Summary
이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.
Abstract
보조 생식 분야는 여성, 동반자 동물 및 멸종 위기 종의 불임 치료를 위해 개발되었습니다. 말의 보조 생식은 또한 스포츠 경력을 방해하지 않고 높은 수행자의 배아 생산을 허용하고 높은 유전 적 가치의 암말로부터 도태 한 새끼 수의 증가에 기여합니다. 본 원고는 난자 채취 (OPU)를 이용하여 말의 난소에서 미성숙 및 성숙 난 모세포를 채취하는 과정을 설명한다. 이 난 모세포는 마우스에서 이전에 개발 된 프로토콜을 적용하여 이수 배수 체의 발병률을 조사하는데 사용되었다. 특히, 중기 II 세포 (MII) 난 모세포의 염색체와 중심체 (centromeres)는 공 촛점 레이저 현미경 검사 후 순차적 초점 계획에서 형광으로 분류되고 계수되었다. 이 분석은 미성숙 난 모세포가 난포에서 채취 되고 생체 외에서 성숙되었을 때 이수 배수체 비율에서 더 높은 발병률을 나타냈다.생체 내. 특정 라이신 잔기에서 튜 불린 및 히스톤 4의 아세틸 화 형태에 대한 면역 염색 또한 감수 분열의 형태 및 히스톤 아세틸 화의 전체 패턴에서의 차이를 나타냈다. 마지막으로, 역전사 및 정량적 PCR (q-PCR)에 의해 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 및 아세틸 트랜스퍼 라제 (HAT)를 코딩하는 mRNA의 발현을 조사 하였다. 시험 관내 및 생체 내에서 성숙한 난 모세포 사이 에서 전사 물의 상대적인 발현에 차이는 관찰되지 않았다. oocyte 성숙 동안 전사 활동의 일반적인 침묵과 일치하여 총 전사 양의 분석은 mRNA 안정성 또는 분해를 나타낼 수 있습니다. 따라서 이러한 결과는 다른 번역 및 번역 후 규정이 영향을받을 수 있음을 나타냅니다.
전반적으로,이 연구는 형태학 및 생화학 적으로 말의 난 모세포, cell 유형은 낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기 매우 어렵습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족에 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.
Introduction
여성, 동반자 동물 및 멸종 위기에 처한 종의 불임 치료를 위해 광범위한 재현 기술이 개발되었습니다. 임상 환경에서 가장 보편적 인 절차 중 하나는 초음파 유도 질식 흡입, 난자 채집 (OPU) 1 에 의한 난소에서 난태 (metaphase) II (MII) 단계 난 모세포를 회수하는 것입니다. 이 난 모세포는 수용체 자궁에 이식 된 배아와 함께 시험 관내 (IVF)에서 수정된다. MII- 단계 (성숙한) 난 모세포는 외인성 생식선 자극 호르몬의 투여 후에 회수된다. 그러나이 치료법은 일부 환자에서 난소과 자극 증후군 (OHSS) 2 의 발병과 관련이 있습니다.
한 번 모낭에서 분리 된 자발적으로 감수 분열을 재개하기위한 완전히 성장한 미숙 난 모세포 (GV-stage)의 내재적 인 능력을 이용하여, 관리자없이 성숙한 난 모체를 얻을 수 있습니다gonadotropin 조율 3 . 이 과정은 난자 시험관 내 성숙 (IVM)이라고 불리우며 생식 기술을 돕는 데있어 덜 약물 지향적이고 덜 비싸며 환자 친화적 인 접근 방식을 의미합니다. 그러나 체외 에서 성숙 된 난 모세포 를 이용한 배아 발달의 성공은 일반적 으로 생체 내에서 성숙한 난 모세포보다 더 낮다. 가능한 설명은 체외에서 성숙한 난 모세포가 염색체 분리의 오류에 더 영향을 받고, 결과 배수체가 정상 배아 발생을 저해한다는 것이다.
IVM 동안의 염색체 오 분류의 분자 적 기초를 이해하는 것은 궁극적으로이 기술의 잠재력을 밝혀 줄 것입니다. 이 정맥 에서 in vitro에서 성숙한 난 모세포의 형태 학적 및 생화학 적 특징을 생체 내 성숙과 비교하는 실험 접근법ed oocytes는 7 , 8에 기술되어 있다. 구체적으로, 미성숙 및 성숙 난 모세포의 OPU 및 미성숙 난 모세포의 IVM 절차는 실험 모델로서 성인 및 자연 사이클링 말을 사용하여 설명됩니다. 그런 다음 immunofluorescence 및 이미지 분석은 염색체 분리, 스핀들 형태 및 이러한 배우자의 히스톤 아세틸 화의 전체적인 패턴을 조사하는 데 사용됩니다. 마지막으로 mRNA 발현 분석을 위해 역전사 및 정량적 PCR 프로토콜을 설명합니다.
설치류 동물 모델과 비교하여 말은 유전자 조작을 허용하지 않으며 조작하기가 쉽지 않으며 값 비싼 유지 관리가 필요합니다. 그러나이 모델은 난 모세포 생리학과의 유사성으로 인해 난 모세포의 성숙에 대한 연구에 상당한 관심을 보이고있다 9 , 10 </ sup>. 더욱이, 말에서 IVM-IVF의 신뢰할 수있는 프로토콜의 개발은 높은 유전 적 가치의 암말로부터의 새끼의 수를 증가시킬 수 있기 때문에 상당한 경제적 이익을 갖는다.
난 모세포 (oocytes), 특히 독성이있는 종에서 실험을 수행하는 데있어 한계 중 하나는 제한된 샘플 가용성입니다. 이 한계는 샘플 손실을 최소화하는 염색체 계수를 수행하기 위해 이전에 생쥐에서 개발 된 접근법을 말 난 모세포 13 , 14 로 조정하여 여기서 극복되었습니다 (다른 가능한 기술과의 비교에 대한 설명 참조). 또한, 트리플 형광 얼룩 프로토콜은 동일한 샘플에 대한 여러 분석을 수행하기 위해 최적화되었으며, q - PCR 분석은 2 oocytes의 수영장에서만 수행되었습니다.
전반적으로, 본 연구는 형태 학적 및 생화학 적으로 cha낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기가 극히 어려운 세포 유형 인 말 oocyte를 괴롭 히고 있습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족의 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 동물 보호 및 사용위원회 CEEA Val de Loire Number 19에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 난 모세포 수집 및 생체 외 성숙
- 오옴 픽업
- 매일 성인 암말 집단에서 난소 난소의 직경을 초음파로 평가합니다. 난포가 33 mm 이상일 때, 정맥 정맥 상부에 1,500 IU의 인간 chorionic gonadotrophin (hCG)을 주입한다 (iv).
- 주사를하기 전에 알코올로 부위를 닦고 경정맥을 찾은 다음 주사 부위 아래에 2 ~ 3cm 정도의 엄지 손가락을 대어 정맥이 올라 오도록하십시오. 바늘을 목에 거의 평행하게 삽입하고 바늘이 정맥에 있는지 확인하십시오 (혈액이 주사기로 들어갑니다). 이 시점에서 주사; hCG는우성 여포에있는 난 모세포의 발달.
- hCG 주사 35 시간 후 detomidine (15 μg / kg, iv), butorphanol tartrate (10 μg / kg, iv) 및 butylscopolamine bromure (0.2-0.3 mg / kg, 15 mL / mare, iv)로 수컷을 진정시킨다.
- 바늘을 초음파 탐침에 연결하십시오. 초음파 프로브를 질식 삽입하고 초음파 프로브를 직면하도록 난소를 직립 상태로 유지하십시오. 한 명의 조작원에게 바늘을 조종하고 다른 하나는 초음파 프로브를 마주 보는 난자를 제자리에 놓습니다 . 우세한 난포가있는 난소에서 시작하십시오.
- 질 벽과 지배적 인 여포의 벽을 바늘로 찔러 넣으십시오 (OPU 용 초음파 프로브에는 흡입 시스템에 연결된 바늘 용 채널이 있습니다). theneedle은 echographic 이미지에서 볼 수 있습니다.
- 흡입 시스템에 연결된 50 ML 원추형 튜브에 follicular 유체를 대기음. 원추형의 내용물을 붓는다.튜브를 큰 배양 접시에 넣고 stereomicroscope를 사용하여 cumulus-oocyte complex (COC)를 찾는다.
- COC는 항상 난포액으로 검색되지 않기 때문에, 5 IU / mL heparinat 37 ° C를 함유 한 Dulbecco의 변형 된 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 여포를 세척하십시오. 이미 1.1.5 단계에서 난포액에 대해 설명한대로 DPBS의 COC 존재를 검사하십시오. COC가 회수 될 때까지 여러 번 세척하십시오.
- 지배적 인 여포에서 COC가 검색되면, 1.1.3-1.1.4 단계에서 지배적 인 여포에 대해 설명한 바와 같이 ≥ 5 및 ≤25mm의 모공을 뚫고 플러시하십시오. 5 개 이상 ≤25 개는 황체 형성 호르몬 / 콜리 오가 나도 트로 핀 수용체 (LHCGR)를 발현하지 않으므로 hCG에 반응하여 성숙하지 않으며 GV 단계 (미성숙)에서 수집됩니다. 여러 가지 완전한 층의 적운 세포와 갈색, 미세하게 과립 화 된 ooplasm으로 만 COC를 유지하십시오. 다른 사람들은 버립니다.
- OPU가 끝날 때,감염을 방지하기 위해 수컷은 벤질 - 페니실린 15,000IU / 동물을 투여하십시오.
- 최소한 2 시간 동안 조용하고 깨끗한 상태에서 암말을 입으십시오. 귀의 위치, 자극에 대한 반응 ( 예 : 소음)을 측정하고 암말을 다른 동물의 회사에 반환하기 전에 걸음 걸이로인지의 흔적을 확인하십시오.
- 매일 성인 암말 집단에서 난소 난소의 직경을 초음파로 평가합니다. 난포가 33 mm 이상일 때, 정맥 정맥 상부에 1,500 IU의 인간 chorionic gonadotrophin (hCG)을 주입한다 (iv).
- 체외 성숙
- 헤파린 1,790 IU / L, 0.4 % 소 혈청 알부민 (BSA), 페니실린 및 스트렙토 마이신을 보충 한 따뜻한 HEPES- 완충 된 TCM199 (20 mM Hepes) 37 ° C. 미리이 매체를 준비하십시오. 필터를 살균하고 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 50 NG / ML 상피 성장 인자 (EGF)와 20 % 송아지 혈청 7 NaHCO 3 - 보충 TCM199 (25 MM NaHCO 3 ) 보완하여 IVM 매체를 준비합니다. 새로운 병을 뗀 후 3 주 이내에 NaHCO 3 보충 TCM199를 사용하십시오. EGF를 미리 100x 배지로 준비하고 -20 ° C에서 동결 시켜라.6 개월 이내에 사용하십시오. 최소한 2 시간 동안 38.5 ° C에서 5 % CO 2 가 포함 된 가습 공기 중에서 4-well dish의 웰에 500 μL를 분배하고 배양하십시오.
- 5 ~ 25 밀리미터 이상 모낭에서 COC를 회수 한 후 HEPES-TCM199 2 mL가 채워진 페트리 접시 (직경 3.5 cm)에 넣으십시오. 세포 파편을 씻어 내기 위해 COC를 접시의 다른 영역으로 옮기십시오.
- COCs를 IVM 배지에 옮기고 38.5 ° C에서 5 % CO2의 가습 공기 중에서 28 시간 배양합니다.
2. 면역 형광 및 이미지 분석
- 염색체 수
- 우세한 모낭 또는 IVM의 끝에 수집 후, 38.5 ° C에서 5 % CO 2 와 가습 공기에서 1 시간 100 μm의 monastrol와 COC를 품어. monastrol을 미리 100x 축척으로 준비하고 -20 ° C에서 1 년까지 저장할 수 있습니다.
- 적운 세포 제거0.5 % hyaluronidase로 치료하거나 부드럽게 pipetting; 0.2 % pronase에서 처리하여 투명대를 제거합니다. 사전에 hyaluronidase와 pronase를 10x 배지로 준비하고 -20 ° C에서 1 년까지 보관하십시오.
- 4 ° C에서 추가로 45 분 후 38.5 ° C에서 15 분 동안 DPBS의 4 % paraformaldehyde에 난 모세포를 수정.
주의! 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염 된 물질을 처리하십시오. - 0.1 % 폴리 비닐 알콜 (PVA)을 보충 한 DPBS 500 μL로 채워진 3 개의 웰에 순차적으로 옮겨 난 모세포를 세척한다. 실온 (RT)에서 10 분 동안 0.3 % Triton X-100에서 침투.
- RT에서 적어도 30 분 동안 1 % 소 혈청 알부민 (DPBS-1 % BSA)과 10 % 정상 당나라 혈청을 보충 한 DPBS에서 비특이적 결합 배양을 차단하십시오. 시료는 4 ℃에서 3 ~ 4 일 동안 blocking 용액에 보관할 수 있습니다.
- 기본 얼룩 들어, 4 ° C 하룻밤 1 % BSA (희석 1시 50 분)로 보충 DPBS의 토끼 방지 오로라 B phospho - Thr232에 oocytes를 품어.
- 단계 2.1.4에서 설명한대로 oocytes를 씻으십시오. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 tetra - methylrhodamine isothiocyanate (TRITC) - 결합 당나귀 안티 - 토끼 IgG (DPBS - 1 % BSA에 1 : 100)의 oocytes을 품어.
- 단계 2.1.4에서 설명한대로 oocytes을 씻어 다음 유리 슬라이드에 20 μm의 YOPRO1 보충 비 경화, 안티 페이드 장착 매체 한 방울에 3-4 oocytes를 놓으십시오. 모든 난 모세포가 장착 될 때까지 절차를 반복하십시오 (슬라이드 당 3-4 개의 난 모세포).
- oocytes가 장착 매체에 약 10 분 동안 정착 수 있도록하고 coverslip으로 그들을 커버. oocytes을 분쇄하지 않도록, 유리 슬라이드에 coverslip을 배치하기 전에 양면 테이프 두 스트립을 적용합니다.
참고 :이 예방 조치는 모든 샘플이 유리 슬리드 coverslip. 유리 슬라이드는 -20 ° C에서 얼 수 있으며 다음 2-3 일 동안 이미지화됩니다. - 적색 (centromeres) 및 녹색 (염색체) 채널 7 , 13 , 14 , 20 , 21을 사용하여 60X 목적과 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에 샘플을 이미지. 0.35 μm 간격으로 z 축에 전체 metaphasic 플레이트에 걸친 샘플을 스캔하십시오. 모든 단일 계획의 디지털화 된 이미지를 저장하십시오.
- NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html에서 구할 수 있음)의 셀 카운트 기능을 사용하여 직렬 공 촛점 절에서 센트로 메어를 센다.
참고 : 숫자 코드가있는 순차적 섹션에서 나타나고 머물러 있고 사라지는 중심체를 식별하여 인접한 섹션에 나타나는 centromeres의 반복 횟수를 피하십시오. - 염색체를 반복한다.독립 운영자에게 2.1.11 절에서 unting.
참고 : euploid (32 염색체), 과잉 배수 (> 32) 또는 저배수 (<32)로 난 모세포를 분류하십시오.
- 스핀들 형태와 히스톤 아세틸 화
- 지배적 인 여포 또는 IVM의 끝에 수집 후, 단계 2.1.2에서 설명한대로 0.5 % hyaluronidase 또는 부드러운 pipetting으로 치료하여 cumulus 세포를 제거합니다.
- 단계 2.1.4에서와 같이 DPBS - PVA의 oocytes을 씻고 38 ° C에서 20 분 동안 2.5 % 파라 포름 알데히드에 그들을 수정. 단계 2.1.4에서 설명한대로 광범위하게 씻어서 0.1 % Triton X-100에서 5 분간 RT에서 투과 시키십시오.
참고 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염 된 물질을 처리하십시오. - 2 % 소 혈청 알부민 (DPBS - 2 % BSA), 0.05 % 사포닌 및 10 % 정상 당나라 혈청을 보충 한 DPBS에서 비특이적 결합 배양을 차단RT에서 2 시간.
참고 : 시료는 4 ℃에서 3 ~ 4 일 동안 블로킹 용액에 보관할 수 있습니다. - 기본 얼룩 들어, 밤새 4 ° C에서 0.05 % 사포닌과 DPBS - 2 % BSA에서 마우스 anti-alpha-tubulin (1 : 150) 및 토끼 anti-acH4K16 (1 : 250)에서 oocytes를 품어.
- 단계 2.1.4와 같이 oocytes을 씻으십시오. 0.05 % 사포닌을 함유 한 DPBS-2 % BSA에서 녹색 형광 염료 - 접합 당나귀 항 마우스 IgG (1 : 500) 및 TRITC- 결합 당나귀 항 - 토끼 IgG (1 : 100)의 용액에서 난 모세포를 1 시간 동안 항온 배양한다 어둠 속에서 RT.
- 단계 2.1.4에서와 같이 난 모세포를 씻어 낸 다음 1 μg / ML 4 ', 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)을 보충 한 비 경화, 안티 - 페이드 장착 매체 한 방울에 3-4 oocytes를 놓습니다. 유리 슬라이드에.
- 단계 2.1.8에서 설명한대로 유리 슬라이드에 oocytes를 탑재합니다.
- 빨간색 (acH4K16), 녹색 (알파 - 튜 불린) 및 파란색 (DNA) 채널을 사용하여 60x 대물 렌즈로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 샘플을 이미지화하십시오.
참고 : 모든 샘플을 수집하는 동안 빨간색과 파란색 채널에 대한 레이저 설정을 일정하게 유지하십시오. 모든 감광 스핀들과 metaphasic 플레이트에 걸쳐 0.35 μm 간격으로 z 축에서 샘플을 스캔하십시오. 디지털화 된 이미지 (단일 계획 및 투사 된 3D 이미지)를 저장하십시오. - NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30)의 측정 기능을 사용하여 투영 된 이미지의 최대 너비에서 pole-to-pole 스핀들 길이와 스핀들 직경을 측정하십시오. .html). 각 3 번 반복하고 평균을 계산하십시오.
- NIH ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html)의 통합 밀도 기능을 사용하여 acH4K16의 상대적 형광을 정량화하십시오. DAPI 염색의 통합 밀도를 위해 표준화하십시오.
3. mRNA 발현 분석
- 5 ~ 25 mm 모낭에서 COC를 회수 한 후 육아종 세포를 수집합니다페트리 접시에 남아 uspension 및 2 분 10,600 XG에서 원심 분리하여 차가운 DPBS에서 두 번 씻으십시오. 액체 질소에서 급히 동결. -80 ° C에서 최대 6 개월 동안 샘플을 보관하십시오. 세포는 표준 곡선을 위해 봉사 할 것이다.
- 미숙 (GV), 체외에서 성숙 및 생체 내에서 성숙 oocytes에서 단계 2.1.2에서 설명한대로 모든 cumulus 세포를 조심스럽게 제거하십시오.
- 2.1.4에 설명 된대로 oocytes을 DPBS - PVA에서 씻어, 1 μL 볼륨에서 그들을 수집하고 위에 2 μL RNALater 누워. 액체 질소에서 급속 동결. -80 ° C에서 최대 6 개월 동안 샘플을 보관하십시오.
- 루키 페라 제 RNA 2 μg을 각 시료에 스파이크 인 (spike-in)으로 첨가하십시오. oocytes 2 X 2 풀과 작은 샘플에서 RNA를 복구하는 데 적합한 실리카 멤브레인 필터 기반 키트를 사용하여 전체 RNA를 추출하십시오.
- 37 μM에서 1 시간 동안 0.25 μg 무작위 hexamers 및 마우스 Moloney 백혈병 바이러스 역전사 효소와 10 μL에서 RNA 역전사 - 176 ℃. 최대 6 개월 동안 -20 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
- RNAse없는 물에서 granulosa 세포에서 cDNA를 50 NG / μL로 희석. 이 용액을 1:10으로 희석하여 5 ng / μL, 0.5 ng / μL, 0.05 ng / μL 및 0.005 ng / μL 용액을 얻으십시오.
- 기질로서 0.05 oocytes에 해당하는 cDNA 또는 granulosa 세포 cDNA의 연속 희석액 5 μL, SYBR 녹색 supermix 10 μL 및 각 특정 프라이머의 0.3 μm의를 사용하여 반응 당 총 20 μL의 총 볼륨에서 triplicate로 반응을 조립 표 1 ).
- 3 단계 프로토콜을 사용하여 열 순환 장치에서 반응을 실행하십시오 : 95 ° C 30 초, 60 ° C 30 초 및 72 ° C 20 초, 40 회 반복. 마지막으로, 60 ° C부터 시작하여 용융 곡선을 얻고 95 ° C까지 20 ° C마다 0.5 ° C 씩 온도를 올립니다.
- 표준 곡선을 사용하여 oocyte 샘플에서 특정 mRNA의 시작 수량 (SQ)을 평가granulosa 세포 샘플을 기준으로 계산 된 f> 15. 해당 유전자의 SQ와 하우스 키핑 유전자의 SQ 사이의 비율로 데이터를 표현하십시오.
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Representative Results
이 실험에 대한 최초의 발견은 앞서 깊이있게 설명되었으며 본원에서 기술 된 프로토콜을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예로서보고되었다.
성숙 비율
지배 모낭으로부터 OPU에 의해 회수 된 32 개의 COC 중 28 개 (88 %)가 MII 단계에 있었다. 크기가 5-25mm 인 모낭으로부터 수집 된 58 개의 COC 중 14 개는 mRNA 발현 연구를 위해 미성숙 난자로 즉각적으로 동결되었다. 나머지 44 명은 시험 관내에서 성숙되었고, 37 명은 MII 단계 (85 %)에 도달했다. 성숙 효율은 두 군에서 유의 한 차이가 없었다 (Fisher 's exact test P> 0.05).
이수 배수체 비율
IVM ca2 차 난 모세포와 첫 번째 극체 사이의 충실한 염색체 분할을 교란 시키면 MII 단계에서 염색체의 수를 계산하여 감수 분열 중 염색체 분리 결과를 나타냅니다. 그림 1A 에서 볼 수 있듯이, Anti-Aurora B phospho-Thr232 항체는 말 난 모세포의 동소체 영역을 특이 적으로 염색하여 염색체의 수를 세는 것을 허용한다. 생체 외에서 성숙한 난 모세포 (0/12, Fisher 's exact test, P <0.05, Figure 1B )와 비교했을 때, 시험 관내에서 성숙한 난 모세포가 이수 배수체 (5/11)에 의해 현저히 더 많은 영향을 받았다. 이수 배수체 난 모세포 (4/5)의 대부분은 과발현이었고; 따라서 염색체 전파와 같이 염색체 손실을 결정하는 표본 준비 과정에서 이수 배율은 인공물에 기인하지 않는다. 동위 원소 영역의 면역 염색도 항 -CENPA 및 항 -AURKB 항체로 시도되었지만, 신호는 관찰되지 않았다두 경우 모두에서 실현되었다 (데이터는 표시되지 않음).
스핀들 형태와 H4K16의 아세틸 화
그림 2 에서와 같이 pole-to-pole 스핀들 길이와 최대 폭에서 스핀들 직경이 측정되었습니다. 이 측정에 따르면, 생체 내 성숙 난 모세포 (길이 14.57 ± 1.7 μm, 직경 13.56 ± 0.91 μm, 비경제 t 세포)와 비교하여 체외 성숙 난 모세포가 19.89 ± 1.15 μm로 더 길고 (17.28 ± 0.81 μm) - 테스트, P <0.05). 동일한 샘플에서 H4K16의 전체 아세틸 화 수준도 측정되었으며, H4K16에서의 아세틸 화가 IVM 난 모세포 의 생체 내 대응 물 ( 그림 2 , 빨간색)과 비교하여 유의하게 낮았다는 것을 확인했습니다.
트란의 표현히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 및 탈 아세틸 화 효소를 암호화하는 스크립트
히스톤 아세틸 화 - 탈 아세틸 화 과정에 관여하는 유전자의 발현 이 시험 관내 - 성숙 난자에서 q-PCR로 조사되었는지 여부. Histone acetyl-transferase 1 ( HAT1 ), K-acetyltransferase 8 (KAT8 ), histone deacetylase 1 ( HDAC1 ), NAD-dependent protein deacetylase sirtuin 1 ( SIRT1 )이 추정 표적이었다. 미성숙, 시험 관내 성숙 및 생체 내 성숙 난자에서 이들 전사 물의 발현의 유의 한 차이는 사용 된 표준화와는 독립적으로 관찰되지 않았다. 구체적으로, 그림 3 에서보고 된 전사 발현 분석 결과는 SQ 방법을 사용하여 표준 곡선에 대해 계산되었고 하우스 키핑 글리세롤 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 ( GAPDH )에 대해 정상화되었다. 마찬가지로 diffe도 없습니다.결과는 루시퍼 라제의 스파이크에 대해 정상화 된 경우 또는 ΔΔct 방법을 사용했을 때 관찰되었다 (미도시).
| 목표 | Fw 프라이머 | Rv 프라이머 | Amplicon 크기 |
| 가프 | ATCACCATCTTCCAGGAGCGAGA | GTCTTCTGGGTGGCAGTGATGG | 241 bp |
| HAT1 | CTGACATGAGTGATGCTGAACA | TAACGCGTCGGTAATCTTCC | 219bp |
| HDAC1 | GAAGGCGGTCGCAAGAAT | CCAACTTGACCTCCTCCTTGA | 166bp |
| KAT8 | ACTGGTCTTGGGTCCTGCTG | GGGCACTTTTGAGGTGTTCC | 198 bp |
| 루시퍼 라제 | TCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTG d> | AGCCCATATCCTTGTCGTATCCC | 148bp |
| SIRT1 | GACTCGCAAAGGAGCAGATT | GGACTCTGGCATGTTCCACT | 169 bp |
표 1 : 프라이머 세트. 글리세롤 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 ( GAPDH ) , 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 1 ( HAT1 ) , 히스톤 ( HAT1 ) , 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 1 ( HAT1 ) ( HDAC1 ) , K- 아세틸 트랜스퍼 라제 8 ( KAT8 ) , 루시퍼 라제 및 NAD- 의존성 단백질 데 아세틸 라제 시트르산 ( SIRT1 )을 포함한다. 참고 문헌 7의 허락을 받아 증쇄.
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그림 1 : Vivo- 및 In Vitro 말의 난 모세포의 Aneuploidy rate. ( A ) monastrol로 치료 한 MII- 단계 말 난 모세포의 오로라 B 포스 포 -Thr232 (적색) 및 DNA (녹색) 염색을 나타내는 대표 이미지. 배수 이골 세포 (32 염색체)가 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. ( B ) 막대 그래프 는 생체 내 (n = 12) 및 시험 관내 (n = 11) 성숙 난 모세포에서의 배수체 및 이배체 MII- 단계 난 모세포의 분포를 나타낸다. * aneuploidy 속도의 유의 한 차이를 나타냅니다 (Fisher 's exact test, P <0.05). 참고 문헌 7의 허가를 받아 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Vivo- 및 In Vitro 말 성 난 모세포의 스핀들 측정 및 H4K16 아세틸 화. in vivo (n = 4) 또는 in vitro (n = 14) 성숙 후 MII 난 모세포에서 tubulin (녹색), acetylated H4K16 (적색) 및 DNA (청색)를 나타내는 대표 이미지. 튜 블린 이미지는 스핀들 길이와 직경 측정에 사용 된 축을 보여줍니다. 스케일 바 = 5 μm. 참고 문헌 7 에서 수정 됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : KAT8, SIRT1 , HAT1 , Immatu의 HDAC1다시, Vivo에서 , 및 In Vitro Matured Oocytes. 막대 그래프는 KAT8 , SIRT1 , HAT1 의 상대 mRNA 발현의 평균 ± SEM을 나타내고 , 및 HDAC1 , 하우스 키핑으로 사용 된 GAPDH 의 SQ와 비교하여 관심있는 성적 증명서의 시작 수량 (SQ)으로 표현됩니다. 미성숙 (GV, n = 14), 생체 내 (n = 14), 및 시험 관내 (n = 12) 성숙 난 모세포 사이에는 통계적 차이가 관찰되지 않았다 (일원 분산 분석, P > 0.05). 참고 문헌 7의 허락을 받아 증쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
비록 IVM이 20 년 이상 말에서 수행되었지만, 우리는 인간에게 제안 된 것처럼 난 모세포가 배아 이수 배체의 기원이 될 수 있는지 여부를 아직 모른다. 그 이유는 염색체 계수를위한 난 모세포의 준비가 상당한 표본 손실을 초래할 수 있기 때문일 것입니다. 이를 염두에두고 염색체 분리의 오류를 조사하는 데 사용 된 방법을 조사하여 말의 난 모세포에 적용 할 수있는 가장 적합한 기술을 찾아 냈습니다. 과학 문헌에서 네 가지 주요 기술이 발견되었습니다 : 1) 염색체 확산 5 , 18 , 19 , 2) 형광 in situ hybridization (FISH) 4 , 6 , 17 , 20 , 3) monastrol-collapsed spindle , 14 , 21 , 22 , 4) 염색체 수없이 염색체 형광 염색 23 , 24 , 25 .
이미 언급했듯이, Giemsa 염색이 뒤 따르는 염색체 확산의 준비는 높은 샘플 손실 속도로 인해 복잡합니다. 이 방법은 많은 경우 다른 프로브를 사용하여 다른 염색체를 매핑하는 FISH로 대체되었습니다. FISH 기법의 단점은 적은 수의 프로브가 사용될 때 가짜 음성의 발생률이 증가 할 수 있다는 것입니다 ( 즉, 누락 된 염기 또는 과다 염색체가 탐색되지 않았으므로 이수 배수 인 세포를 정상적으로 식별 할 수 있음). 따라서 FISH의 신뢰성있는 사용은 주로 이수 배수체에 의해 영향을 많이받는 염색체 의 선험적 지식에 기반한다 ( 예.., 인간의 21 번 염색체). FISH는 이전에 2 번 염색체 2와 4 번 염색체 20 에 대해 2 개의 프로브를 사용하여 말 태아의 염색체 이상을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 실험에 따르면, 체외에서 생산 된 배아의 핵은 생체 내에서 생산 된 배아보다 염색체 이상 에 의해 영향을 받기 쉽다. 이 발견은 IVM 난 모세포에서 monastrol-collapse 방법을 사용하여 위에서보고 된 관찰과 일치한다. 그러나 IVM 난 모세포에서 이수 배수체의 발병률 은 시험관에서 생산 된 배아 에서 FISH를 사용하여보고 된 것보다 훨씬 높았다. 이 부분적 불일치는 FISH 실험에 오직 두 개의 염색체 특이 적 프로브 만 사용되었다는 사실로 설명 할 수 있습니다. 이 접근법은 다른 염색체와 관련된 이수 배수성의 발생을 과소 평가했을 수 있습니다. 특히 말에는 32 염색체가 있다고 생각할 때 그렇습니다. 그러나 심각한 aneu는 제외 될 수 없습니다.중요한 유전 적 이상에 영향을받는 배우자가 더 발전하지 않기 때문에 난 모세포에서 검출 할 수있는 배수체는 배아에서 유지되지 않는다.
monastrol 처리, 염색체 및 centromere 얼룩 및 공 촛점 현미경 검사의 조합은 최소 샘플 손실과 MII 단계 말의 oocytes의 염색체 번호의 일관된 카운트 허용. 말 oocytes에 대한이 기술을 개발에서 발생 기술적 한계는 말 특정 항체의 가용성이었다. Aurora B phospho- (Thr232)를 사용하기 전에 두 개의 다른 항체 (anti-Aurora B 및 anti-CENPA)가 동소체 얼룩을 생성하지 않았습니다. 주목할 만하게, anti-Aurora B 및 anti-CENPA는 이미 소 및 인간 세포에서 성공적으로 사용되었다 26 , 27 , 28 ; 그러므로 그들은 말과 관련이 없다고 결론 지었다. 이 기술은 또한 공 촛점 레이저 sc의 가용성에 의해 제한 될 수 있습니다anning 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어. 또한 운영자 유도 유물을 배제하기 위해서는 두 명의 독립 운영자가 장님으로 계산하는 것이 필수적입니다. monastrol-collapsed 스핀들의 염색체 수는 세포 형태학을 잘 보존하고 표본 손실을 방지하는 접근법이지만,이 기술은 염색체의 기본 수의 차이를 관찰 할 수 있습니다. 핵형 분석 및 경우에 따라 FISH에 의해 밝혀 질 수있는 다른 염색체 이상 ( 예 : 전좌, 분절 인터체인지 등 )에는 유익하지 않습니다.
염색체 분리의 오류는 염색체 수 23 , 24 , 25 번을 수행하지 않고 스핀들 및 염색체 면역 형광법으로 조사했습니다. 이 경우 심각한 변칙과 지연 또는 흩어져있는 염색체가있는 스핀들은 이상한 염색체의 흔적으로 간주됩니다나 분리. 따라서, 시험 관내 에서 흩어져 있던 염색체 가 시험 관내에서 성숙한 난 모세포 (aneuploidy에 의해 영향을 받기 쉬운 종류) 에서 관찰되었다. 그러나 염색체 계수는 정량화 할 수있는 정보를 전달하는 이점이 있습니다.
요약하면, 기술 된 다른 기술과 비교하여, monastrol 및 centromere 염색의 사용은 샘플 손실을 방지하고, 위음매의 발생을 최소화하고, 정량화 할 수 있다는 장점이 있습니다.
epigenetic 수정의 변경은 oocyte aneuploidy의 발병에 가능한 메커니즘으로 제안되었습니다 18 , 24 , 25 . 삼중 형광 염색을 사용하여 감작 스핀을 시각화하고 측정하고 지연 / 분산 염색체를 관찰하는 것이 가능했습니다. 동시에, 항체의 개발 덕분에H4K16의 아세틸 화 수준은 동일한 시료에서 수행되었습니다.이 접근법은 분석에 필요한 난 모세포의 양을 줄이고 H4 아세틸 화와 스핀들의 형태학을 연관시키는 두 가지 목적을 수행했습니다.
공유 단백질 변형의 정량화는 Western blot으로 수행 할 수있다. 그러나이 기술은 더 큰 샘플 크기를 필요로하며 형태학 연구를 위해 샘플의 무결성을 보존하지 못합니다. 삼중 형광 염색 접근법은 다른 히스톤 변형 및 잠재적으로 다른 2 차 항체 8 에 의해 인식 될 수있는 단백질에 적용될 수있다. 유일한 제한 요인은 말 특이 적 항체의 이용 가능성이다. 이런 맥락에서 저자는 말 모델에주의를 기울이는 것이이 종의 기본적인 생물학적 기작에 대한 관심을 증가시킬 수 있기를 희망하며,전용 도구.
마지막으로, 역전사 및 정량적 PCR (q-PCR)에 의해 수행 된 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDACs) 및 아세틸 트랜스퍼 라제 (HATs)를 코딩하는 mRNA의 발현 연구가 또한 기재되어있다. q-PCR은 널리 보급 된 기술이다. 그러나 말 oocytes에 대한 사용은 확산되지 않습니다. oocyte maturation 29 동안의 전사 활성의 일반적 침묵으로 인해 총 전사 양의 분석은이 배경에서 mRNA 안정성이나 분해 만 나타낼 수 있음을 명기하는 것이 필수적이다. 시험관 내 및 생체 내 성숙 사이 에서 전사 물의 상대적 발현의 차이는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 번역 및 post-translational 규제가 IVM에 의해 영향을받을 수 있음을 보여 주며 translational 및 po를 조사하기위한 다른 실험 접근법의 개발 필요성을 지적합니다단일 세포 수준에서의 단일 - 번역 메커니즘.
전반적으로, 본 연구는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 이 접근법은 인간이나 멸종 위기에 처한 종을 포함하여 낮은 회수율로 유사하게 영향을받는 다른 종의 난 모세포에 적용될 수 있습니다. 이 연구는 포유 동물의 생식 생물학에 대한 지식을 넓히고 불임에 대한 우리의 이해에 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 (LSCM) , Philippe Barrière 및 Thierry Blard의 매일 초음파 난소 스캐닝 및 hCG 주입에 대한 지원을 위해 Fabrice Vincent에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 "Regione Sardegna and Regione Lombardia"프로젝트 "Ex Ovo Omnia"(보조금 26096200에서 AML로)에 의해 지원되었습니다. "L' Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012"Fellowship (2012 년 FF로 계약), FP7-PEOPLE-2011-CIG, 연구 집행 기관 (REA) "Pro-Ovum"(부여 번호 303640 - VL); 유럽 사회 기금, 인적 자원 개발 부문 별 운영 프로그램 (2007-2013 년 계약 번호 : POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 in IM)이 공동으로 후원하는 농업 및 수의학 박사 과정이있다. in vivo oocyte collection은 Français du Cheval et de l' Equitation에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1,500 unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9 - 15 µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0.2 mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15,000 UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 |
References
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
