Introduction
Enligt Världshälsoorganisationen (WHO), influensavirus infekterar 5-10% av vuxna och 20-30% av barn per år och orsakar 3-5 miljoner fall av svår sjukdom och upp till 500.000 dödsfall i världen en. Årliga vaccinationer mot influensa fortfarande det bästa alternativet för att förebygga sjukdom. Ansträngningar som WHO: s globala handlingsplan har ökat säsongsvaccinanvändning, vaccin produktionskapaciteten, samt forskning och utveckling i mer potenta vaccinstrategier för att minska sjuklighet och dödlighet i samband med säsongs utbrott influensa 2. Antivirala läkemedel som neuraminidashämmare (t.ex. zanamivir och Oseltamivir) finns i vissa länder och har visat sig effektiv i förmildrande symtom, när de administreras inom de första 48 h av uppkomsten 3, 4, 5. Trots de globala ansträngningarna, inneslutning av säsongsinfluensa outbreaks fortfarande en formidabel utmaning vid denna tid, som influensavirus antigen drift överstiger ofta nuvarande förmåga att anpassa sig till förändrade virusets 6. Vaccinstrategier inriktade nya virusstammar måste utvecklas i förväg och ibland blir mindre än optimalt effektiva på grund av oförutsedda förändringar i de typer av påfrestningar som så småningom dominerar i en influensasäsong. Av dessa skäl finns det ett klart behov av att utveckla alternativa behandlingsstrategier för att innesluta infektioner och minska dödlighet. Genom att uppnå en bättre förståelse av samspelet värd virus, kan det vara möjligt att utveckla nya läkemedel mot influensa och adjuvant terapi 7, 8.
Den mänskliga värden-influensa A-virus (IAV) interaktionen är komplex. Flera djurmodeller för human IAV infektion har utvecklats för att få insikt i interaktionen värd virus, including möss, marsvin, bomullsråttor, hamstrar, illrar och makaker 9. Samtidigt som den ger viktiga data som har ökat förståelsen av värd IAV dynamik, varje modellorganism besitter betydande nackdelar som måste beaktas när man försöker översätta resultaten i humanmedicinen. Till exempel möss, som är den mest använda modellen inte lätt utveckla IAV-inducerade infektionssymtom när de infekteras med mänsklig influensa isolat 9. Detta beror på att möss saknar den naturliga tropism för humana influensaisolat sedan mus epiteliala celler uttrycker a-2,3 sialinsyra-bindningar i stället för de α-2,6 sialinsyra-bindningar som uttrycks på humana epitelceller 10. Hemagglutinin proteiner som är närvarande i humant IAV isolat gynnsamt binda och ange värdceller som bär a-2,6 sialinsyra bindningar genom receptormedierad endocytos 9, 11, 12, 13. Som en följd av detta är det nu accepterat att för att utveckla musmodeller för mänsklig influensa, måste försiktighet iakttas för att para ihop rätt stam av mus med lämplig stam av influensa i syfte att uppnå sjukdoms fenotyper som rekapitulera aspekter av mänskliga sjukdomar. I kontrast, epitelceller i övre luftvägarna hos illrar besitter a-2,6 sialinsyra-bindningar som liknar humana celler 14. Infekterade illrar delar många av de patologiska och kliniska egenskaper som observerats i den mänskliga sjukdomen, inklusive patogenicitet och överförbarhet av influensavirus 14 mänskliga och avian, 15. De är också mycket mottagliga för vaccineffektivitetsstudierna. Ändå iller modell för human influensa har flera nackdelar huvudsakligen relaterade till deras storlek och kostnad för djurhållning som gör förvärv av statistiskt signifidande uppgifter utmanande. Dessutom har illrar tidigare visade skillnader i farmakokinetik läkemedels, biotillgänglighet och toxicitet som gör att testa effekten svårt. Till exempel, illrar uppvisar toxicitet för jonkanalen hämmaren amantadin 16 M2. Således är det uppenbart att välja en djurmodell för att studera frågor om mänskliga IAV infektioner, är det viktigt att tänka på sina inneboende fördelar och begränsningar, och den del av värd virus interaktion som är under utredning.
Zebrafisk, Danio rerio, är en djurmodell som ger unika möjligheter för att undersöka mikrobiell infektion, värd immunsvar, och potentiella läkemedelsbehandlingar 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Närvaron av α-2,6-länkade sialinsyror på ytan av celler i zebrafisk föreslog dess känslighet för IAV, vilket bekräftades i infektionsstudier och avbildas in vivo med användning av en fluorescerande reporterstam av IAV 19. I IAV-infekterade zebrafisk, ökat uttryck av de antivirala ifnphi1 och MXA transkript indikerade att en medfödd immunsvar hade stimulerats och patologi visas av IAV-infekterade zebrafisk, inklusive ödem och vävnadsnedbrytning, liknade den som observerats i infektioner influensa hos människor . Dessutom IAV antivirala neuraminidas hämmare Zanamivir begränsad dödlighet och minskad virusreplikation i zebrafisk 19.
I denna rapport, ett protokoll för att initiera systemetic IAV infektioner hos zebrafisk embryon beskrivs. Använda Zanamivir vid kliniskt relevanta doser som en proof-of-princip är nyttan av denna zebrafisk IAV infektionsmodell för screening av föreningar för antiviral aktivitet påvisas. Dessutom, ett protokoll för att alstra en lokaliserad, epitelial IAV infektion i zebrafisk simma urinblåsan, ett organ som anses vara anatomiskt och funktionellt analog med däggdjurs lungan 21, 29, 30, 31, beskrivs. Med hjälp av denna lokaliserade IAV infektionsmodell, kan neutrofil rekrytering till infektionsstället spåras, så undersökningar roll neutrofila biologi IAV infektion och inflammation. Dessa zebrafisk modeller komplettera befintliga djurmodeller för humana IAV infektioner och är särskilt användbara för att testa små molekyler och immuncellsvar på grund av risken för förbättrad sav statistik makt, kapacitet för måttliga till hög genomströmning analyser och förmåga att spåra immun cellens beteende och funktion med ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt arbete ska utföras med skyddsnivå 2 (eller BSL2) standarder beskrivs av US Centers for Disease Control (CDC) och i enlighet med direktiv som fastställts av Institutional Animal Care och användning kommittéer (IACUC). Vänligen ge med lämpliga tjänstemän för att garantera säkerhet och efterlevnad.
1. Zebrafisk Skötsel och underhåll
- Leka zebrafisk och samla det erforderliga antalet embryon för experimenten. Vid behov mass avel tankar, som de som beskrivs av Adatto et al. 32, kan användas för att samla ett stort antal utvecklingsmässigt iscensatt embryon.
- Låt embryon att utvecklas tills önskad utvecklingsstadiet (48 timmar efter befruktning för en systemisk IAV infektion [avsnitt 3] eller 5 dagar efter befruktningen för en lokal, simma urinvägsinfektion [avsnitt 4]) i djupa petriskålar med låg densitet (< 100 embryon / fat) vid 28 ° C i sterilt ägg vatten innehållande 60 | j, g / ml havssalt (t.ex., Instant Ocean) i destillerat vatten.
- Ta bort döda embryon med plast överföringspipetter och ändra ägg vatten dagligen för att säkerställa optimal hälsa och utveckling.
2. Beredning av Material och reagenser
- Bered en 4 mg / ml stamlösning av Tricaine-S (justera pH till 7,0-7,4) i destillerat vatten och autoklav. Lagra vid 4 ° C.
- Dra borosilikatglas kapillärer med trådar med hjälp av en mikropipett avdragare (t.ex. mikropipett avdragare med följande inställningar: tryckinställning = 100, värme = 550, dra = [inget värde], hastighet = 130, tid = 110).
OBS: Före trimning nålen, skulle längden från där nålen börjar avsmalna till spetsen av nålen vara ungefär 12-15 mm. Detta kan variera, dock baserat på preferens och tillämpning. En längre, mer gradvis avsmalning kan vara mer att föredra på grund av den ökade förmågan att genomtränga embryot och den reducerade risk av nålen böjning eller brytning. - Smält 2 g agaros i 100 ml ägg vatten med hjälp av en mikrovågsugn. Gör plattor som att rada upp och injicera embryon genom att hälla smält agaros i djupa petriskålar och låta den stelna.
- Gör en 10 mg / ml lager zanamivir i nukleasfritt vatten. Alikvotera och frysa vid -20 ° C.
- Smält 0,5 g agaros i 50 ml ägg vatten med hjälp av en mikrovågsugn för att göra embryo montering agaros. Behåll i vattenbad vid 50 ° C tills den ska användas under avbildning.
3. Systemisk IAV infektion (48 h efter befruktning)
VARNING: Alla forskningspersonalen bör rådgöra med sina handledare och läkare om vaccination innan arbetet påbörjas med IAV.
- dechorionate manuellt embryon på dagen för experimentet med # 5 pincett. Var noga med att ta bort och avliva embryon som har skadats i processen i 200 mikrogram / ml Tricaine lösning.
- Framställning of IAV för mikroinjektion
OBS: Stammar som har visat att infektera zebrafisk embryon är influensa A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influensa A-X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), och den fluorescerande reporter influensastammen NS1-GFP 33. Detaljer om APR8 och X-31, och andra stammar, kan hittas på den Influenza Research Database- Propagera NS1-GFP-stammen av IAV i embryonerade hönsägg som tidigare beskrivits 34, 35. Samla in, alikvot, och titrera allantoisvätska innehållande IAV, och förvara vid -80 ° C. Pre-titreras APR8 och X-31 virus kan köpas i handeln.
- Strax före infektion, snabbt tina en IAV delprov i handskar på händerna och sedan snabbt placera på is för att minska förlusten av titer.
- viral utspädning
- Om du använder de APR8 eller X-31 virus, späd till 3,3 x 10 6 ägg 50% infektiös dos (EID50) / ml i steril, iskall PBS supplemterade med 0,25% fenolrött (som hjälp vid visualisering) i ett dragskåp med laminärt flöde. Samtidigt inrättas en kontroll innehållande steril PBS med 0,25% fenolrött.
- Vid användning av NS1-GFP-stammen 33, späd till ~ 1,5 x 10 2 plackbildande enheter (PFU) per nl i steril, iskall PBS innehållande 0,25% fenolrött (som hjälp vid visualisering) i ett dragskåp med laminärt flöde. Samtidigt inrättas en kontroll innehållande allantoisvätska från oinfekterade kycklingägg utspädda som viruset i steril PBS med 0,25% fenolrött.
- Behåll IAV på is tills det ska användas.
- Pipett viruslösning i mikroinjektion nålar med hjälp av micro tips strax före användning. Sätt mikroinjektion nålen i lämplig innehavaren av injektionsapparaten (t.ex. MPPI-3 insprutningssystem).
- Medan du tittar under stereomikroskop, försiktigt klippa mikroinjektion nålspetsen med skarpa, steriliserad # 5 pincett.
OBS: Det är rekomded att mikroinjektion spetsen klippas gradvis. - Tryck på fotpedalen av insprutningssystemet och injicera i en droppe mikroskop immersionsolja på en kalibreringsskalorna. Mäta diametern på droppen. Beräkna volymen av droppen med användning av ekvationen, V = 4 / 3πr 3, där V är volymen i nl och r är radien i ^ m.
OBS: Om droppdiametern är för liten, kan ytterligare glas klippas eller tryck- och tidsinställningar kan justeras. Om droppdiametern är för stor, kan tryck- och tidsinställningar justeras. - Justera tryck- och tidsinställningar på tryck injektorn och / eller Kläm fast nålspetsen tills önskad injektionsvolym uppnås (typiskt 1-3 nl). Tryckinställningar mellan 20 och 30 psi och pulslängd inställningar mellan 40 och 80 ms är typiska. Justera mottryck så att det motverkar kapillärtryck men inte läcker IAV (netto nolltryck).
- Propagera NS1-GFP-stammen av IAV i embryonerade hönsägg som tidigare beskrivits 34, 35. Samla in, alikvot, och titrera allantoisvätska innehållande IAV, och förvara vid -80 ° C. Pre-titreras APR8 och X-31 virus kan köpas i handeln.
- Rikta Embryon för injektion
- Söva dechorionated embryon i 200 | j, g / ml Tricaine.
- När rörelsen upphör, överföra 10-20 embryon till en 2% -ig platta (framställd i avsnitt 2.3) med en plastpipett. Använd plastpipetten att avlägsna överflödig vätska.
- rikta försiktigt embryon för mikroinjektion med en brand-polerad och förseglade borosilikatglas kapillär. Med hjälp av en stereomikroskop, försiktigt orientera embryon så att kanalen i Cuvier eller bakre kardinal ven är i linje med mikroinjektion nål (Figur 1A).
- IAV Mikroinjektion
- Försiktigt in mikroinjektion nålen i kanalen i Cuvier eller bakre kardinal ven. Trycka ned fotpedalen för att injicera den önskade volymen IAV in i cirkulationssystemet av embryot (Figur 1A). Embryon kan injiceras fler än en gång om det är nödvändigt.
OBS: Injektions bolus ska sopas upp i cirkulationen och distriberas i hela kroppen. Om injektionsvolym samlas vid injektionsstället, ta bort embryot från experiment och Euthanize. - Upprepa injektioner på olika embryon med kontrollösning specifik för den virusstam som väljs. För APR8 och X-31, använda kontroll beskrivs i avsnitt 3.2.2.1; för NS1-GFP, använda kontroll beskrivs i avsnitt 3.2.2.2.
- Försiktigt in mikroinjektion nålen i kanalen i Cuvier eller bakre kardinal ven. Trycka ned fotpedalen för att injicera den önskade volymen IAV in i cirkulationssystemet av embryot (Figur 1A). Embryon kan injiceras fler än en gång om det är nödvändigt.
- Överför embryon till märkta petriskålar innehållande sterilt ägg vatten och plats i inkubatorer vid 33 ° C.
OBS: Infekterade embryon bör odlas vid 33 ° C för att stödja förbättrad virusreplikation. Dessutom inkubering vid 33 ° C härmar närmare temperaturen hos den mänskliga övre luftvägarna, som är i nära kontakt med lägre temperaturer i den yttre miljön och är där IAV infektioner inträffar. Embryon kan anpassa sig till ett brett temperaturområde 34.
4. Lokaliserad, simblåsa IAV infektion i Tg (MPX: mCherry)
- Framställning av IAV för mikroinjektion
- Späd NS1-GFP stam och kontroll injektionslösning som beskrivs i avsnitt 3.2.
- Förbered nålar som beskrivs i avsnitt 2.2.
- Rikta Tg (MPX: mCherry) 35 larver innehållande uppblåsta simblåsor som beskrivs i avsnitt 3.3 med följande undantag. Rikta larver på ett sådant sätt att nålen kan tränga igenom simblåsans och viruset kan sättas in på den bakre delen av simblåsa, såsom tidigare beskrivits 36 (Figur 2A).
- IAV Mikroinjektion
- Försiktigt in mikroinjektion nålen i simblåsan och injicera önskad volym (t.ex. 5 nl) mot den bakre delen av strukturen (Figur 2A).
OBS: Injektions bolus ska samla in mot den bakre och simblåsan luftbubbla skulle be förskjuts framåt. GFP-uttryck bör börja skall iakttas vid 3 h efter injektion. - Upprepade injektioner med kontrollösning specifika för virusstam som valts, som beskrivs i avsnitt 3.4.2.
- Försiktigt in mikroinjektion nålen i simblåsan och injicera önskad volym (t.ex. 5 nl) mot den bakre delen av strukturen (Figur 2A).
- Överför larver till petriskålar innehållande sterilt ägg vatten och plats i inkubatorer vid 33 ° C.
5. Antiviral drogbehandling
OBS: Protokollet nedan beskriver Zanamivir behandlingen tidigare visats i Gabor et al. 19. Detta protokoll kan modifieras för att screena andra antivirala läkemedel och har potential att ändras för att screena flera föreningar i en 96 brunnar, med hög genomströmning format.
- Vid 3 timmar efter infektion, ersätter ägg vatten NS1-GFP- och kontroll infekterade fisk med sterilt ägg vatten innehållande 0, 16,7, eller 33,3 ng / ml Zanamivir.
OBS: Dessa koncentrationer valdes för att försöka efterlikna de fysiologiska nivåer uppnås following administrering av zanamivir i humana patienter (100, 200, eller 600 mg, iv, två gånger dagligen eller 10 mg inhaleras, två gånger dagligen). De serumkoncentrationer i humana patienter varierade från 9,83 till 45,3 ng / ml 36. - Under 5 dagar, byta ägg vatten varje 12 timmar och ersätta med sterilt ägg vatten innehållande lämplig mängd Zanamivir.
- Spåra infektionsförloppet.
- Söva zebrafisk i 200 | j, g / ml Tricaine. Övervaka GFP uttryck genom stereo fluorescensmikroskopi att visuellt observera skillnader i infektionsmönster mellan IAV-infekterade och kontrollfisken och bland fiskarna nedsänkt i de olika koncentrationer av läkemedel.
- Spåra morbiditet och mortalitet under loppet av 5 dagar.
- Spela iakttagelser om infektionsdynamik i samband med sjukdom patologi, inklusive tecken på letargi och tecken på ödem, skillnader i pigmentering, okulär och kraniofaciala missbildningar och lordos. sjukdomspatologintypiskt blir uppenbart i kontroll infekterad fisk vid 24-48 h efter injektion, beroende på den mängd virus som injiceras. Samla in bilder 24 h efter injektion.
- Varje 24 h under 5 dagar efter infektion, registrera antalet döda, morbid, och friska larver. Död definieras genom frånvaron av en urskiljbar hjärtslag. Plotta data enligt önskan. Till exempel, tomt data som ett staplat stapeldiagram, med procenthalter av friska, morbid, eller döda fiskar plottas på y-axeln och den behandlade gruppen på x-axeln. 19
OBS: dödlighet får göras av Kaplan-Meier överlevnads uppskattningar. Beroende på tillämpning kan det vara lämpligt att utveckla alternativa metoder för scoring fisk sjuklighet, inklusive en poängmatris som kan kvantifiera graden av sjuklighet baserade på de ovan nämnda patologiska funktioner observerats. - Rådgör med en statistiker att tillämpa lämpliga statistiska analyser.
6. neutrofil migration
OBS: Protokollet nedan beskriver en metod för att spåra neutrofil migration till simblåsans efter en lokaliserad, epitelial IAV infektion. De metoder som beskrivs kan modifieras för att testa effekterna av genetiska och kemiska manipulationer. Med denna teknik, kommer det att vara möjligt att karakterisera mekanismerna bakom neutrofila beteende under en IAV infektion.
- Monteringszebrafish för Imaging
- Söva larver som skall avbildas i 200 mikrogram / ml Tricaine.
- Överför en enskild Tg (MPX: mCherry) larv som har smittats med NS1-GFP till en brunn i en 24 väl, glas bottenplattan i en liten droppe ägg vatten (~ 50-100 l). Upprepa med andra IAV-smittade och kontroll fisk.
- Tillsätt långsamt 1% -ig embryo monterings media till varje brunn (avsnitt 2.5), noga med att inte införa stora bubblor.
- Justera försiktigt position larven så att den är monterad på sin sida.Goody och Henry 37 beskriver hur man gör sonder som fungerar väl i detta program med insekter stift som är monterade i borosilikatglas kapillärer med trådar och superglued på plats.
- När agarosen hårdnar, försiktigt fylla de individuella brunnarna med ägg vatten innehållande 200 mikrogram / ml Tricaine.
- Med en konfokalmikroskop, fånga az stack serie bright och fluorescens bilder med hjälp av en 20x objektiv fokuserat på simblåsan.
- Ställ in övre och nedre gräns så att de fångar alla synligt observerbara grön och röd fluorescens.
- Ta bilder på 2,0 ps / pixel med steg som är ≤ 4 pm. Ökande tid per pixel och minska avståndet mellan stegen (t.ex. 0,5-1,0 um) ökar bildupplösning och kvalitet.
- Generera en tvådimensionell bild genom att sammanfoga skikten.
- Jämför antalet mpx-mCherry-positiva neutrofiler Present jagn de simblåsor av IAV-infekterade och kontroll injiceras zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här är data som visar hur systemisk IAV infektion i zebrafisk kan användas för att testa läkemedlets effektivitet (Figur 1A) tillhandahålls. Embryon vid 48 timmar efter befruktningen injiceras med APR8 (figurerna 1C, 1F), X-31 (figurerna 1D, 1G), eller NS1-GFP (fig 1 H-1I) via kanalen för Cuvier att inleda en virusinfektion. En annan kohort av embryon vid 48 timmar efter befruktning injicerades att tjäna som kontroller för virusinfektion (figurerna 1B, 1E). Av 48 h efter infektion, zebrafisk injiceras med IAV uppvisade tecken på perikardiell ödem (figurerna 1C, 1D) och cirkulationsstillestånd (figur 1F), med erytrocyter är närvarande under hela hjärtsäck (Figur 1G). Med användning av NS1-GFP, det initiala uttryck av GFP genom fluorescensmikroskopi så tidigt som 3 timmar efter infektion observerades. Vid denna tidpunkt var zebrafisk utsätts för en 33,3 ng/ Ml dos av neuraminidas hämmare Zanamivir. Denna dos motsvarar ungefär 200 mg ges till humanpatienter. Kontroll infekterad fisk inte utsätts för Zanamivir (figurerna 1H, 1H) uppvisade egenskaper hos ödem och systemisk GFP uttryck. Minskad brutto patologi och GFP-fluorescens (figurerna 1I, 1I) i NS1-GFP-infekterade larver exponeras för Zanamivir observerades. Minskningen av GFP var mest märkbar i kropparna av larver, medan mycket små förändringar observerades i gulesäcken. Fisk behandlad med zanamivir uppvisade mindre morbiditet, vilket framgår av förbättrad simning motilitet och minskade nivåer av ödem i hjärtat, och förbättrad överlevnad. Dessa upptäckter kompletterar en mer omfattande studie 19 och visar värdet av denna modell för läkemedelsscreening.
En lokal zebrafisk simblåsa infektionsmodell 31 har anpassats för IAV infection. NS1-GFP virus injicerades i simblåsor av 5 d post-befruktning Tg (MPX: mCherry) larver för att initiera en lokaliserad, epitelial infektion (Figur 2A). PBS injicerades i simblåsans som en kontroll för att demonstrera specificiteten för neutrofil rekrytering mot IAV-infekterade celler. Rekryteringen av mCherry-märkta neutrofiler i simblåsan var funnen. Vid 20 h efter infektion, avsevärd migrering av neutrofiler in i simblåsor av IAV-infekterad fisk i förhållande till PBS-injicerade kontroller (fig 2B, 2B ', 2C, 2C') iakttogs. Dessa data visar att IAV kan rekrytera neutrofiler till simblåsans, precis som det rekryterar neutrofiler till den mänskliga lungan.
Figur 1: Antiviral läkemedelsbehandling minskar svårighetsgraden av IAV infektion i zebrafisk. (A (B - I) Brutto patologi och GFP-fluorescens av zebrafisk embryon injiceras i kanalen för Cuvier med IAV. (BG) Fisk infekterade med IAV och undersöktes vid 48 timmar efter infektion för tecken på viral infektion och sjukdom. (B - D) Enstaka fokalplan för kontroll eller IAV-infekterade fisk samlades (sidomonterade, främre vänster, rygg topp, 4X förstoring, skala bar = 500 nm). (B) kontroll fisk injicerades med PBS och visa normal morfologi. (C - D) Embryon infekterade med APR8 (C) eller X-31 (D) allmänt uppvisade perikardiell ödem (fylld pil). Embryon hade också nekrotisk vävnad, tydligt i (C). (E) Kontroll fisk injicerades med PBS och visar inga tecken på patologi (skala bar = 250 nm). (F) Embryon som infekterats med APR8 visar cirkulationsstillestånd (hack pilspets, skala bar = 250 nm). (G) Embryo injiceras med X-31 visar influensa både perikardiell ödem (pilen) och poolade erytrocyter genom hjärtsäcken (hack pilspets, skala bar = 100 nm). (H, I) Bilderna visar effekterna av ett antiviralt läkemedel på IAV-infekterade zebrafisk (skala bar = 200 nm). (H) Bright och (H) fluorescens bild som visar ett embryo injiceras med NS1-GFP (ingen antiviral läkemedelsbehandling). Lägg märke till ödem och GFP uttryck särskilt i den gemensamma kardinalen ven regionen. (I, I ') Behandling med ett antiviralt läkemedel reducerade infectjon, vilket framgår av minskad patologi, inklusive minskat ödem och minskat uttryck av GFP i den vita streckade konturerna av kroppen, särskilt i kärlsystemet, som är indikativ för minskad viral börda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Neutrofiler rekryteras till områden av lokaliserad IAV infektion. (A) Schematisk visar injektions strategi behövs för att initiera en lokal IAV infektion i en uppblåst zebrafisk simblåsa på 5 d efter befruktning. (B, C) Neutrofil rekrytering till simblåsan efter NS1-GFP infektion. Z-stack bilder (4 ^ m steg) uppsamlades genom konfokalmikroskopi (20X förstoring). Bilder var oförändradtened i två dimensioner (sidomonterade, främre vänster, rygg överst). Tg (MPX: mCherry) zebrafisk (5 d post-fertilisering) injicerades med (B, B ') allantoisvätska utspädd med PBS och 0,25% fenolrött eller (C, C') NS1-GFP (7,2 x 10 2 PFU / embryo) utspädd i allantoisvätska och PBS med 0,25% fenolrött. Vid 16 h efter infektion, neutrofiler var närvarande i en IAV-infekterade simblåsa (C, C ': grön fluorescens visar lokaliserad infektion; C': röda blodkroppar är neutrofiler, vita pilen identifierar representativ neutrofil). (B, B ') Inga bevis på GFP-uttryck som indikerar IAV infektion och ingen rekrytering av neutrofiler till simblåsans observerades i larver injiceras med allantoisvätska i PBS. pelas klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att maximera nyttan av att använda ett litet djur för att modellera mänskliga värd-patogen interaktioner, är det viktigt att utforma frågeställningar och testa hypoteser som kapitalisera på de inneboende fördelarna med modellsystem. Som en modell för human IAV infektion, har zebrafisk flera styrkor, inklusive hög fruktsamhet, optisk klarhet, mottaglighet för läkemedelsscreening, och tillgången av transgena linjer som märka immunceller som neutrofiler. Zebrafisk har utvecklats som en allt mer kraftfullt alternativ till musen modellsystem för att studera inflammation och medfödd immunitet. Eftersom de saknar en fungerande adaptiva immunsvaret under de första 4-6 veckorna av utveckling, montera zebrafisk medfödda immunsvar för att skydda mot skador och infektioner 37. Under denna tidiga period i utvecklingen, är det möjligt att isolera och studera mekanismerna i den antiviralt svar som härrör från det medfödda immunresponsen ensamt. Thiarbete har underlättats genom utvecklingen av transgena zebrafisk linjer som Tg (MPX: mCherry), vilka etiketter neutrofiler med en röd fluorescerande protein.
Zebrafisk modeller för IAV infektion som liknar mänsklig sjukdom har nyligen beskrivits 19. Det visades att zebrafisk har a-2,6-kopplade sialinsyrarester på sina celler som ger IAV virus tropism att binda, fästa, och in i celler. I detta manuskript och Gabor et al. 19, har det visats att två olika stammar av IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] och X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]), såväl som den rekombinanta NS1-GFP-stammen som resulterar i GFP översättning i infekterade celler, kan infektera, replikera och mortalitet när de injiceras i cirkulationssystemet hos larver zebrafisk. Injektion av viruset är kritisk för denna infektion metod, enligt exponering för IAV via nedsänkning inte fungerar på ett tillförlitligt sätt. Infekterade fisk bör överföringröd till en 33 ° C inkubator för att säkerställa viral replikation. Det är viktigt att notera att människans luftvägar, där influensainfektioner inträffar, är typiskt 33 ° C. Inkubation vid 28 ° C, vilket är mer typiska temperaturen för zebrafisk inkubation, inte leder till en tillförlitlig infektion. Vidare är det viktigt att testa varje parti från tillverkaren eller parti IAV producerade före användning i ett experiment beror på variabiliteten som påverkar smittsamhet och sjukdomsprogression i zebrafisk. När infekterande dos är korrekt titreras, bör den stora majoriteten av zebrafisk infekterade med dessa stammar av IAV uppvisar sjukdoms fenotyper brutto exemplifierade av ödem, så tidigt som 24 timmar efter infektion, som progressivt försämras, kraniofaciala avvikelser av 48 h efter infektion, lordos av 72 h efter infektion, och ca 50% bör falla för infektion av 5 d efter infektion. Histopatologi vid 48 timmar efter infektion ska innehålla bevis för gäl, huvud njure, ochlevernekros, liksom tecken på vätska i hjärtsäcken. Vid fastställandet dessa fynd som förutsägbart resultat av ett IAV infektion i zebrafisk, är det möjligt att screena kandidat anti-influensa läkemedelsförening kandidater. Med detta i åtanke, ett proof-of-principle protokoll för screening ett antiviralt läkemedel baserat på ursprungliga slutsatserna beskrivs i Gabor et al. 19 demonstreras. Använda neuraminidas hämmare Zanamivir, vid en dos som förutspås för att efterlikna nivåer som observerades i mänskligt blod, fördröjd sjuklighet och minskad dödlighet genom en märkbar effekt på virusreplikation / spridning, som bestäms av NS1-GFP fluorescens, observerades. Zebrafisk IAV modellen är idealisk för måttliga till höga genomströmning småmolekylära skärmar. Eftersom infektioner endast kan ske endast genom manuell injektion i cirkulationen genom kanalen hos Cuvier eller bakre cardinal ven, är storleken av skärmarna begränsad av antalet tekniker Establande de infektioner och deras färdigheter i utför tekniken. Trots detta är det möjligt att injicera åtminstone 200 zebrafisk embryon per tekniker per timme. Medan lyckats visa antiviral aktivitet för Zanamivir i en zebrafisk infektionsmodell, måste det erkännas att drogscreening i alla djurmodeller, inklusive zebrafisk, måste kontrolleras noggrant 38. Det sätt ett läkemedel absorberas och metaboliseras skiljer sig från djur-till-djur, och är svår att förutsäga. Men som en metod för screening av nya anti-influensa droger, presenterar denna zebrafisk IAV infektionsmodell en spännande möjlighet att kartlägga många tusen små molekyler i ett djur med organ ortologa för människor och med högt konserverade integrativ fysiologi.
Förutom att vara en modell för systemisk infektion, kan zebrafisk också fungera som en modell för lokal infektion när IAV sprutas in i simblåsan 19 21, 29, 30, 31. När korrekt titreras bör zebrafisk som är infekterade med NS1-GFP stam på 5 d efter befruktningen uppvisa bevis för punktformig fluorescens runt epitel av simblåsan med en d efter infektion. Med hjälp av denna lokal strategi infektion, kan neutrofil beteende som svar på infektion spåras. Liksom humana neutrofiler, zebrafisk neutrofiler är en huvudcell medlare i medfödd immunitet, fungerar under akuta svar på vävnadsskada och infektion och spela kritiska roller under kronisk inflammation 24. Det finns en växande insikt om att neutrofiler spelar en avgörande roll i immunsvaret mot influensainfektion. I själva verket har det blivit uppenbart att neutrofiler funktion som "tveeggat svärd" i medla immunsvaret. while väsentlig för antiviralt svar behövs för att kontrollera influensainfektioner, neutrofiler bidrar också till en överdrivet inflammatoriskt miljö i lungan som kan skada värdvävnader och öka risken för dödlighet 39, 40, 41, 42, 43. Det finns en betydande bevarande av gen synteny mellan zebrafisk och mänskliga genomet, och med denna ortologianalys finns också betydande funktionell bevarande i neutrofila biologi. Zebrafisk neutrofiler bär många likheter med humana neutrofiler, inklusive en polymorf kärna, närvaron av primära och sekundära granulat, och funktionell myeloperoxidas och NADPH-oxidas 22. Dessutom kan zebrafisk neutrofiler uppsluka bakterier och släpper neutrofila extracellulära fällor (nät) 44. Flera transgena zebrafisk linjer har developed att hjälpa till att identifiera och analysera funktioner neutrofila biologi 27, 45, 46, 47. Denna infektion protokoll är flexibel och kan modifieras för att testa flera neutrofila funktioner med dessa alternativa verktyg. Detta lokaliserade zebrafisk IAV infektionsmodell gör frågor till värdimmunsvar som skall behandlas, och särskilt de som medieras av neutrofiler.
Undersökningar som genomförts i däggdjursmodellarter har gett värdefull information 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, men några realtids experiment med IAV infektion have utförts, vilket begränsar förståelsen av det komplexa samspelet mellan komponenterna i ryggradsdjuret medfödda immunsvar i värden. Under det senaste årtiondet har användningen av zebrafisk djurmodellsystem gav en vattendelare av information om värd patogen interaktioner 21, 47, 56, 57, och har också erbjudit viktig information som ett verktyg för läkemedelsupptäckt. En kombination av molekylära tekniker och avbildnings mikroskopi har möjliggjort en bättre förståelse av medfödda immunsvar och hur dessa uttryck in vivo 17, 18, 27. Upptäckten att zebrafisk kan infekteras med IAV 19, och att de zebrafisk aktier viktiga immunologiska likheter med däggdjurssystem, inklusive människa, har öppnat dörren till studienav en viktig mänsklig viral patogen. Protokollen är anpassningsbar till andra program och har potential att ge kritiska upptäckter rörande värd virus interaktioner som kan få långtgående kliniska effekter på människors hälsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | ||
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
| Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
| Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
| Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| Prism v6 | GraphPad | ||
| Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
| Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |
References
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
- von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
- Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
- Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
- Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
- Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
- Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
- de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
- Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
- Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
- Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
- Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
- Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
- Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
- Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
- Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
- Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
- Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
- Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
- Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
- Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
- Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
- Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
- Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
- Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
- Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
- Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
- Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
- de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
