het screenen van een antiviraal geneesmiddel op basis van oorspronkelijke bevindingen in Gabor et al. 19 worden getoond. Met het neuraminidase remmer Zanamivir, in een dosis die wordt voorspeld niveaus waargenomen in menselijk bloed, vertraagde begin van ziekte na te bootsen en de mortaliteit door een duidelijk effect op virusreplicatie / uitbreiden, zoals bepaald met NS1-GFP fluorescentie werd waargenomen. De zebravis IAV model is bij uitstek geschikt voor matige tot high-throughput klein molecuul-schermen. Omdat alleen infecties alleen kan plaatsvinden door middel van handmatige injectie in de circulatie via het kanaal van Cuvier of ader achterste kardinale De afmeting van het scherm beperkt door het aantal monteurs gevesoprichting van de infecties en hun bekwaamheden in het uitvoeren van de techniek. Niettemin is het mogelijk om ten minste 200 zebravisembryo per technicus per uur te injecteren. Hoewel succesvol in het aantonen van antivirale activiteit voor Zanamivir in een zebravis infectie model, moet worden erkend dat het screenen van geneesmiddelen in alle dierlijke modellen, met inbegrip van de zebravis, zorgvuldig moeten worden gecontroleerd 38. Hoe een geneesmiddel wordt geabsorbeerd en gemetaboliseerd verschilt van dier tot dier, en is moeilijk te voorspellen. Niettemin, als methode voor het screenen van nieuwe anti-influenza drugs, dit zebravis IAV infectiemodel biedt een spannende gelegenheid om vele duizenden kleine moleculen overzicht per dier ortholoog met organen voor mens en met sterk geconserveerde integratieve fysiologie.
Naast het feit dat een model van systemische infectie, kan de zebravis ook dienen als model voor gelokaliseerde infectie wanneer IAV in de zwemblaas 19 geïnjecteerd 21, 29, 30, 31. Bij een juiste getitreerd moet zebravis die zijn geïnfecteerd met het NS1-GFP-stam op 5 d post-bevruchting bewijs punctate fluorescentie vertonen rond het epitheel van de zwemblaas per 1 d na infectie. Gebruik van deze lokale infectie strategie kan neutrofielen gedrag in reactie op de infectie worden gevolgd. Als menselijke neutrofielen, zebravis neutrofielen zijn een van de belangrijkste cellulaire mediator in de aangeboren immuniteit, functioneert tijdens acute reacties op weefselschade en infecties en het spelen cruciale rol tijdens chronische ontsteking 24. Er is een toenemende erkenning dat neutrofielen een essentiële rol spelen bij de immuunreactie tegen influenza. Inderdaad is gebleken dat neutrofielen functie "tweesnijdend zwaard" bij het mediëren van de immune respons. While essentieel voor de antivirale respons nodig influenza-infecties te controleren, neutrofielen bijdragen tot een overmatig inflammatoire milieu in de longen die kunnen beschadigen gastheerweefsels en het risico op sterfte 39, 40, 41, 42, 43. Er is aanzienlijke instandhouding van gen synteny tussen de zebravis en menselijke genomen en deze orthologie er ook belangrijke functionele instandhouding in neutrofielen biologie. Zebravis neutrofielen dragen veel overeenkomsten met humane neutrofielen, zoals een polymorfe kern, de aanwezigheid van primaire en secundaire granules en functionele myeloperoxidase en NADPH oxidase 22. Daarnaast kan de zebravis neutrofielen bacteriën verzwelgen en laat neutrofielen extracellulaire vallen (NET) 44. Verscheidene transgene zebravis lijnen zijn developed te identificeren en te ontleden functies van neutrofielen biologie 27, 45, 46, 47. Deze infectie protocol is flexibel en kan worden aangepast om meerdere neutrofiele functies die overwonnen gereedschappen te testen. Deze gelokaliseerde zebravis IAV infectie model kunnen vragen over de immuunrespons van de gastheer te behandelen, in het bijzonder die gemedieerd door neutrofielen.
Studies uitgevoerd in zoogdieren model diersoorten hebben waardevolle informatie 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, maar weinig real-time experimenten met IAV infectie h opgeleverdave uitgevoerd, beperkt het begrip van de complexe wisselwerking tussen de bestanddelen van de gewervelde aangeboren immuunrespons in de gastheer. In de afgelopen tien jaar is het gebruik van de zebravis diermodel systeem een keerpunt van informatie met betrekking tot gastheer-pathogeen interacties 21, 47, 56, 57 opgeleverd, en heeft ook belangrijke informatie als een instrument voor drug discovery aangeboden. Een combinatie van moleculaire technieken en beeldvorming microscopie hebben een beter begrip van aangeboren immuunresponsen toegestaan en hoe deze worden geopenbaard in vivo 17, 18, 27. De ontdekking dat zebravis geïnfecteerd raakt met iav 19, en dat de zebravis heeft belangrijke immunologische gelijkenis van zoogdieren, waaronder de mens, de deur geopend de studievan een belangrijke menselijke virale ziekteverwekker. De beschreven protocollen aanpasbaar aan andere applicaties en hebben het potentieel om kritische ontdekkingen met betrekking gastheer-virus interacties die diepgaande klinische gevolgen voor de gezondheid kunnen hebben verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
References
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
- von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
- Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
- Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
- Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
- Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
- Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
- de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
- Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
- Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
- Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
- Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
- Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
- Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
- Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
- Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
- Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
- Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
- Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
- Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
- Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
- Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
- Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
- Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
- Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
- Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
- Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
