Summary
सशर्त reprogramming उपयोग मानव बाल चिकित्सा esophageal उपकला कोशिकाओं के विस्तार कोशिकाओं का एक रोगी विशेष आबादी कि ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए esophageal निर्माणों इंजीनियरिंग दोष या चोट का इलाज और चिकित्सीय जांच assays के लिए एक जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है।
Introduction
इसोफेजियल ऊतक इंजीनियरिंग और इओसिनोफिलिक ग्रासनलीशोथ (EOE) ने पिछले एक दशक में कई प्रयोगशालाओं में अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है। ऐसे esophageal अविवरता के रूप में जन्मजात दोष, लगभग 1 4000 में जीवित जन्मों, जो घेघा असमर्थता के प्रमुख के अधूरे विकास में यह परिणाम 1 खाने के लिए में देखा जाता है। घटना और EOE के प्रसार वृद्धि के बाद से कभी 1993 में रोग इकाई की पहचान EOE की घटनाओं में 10 / 100,000 प्रति व्यक्ति साल के लिए 0.7 से अलग और व्यापकता 43 / 100,000 2 के लिए 0.2 से लेकर पर किया गया है। लंबे अंतराल के esophageal अविवरता के इलाज के लिए एक नया आकर्षक शल्य दृष्टिकोण आरोपण मरीज की अपनी कोशिकाओं के उपयोग के लिए ऊतक निर्माणों को पैदा करने में होते हैं। सिंथेटिक मचान के साथ संयोजन के रूप में इन कोशिकाओं को एक ऑटोलॉगस का निर्माण है कि प्रतिरक्षा दमन की आवश्यकता नहीं है उत्पन्न होगा। कुछ समूह पहले से ही हमें जांच करने के लिए शुरू कर दिया हैesophageal ऊतक इंजीनियरिंग 3 के रूप में अच्छी तरह के रूप में देशी esophageal उपकला कोशिकाओं के उपयोग के लिए स्टेम कोशिकाओं की तरह के ई म्यूकोसा फिर से आबाद 4 - 7। रोग कि बाल चिकित्सा रोगियों की घेघा में मौजूद हैं अक्सर निदान या हस्तक्षेप के बिना अध्ययन करने के लिए मेहनत कर रहे हैं। इसके अलावा, उपयोग पशु मॉडल या इन विट्रो में EOE की तरह बाल रोगों के लिए सेल लाइन मॉडल अमर सटीक रोग रोगजनन या रोगी विशिष्ट मतभेद 8 धरना नहीं है। इसलिए, क्रम में इन विट्रो में एक मरीज की बीमारी की प्रक्रिया का अध्ययन करने की क्षमता विशेष बीमारी को ट्रिगर एंटीजन की पहचान, अंतर्निहित तंत्र का मूल्यांकन करने और दवा उपचार की जांच उपन्यास हो सकता है और जानकारी है कि मरीज के इलाज में सहायता कर सकते हैं के साथ चिकित्सकों प्रदान करेगा करने के लिए।
वहाँ कई ऑटोलॉगस या रोगी विशेष प्रकार की कोशिकाओं कि Tissu में उपयोग के लिए प्रस्तावित किया गया है किया गया हैई इंजीनियरिंग और मानव रोग रोगजनन का अध्ययन। हालांकि, इन प्रकार की कोशिकाओं में से कुछ एक बड़े पाड़ बीज या इन विट्रो अध्ययन में उच्च throughput प्रदर्शन करने के लिए एक विशिष्ट phenotype के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैं। Pluripotent या multipotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग अधिक से अधिक शोध चर्चा का विषय रहा है, हालांकि, सीमाओं और इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए कमियों को अच्छी तरह से 9 वर्णित किया गया है। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के उच्च बहस और कई नैतिक मुद्दों को प्रस्तुत करता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं teratomas है, जो एक ट्यूमर के समान हैं, अगर वे अपने pluripotent राज्य से पूर्व उन्हें एक जीवित मेजबान 10 में पहुंचाने के लिए भेदभाव नहीं कर रहे हैं के रूप में। इसके अलावा, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के उपयोग रोगी विशेष नहीं होगा और एक allogenic प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा दमन 10 के लिए जरूरत बटोर सकता है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) pluripotent कोशिकाओं है कि कर सकते हैंएक मरीज की अपनी कोशिकाओं से प्राप्त किया जा। ऐसी त्वचा कोशिकाओं के रूप में दैहिक कोशिकाओं, एकीकृत और गैर-एकीकृत विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हुए एक pluripotent राज्य के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इन कोशिकाओं को फिर ऊतक इंजीनियरिंग या बीमारी की जांच के लिए एक रोगी विशेष सेल के सूत्रों के रूप में सेवा करते हैं। इन कोशिकाओं में अवांछित आनुवंशिक सामग्री के एकीकरण के लिए एक चिंता का विषय है कई वर्णन किया है और भले ही दृश्यों रहे हैं पूरी तरह से हटा IPSCs सेल प्रकार, जहां से वे 11 प्राप्त किए गए दिशा में एक epigenetic "स्मृति" के संरक्षण के लिए दिखाई देते हैं। इन कोशिकाओं को भी विवो में teratomas फार्म यदि प्रत्यारोपण के 11 से पहले भेदभाव नहीं होगा। कई भेदभाव प्रोटोकॉल उपकला प्रजातियों 12, 13, 14 पर ध्यान केंद्रित कर जांच की गई है, हालांकि, यह ध्यान दें कि सेल प्रकार भेदभाव के अंत में जिसके परिणामस्वरूप समरूप और ओ नहीं हैं बहुत महत्वपूर्ण हैnly ब्याज की सेल प्रकार का एक अंश के पास है। यह कम पैदावार और वांछित सेल प्रकार शुद्ध करने के लिए की जरूरत में यह परिणाम है। हालांकि IPSCs एक संभावित रोगी विशेष सेल स्रोत हैं, इस प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए या तो ऊतक इंजीनियरिंग या बीमारी की जांच के लिए ब्याज की एक सेल प्रकार बहुत अक्षम है।
फेफड़ों के 15, स्तन 16, छोटी आंत 17, पेट के 18, मूत्राशय 19 और घेघा 20: मानव उपकला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक सहित मानव शरीर में दोनों रोगग्रस्त और गैर रोगग्रस्त ऊतकों की एक किस्म से पृथक किया गया है। यह ध्यान रखें कि मानव प्राथमिक कोशिकाओं जिसमें phenotype 21, 22 बनाए रखा है मार्ग की एक निश्चित संख्या है महत्वपूर्ण है। दुर्भाग्य से, इसका मतलब है कि कोशिकाओं की संख्या की बीमारी की जांच के लिए या एक इंजीनियर पाड़ बोने के लिए आवश्यकआरोपण के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है। इसलिए, नई तकनीक, जबकि अभी भी एक उपकला phenotype बनाए रखने मरीज की कोशिकाओं का विस्तार करने की जरूरत है। सामान्य और कैंसर उपकला फीडर कोशिकाओं और रॉक अवरोध का उपयोग कोशिकाओं की सशर्त reprogramming 2012 में लियू एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। 2 से 3। इस तकनीक कैंसर उपकला विकिरणित फीडर कोशिकाओं, रॉक अवरोध और सशर्त reprogramming माध्यम का उपयोग कर प्रोस्टेट और स्तन कैंसर की बायोप्सी से प्राप्त कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उपयोग किया गया था। लक्ष्य ऐसी दवा स्क्रीनिंग के रूप में इन विट्रो assays के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। इस तकनीक को "reprogramming" ये एक स्टेम या पूर्वज की तरह राज्य है, जो अत्यधिक proliferative है कोशिकाओं द्वारा अनिश्चित काल के लिए उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने में सक्षम है। यह दिखा दिया है कि इन कोशिकाओं को गैर-tumorigenic कर रहे हैं और क्षमता teratomas 23, 24 के लिए फार्म के पास नहीं है। इसके अलावा, कोईगुणसूत्र असामान्यताओं या आनुवंशिक जोड़तोड़ इस तकनीक को 23, 24 का उपयोग करते हुए संस्कृति में इन कोशिकाओं passaging के बाद उपस्थित थे। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं केवल ब्याज की मूल कोशिका प्रकार में अंतर करने में सक्षम हैं। इसलिए, इस तकनीक अमरता के लिए आवश्यकता के बिना रोग जांच या ऊतक इंजीनियरिंग के लिए रोगी विशेष उपकला कोशिकाओं का एक बड़ा जलाशय है।
रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के क्रम में एक विशिष्ट अंग से उपकला ऊतक प्राप्त करने के लिए रोगी जोखिम के कारण अक्सर सीमित है और हमेशा संभव नहीं है। esophageal रोग या दोष से पीड़ित लोगों के रोगियों के लिए, इंडोस्कोपिक बायोप्सी पुनर्प्राप्ति उपकला ऊतक कि अलग किया जा सकता है और सशर्त अनिश्चितकालीन सेल स्रोत है कि मरीज की घेघा की म्यूकोसा के लिए विशिष्ट है प्रदान करने के लिए reprogrammed प्राप्त करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण है। यह तो इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुमति देता हैउपकला कोशिकाओं के रोग प्रक्रियाओं और संभावित चिकित्सा विज्ञान के लिए स्क्रीन का मूल्यांकन करने के लिए। एक रोग प्रक्रिया है कि बहुत इस दृष्टिकोण से फायदा हो सकता eosinophilic ग्रासनलीशोथ, जो घेघा 8 की एलर्जी रोग के रूप में वर्णित किया गया है। एलर्जी परीक्षण के साथ ही चिकित्सकीय दृष्टिकोण मरीज की अपनी ही उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर इन विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है और इस डाटा तो इलाज चिकित्सक पर पारित किया जा सकता व्यक्तिगत उपचार योजना विकसित करने के लिए। बाल चिकित्सा रोगियों से इंडोस्कोपिक बायोप्सी प्राप्त करने के साथ संयोजन के रूप में सशर्त reprogramming की तकनीक किसी भी मरीज से अनिश्चित काल के लिए सामान्य esophageal उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने की क्षमता प्रदान करता है। यह सेल स्रोत इसलिए प्राकृतिक या कृत्रिम मचान के साथ एक साथ मिलकर किया जा सकता है दोष, बीमारी या मानसिक आघात के लिए एक रोगी विशेष शल्य चिकित्सा का विकल्प प्रदान करते हैं। अनिश्चितकालीन सेल नंबर होने esophageal निर्माणों कि अधिकारी एक पूरी तरह से reseeded इंजीनियर मदद मिलेगीआदेश में esophageal उपकला कोशिकाओं के साथ लुमेन शेष प्रकार की कोशिकाओं के उत्थान की सुविधा मदद करने के लिए।
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Protocol
सूचित सहमति के बाद बाल चिकित्सा रोगियों के माता-पिता / अभिभावक से और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी # 13-094) के अनुसार प्राप्त हुई थी इसोफेजियल बायोप्सी प्राप्त किया गया।
1. स्टरलाइज़ उपकरण और जिलेटिन समाधान
- आटोक्लेव संदंश, रेजर ब्लेड और ऊतक से निपटने के प्रदूषण को रोकने के लिए करने से पहले कैंची।
- 0.1% जिलेटिन समाधान के 200 एमएल बनाने के लिए, जिलेटिन की 0.2 ग्राम के साथ आसुत पानी की 200 मिलीलीटर गठबंधन। आटोक्लेव और शांत उपयोग करने से पहले।
2. कोटिंग टिशू कल्चर प्लेटें
- सेल अलगाव से पहले लगभग 2 घंटे, एक टिशू कल्चर पकवान (100 मिमी) को कवर किया और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए पर्याप्त 0.1% जिलेटिन जोड़ें।
नोट: ये प्लेटें भी समय से आगे कर दिया जा सकता है और उपयोग करने से पहले इनक्यूबेटर में रखा।
3. हदबंदी के लिए एंजाइम समाधान कर रही है
- लगभग 30 मिनट सेल अलगाव से पहले, बाहर तौलनाएक संतुलन शीशी पर मिलीग्राम प्रति एकाग्रता इकाइयों के आधार पर पर Dispase की 10 इकाइयों। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एमएल और जगह के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पाउडर रखें।
4. मेकिंग सेल संस्कृति माध्यम
- सशर्त reprogramming माध्यम के 50 एमएल बनाने के लिए, एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में निम्नलिखित सामग्री मिश्रण: F12 के 35 एमएल (हाम मध्यम), DMEM के 11.5 एमएल, एल glutamine के 0.5 एमएल, 100x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 एमएल, 2.5 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), मानव इंसुलिन के 250 माइक्रोग्राम, मानव epidermal वृद्धि कारक (EGF) के 500 एनजी की।
- 3T3 माध्यम की 500 एमएल बनाने के लिए, FBS के 50 एमएल, 100x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल और 500 एमएल DMEM के साथ एल glutamine के 5 एमएल मिश्रण।
- keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम के 500 एमएल बनाने के लिए, EGF और गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (BPE) की खुराक (मीडिया के साथ प्रदान की) पिघलना। आधार माध्यम के 500 मिलीलीटर की बोतल की खुराक जोड़ें और 10 के 5 मिलीलीटर जोड़ें0 x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन
एक फीडर स्रोत के रूप में 5. संवर्धन और Irradiating 3T3 कोशिकाओं
- 3T3 मध्यम शामिल DMEM, 10% FBS, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी एल glutamine तैयार करें।
- संस्कृति ऊतक इलाज टी 75 बोतल में कम से कम 3 दिन रोगी के नमूने के आने से पहले में 3T3 कोशिकाओं।
- बस रोगी के नमूने के आगमन, Trypsinize 3T3 5 कुप्पी प्रति 0.25% trypsin EDTA के और एमएल का उपयोग कोशिकाओं 5 मिनट के लिए या सबसे कोशिकाओं तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने से पहले चल रहे हैं
- 3T3 माध्यम के 5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए जोड़ें। सेल निलंबन Aspirate और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। 300 x जी 5 मिनट के लिए स्पिन।
- मध्यम Aspirate और सेल गिनती के लिए Trypan नीले रंग का एक निर्धारित मात्रा में कोशिकाओं resuspend। Trypan नीले रंग के 10 μL के साथ कोशिकाओं के 10 μL गठबंधन मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए। लोड 10 सेल गिनती के लिए एक hemocytometer पर इस समाधान के μL।
नोट: इस आद्य के लिएकर्नल, विकिरणित 3T3 कोशिकाओं के लिए बोने घनत्व 2 सेमी है, जो प्रति 100 मिमी प्लेट 600,000 कोशिकाओं के बराबर है प्रति 10,900 कोशिकाओं है। - 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 3T3 माध्यम के 25 एमएल में रोगी के नमूने और resuspend प्रति एक 100 मिमी थाली थाली और 3000 rads के साथ चमकाना करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या विभाज्य।
- बाद विकिरण, प्रति 100 मिमी प्लेट 5 एमएल पर सशर्त reprogramming माध्यम में 300 XG पर 5 मिनट और resuspend के लिए नीचे स्पिन कोशिकाओं।
- ट्यूब अलग सेट जब तक मरीज की कोशिकाओं के चढ़ाना प्रोटोकॉल में बाद में जगह लेता है (कदम 7.6 देखें)।
6. प्राप्त करने, संरक्षण और परिवहन बाल चिकित्सा इसोफेजियल बायोप्सी
- 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल primocin के साथ पूरा keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और बर्फ पर चिकित्सा सुविधा के लिए इसे लाने।
नोट: माध्यम के इन ट्यूबों अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - तिवारी पर लगभग 8 esophageal बायोप्सी प्राप्तमेरे एंडोस्कोपी की और अलग प्रकार है:
- 100 माइक्रोग्राम / एमएल primocin और गीला बर्फ पर जगह के साथ पूरा keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम से युक्त 15 एमएल शंक्वाकार में छह बायोप्सी रखें।
- बफर formalin और गीला बर्फ पर जगह के 5 एमएल में एक बायोप्सी रखें।
- इष्टतम काटने तापमान परिसर के साथ एक छोटे से cryomold बायोप्सी में एक बायोप्सी रखें।
- इसके तत्काल बाद isopentane की एक बीकर तरल नाइट्रोजन में रखा में इस ढालना ड्रॉप। एक बार जम, एक नमूना बैग में cryomold जगह और एक polystyrene फोम कंटेनर में सूखी बर्फ पर दुकान।
- मध्यम या formalin में बायोप्सी युक्त एक sealable बैग के अंदर और फिर गीला बर्फ युक्त एक शिपिंग बॉक्स में ट्यूबों रखें। सील और एक biohazard लेबल के साथ बॉक्स लेबल और प्रयोगशाला के लिए परिवहन।
नोट: कंटेनर कि सूखी बर्फ में शामिल है और जमे हुए बायोप्सी भी सील कर दिया है और एक Biohazard लेबल के साथ लेबल है।
7. प्रसंस्करणडाउनस्ट्रीम संस्कृति और विश्लेषण के लिए रोगी ऊतक
- प्रयोगशाला में आगमन पर, जमे हुए बायोप्सी सूखी बर्फ पर -80 के लिए सेल्सियस फ्रीजर नीचे की ओर सेक्शनिंग या आरएनए निकासी के लिए स्थानांतरण। formalin में नमूना रखें। एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर और रात भर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।
- 300 XG पर शेष बायोप्सी नीचे स्पिन और मध्यम aspirate। शंक्वाकार ट्यूब, सील करने के लिए Dispase समाधान के 10 एमएल जोड़ें और इसे 15 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें।
- ऊष्मायन के बाद, बायोप्सी पर 300 x जी नीचे स्पिन। 0.05% trypsin EDTA के 5 एमएल में मध्यम और resuspend बायोप्सी aspirate।
- trypsin EDTA के एक 100 मिमी बाँझ थाली करने के लिए बायोप्सी युक्त के 5 एमएल स्थानांतरण और 2 निष्फल रेज़र ब्लेड के रूप में संभव के रूप में ठीक का उपयोग कर बायोप्सी कीमा।
- एक नया 15 एमएल शंक्वाकार को trypsin-EDTA कीमा बायोप्सी युक्त के 5 एमएल स्थानांतरण। 0.05% trypsin EDTA के एक अतिरिक्त 5 एमएल के साथ दो बार प्लेट कुल्ला और शंक्वाकार में जोड़ने के लिएट्यूब। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, बायोप्सी 5 मिनट के लिए 300 XG (1.4 आरपीएम) पर नीचे स्पिन और मध्यम aspirate। सशर्त reprogramming माध्यम के 5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के साथ-साथ सशर्त reprogramming विकिरणित फीडर कोशिकाओं से युक्त मध्यम के 5 एमएल में जोड़े (कदम 5.7 देखें)।
- टिशू कल्चर पकवान से जिलेटिन श्वास के बाद सेल निलंबन और प्लेट के 10 एमएल के लिए रॉक अवरोध (1 μL / एमएल) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
8. संवर्धन और विस्तार प्रकोष्ठों
- संस्कृति के लगभग 5 दिनों के बाद, कीमा-बायोप्सी टुकड़े युक्त प्रारंभिक मध्यम aspirate और 5 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ पकवान कुल्ला 2-3 बार। 10 माइक्रोन पर रॉक अवरोध सहित थाली करने के लिए नए माध्यम जोड़ें।
- 70% confluency तक पहुँचने पर, कोशिकाओं का विस्तार। 0.05% trypsin EDTA के 5 एमएल प्लेट में जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते वें दूर करने के लिए कोई अधिक से अधिक 2.5 मिनटई फीडर कोशिकाओं। कि ऊष्मायन के बाद, trypsin-EDTA aspirate और पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ थाली कुल्ला।
- पीबीएस Aspirate और प्लेट को 0.25% trypsin EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाओं की थाली से ढीली कर रहे हैं सेते हैं। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए तरल पदार्थ के सभी हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन करने के लिए थाली करने के लिए माध्यम के बराबर मात्रा में जोड़ें।
- सशर्त reprogramming माध्यम की एक निर्धारित मात्रा में Resuspend कोशिकाओं और trypan नीले रंग के 10 μL के साथ निलंबन के 10 μL मिश्रण। एक hemocytometer पर गणना की कुल सेल नंबर निर्धारित करने के लिए।
- कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए, साथ में 12 लाख 15 एमएल की कुल मात्रा में किरणित 3T3 कोशिकाओं के साथ एक 150 मिमी थाली करने के लिए 1 लाख मानव esophageal कोशिकाओं जोड़ें। 10μM पर ताजा रॉक अवरोध जोड़ें और एक जिलेटिन लेपित 150 मिमी पकवान के लिए सेल निलंबन जोड़ें।
9. रुक और स्टोर मानव इसोफेजियल उपकला कोशिकाओं
- ठंड मध्यम बनाने के लिए, 10%सशर्त reprogramming मध्यम करने के लिए DMSO। trypsinizing और उनकी गिनती के बाद, एक नया 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फ्रीज और 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन करने के लिए कोशिकाओं विभाज्य।
- मध्यम Aspirate और cryovial प्रति 2 मिलीलीटर की मात्रा में ठंड मध्यम जोड़ें। एक बार सेल निलंबन समरूप है, विभाज्य पूर्व लेबल cyrovials में 10 6 कोशिकाओं। कम से कम 24 घंटे के लिए लंबी अवधि के तरल नाइट्रोजन भंडारण करने के लिए शीशियों जाने से पहले के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंड कंटेनर में रखें।
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Representative Results
रोगी बायोप्सी से esophageal उपकला कोशिकाओं को अलग करने में महत्वपूर्ण कदम का एक सारांश चित्रा 1 में संक्षेप। उपकला कोशिकाओं की कालोनियों लगभग 4-5 दिनों में बनेगी और fibroblast फीडर कोशिकाओं (2A चित्रा) से घिरा हो जाएगा। इन कालोनियों का विस्तार रूप में वे अन्य कालोनियों के साथ विलय बड़ा कालोनियों (चित्रा 2 बी) के रूप में होगा। एक बार जब संस्कृतियों 70% मिला हुआ हो गए हैं, वे विस्तार किया जा करने के लिए (चित्रा -2) की जरूरत है। यह सुनिश्चित करें कि fibroblasts थाली से उपकला कोशिकाओं को हटाने से पहले हटा रहे हैं, 0.05% trypsin EDTA फीडरों को दूर करने के लिए 2.5 मिनट के लिए प्रयोग किया जाता है। फीडरों के अभाव 2 डी चित्रा के लिए इसी तरह दिखना चाहिए। पक्षपाती उपकला कोशिकाओं तो 0.25% trypsin EDTA के साथ trypsinized और नए विकिरणित फीडर कोशिकाओं (चित्रा 2 ई) पर replated रहे हैं।
(चित्रा 3 ए बढ़ जाती है )। इन कोशिकाओं को भी प्रवाह cytometry के माध्यम से उपकला मार्करों के लिए मार्ग 1 पर विश्लेषण किया गया और तीन रोगियों से मौजूद कोशिकाओं के 90% से अधिक EpCAM (चित्रा 3 बी) के लिए सकारात्मक थे। कोशिकाओं को भी मार्ग 1 और 3 में immunofluorescence के माध्यम से विश्लेषण किया गया यह सुनिश्चित करने के लिए उन 3 मार्ग के ऊपर phenotype में बदलाव नहीं किया गया था। धुंधला उपकला मार्कर ई cadherin के हठ को दर्शाता है (चित्रा -4 ए-डी), पूर्वज मार्कर P63 (चित्रा 4E-एच), प्रसार मार्कर KI-67 (चित्रा 4I-एल) और उपकला तंग जंक्शन प्रोटीन TJP1 (चित्रा 4M-P )।
अन्त में, एक विकास की अवस्था सशर्त reprogramming संस्कृति में इन कोशिकाओं की दुगनी समय का मूल्यांकन करने के लिए एक गैर रोगग्रस्त रोगी से एक सेल लाइन का उपयोग कर साजिश रची गई थी। प्रकोष्ठों 0 दिन में 100,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया गया और दिन 4 (चित्रा 5) पर बस थोड़ा 500,000 से अधिक कोशिकाओं हो पाए गए। दुगनी समय लगभग 36-40 ज होने की गणना की गई थी। यह उम्मीद है कि रोगग्रस्त कोशिकाओं को एक धीमी दोहरीकरण समय होगा, हालांकि, हर मरीज व्यक्तिगत मतभेदों के लिए खाते में अलग से मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
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चित्रा 1: बाल चिकित्सा बायोप्सी से अलगाव और संवर्धन मानव इसोफेजियल उपकला कोशिकाओं का अवलोकन। बायोप्सी सूचित सहमति के बाद बाल चिकित्सा रोगियों से प्राप्त की और प्रयोगशाला में keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम में ले जाया जाता है। ये बायोप्सी तो 1 यू / dispase एमएल, बाँझ रेज़र ब्लेड के साथ ऊतक नख़रेबाज़ और अंत में 0.05% trypsin EDTA के साथ इलाज के बाद के साथ व्यवहार कर रहे हैं। सेल निलंबन तो सशर्त reprogramming माध्यम में विकिरणित फीडर कोशिकाओं को जोड़ा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: संवर्धन और मानव इसोफेजियल उपकला कोशिकाओं का विस्तार। सशर्त reprogram में 5 दिनों के बादमिंग मध्यम, esophageal उपकला कोशिकाओं छोटे पत्थर कालोनियों (ए), जो कि अंत में बड़ा कालोनियों (बी) के रूप में एकाग्र आकार लेने लगते हैं। एक बार जब टिशू कल्चर पकवान 70% संगम तक पहुँच जाता है (सी), प्लेटें 0.05% trypsin EDTA के साथ एक बहुत ही संक्षिप्त समय के लिए इलाज कर रहे हैं, जबकि अभी भी उपकला कोशिकाओं (डी) के पालन को बनाए रखने, फीडर कोशिकाओं को हटाने के लिए। उपकला कोशिकाओं तो 0.25% trypsin EDTA के साथ हटा दिया है और नए फीडर कोशिकाओं के साथ replated रहे हैं। बस 24 घंटे इन कोशिकाओं वे नई कालोनियों के रूप में और पैदा करने के लिए जारी रहेगा (ई) के बंटवारे के बाद। बढ़ाई 100X है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: फ्लो और qRT-Pसंस्कृति में विस्तार कोशिकाओं की सीआर विश्लेषण। (ए) सशर्त reprogramming के पारित होने पर 1 संस्कृति में कोशिकाओं के प्रतिनिधि जीन अभिव्यक्ति P63 अभिव्यक्ति में एक 6 गुना वृद्धि हुई है, पूर्वज कोशिकाओं के एक मार्कर के रूप में अच्छी तरह से रूप में बायोप्सी जीन अभिव्यक्ति की तुलना में उपकला मार्कर CDH1 और TJP1 में कमी का प्रदर्शन किया। यह इंगित करता है सेल की आबादी एक अधिक पूर्वज की तरह राज्य में है और इसलिए अधिक अत्यधिक proliferative है। जीन अभिव्यक्ति 24 घंटे के बाद प्रोग्रामिंग (फीडर कोशिकाओं और रॉक अवरोध करनेवाला के हटाने के बाद) CDH1 और TJP1 अभिव्यक्ति लेकिन P63 अभिव्यक्ति में कमी वृद्धि हुई दर्शाता है। (बी) के पारित होने के 1 पर प्राप्त कई रोगियों से कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण कोशिकाओं EpCAM व्यक्त करने का 90% से अधिक प्रदर्शित करता है। रोगी 27, गैर EOE मरीज की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि मरीजों को 26 और 28 EOE रोगी कोशिकाओं रहे हैं। कृपया यहाँ क्लिक करें टीओ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 4: मार्ग 1 पर कोशिकाओं और 3 कोशिकाओं विकिरणित फीडर कोशिकाओं के साथ सशर्त reprogramming माध्यम में हो के immunofluorescence धुंधला Express ई-Cadherin (ए - डी) के साथ ही पूर्वज मार्कर P63 (ई - एच)। इन कोशिकाओं को अभी भी पारित होने के 3 (- एल आई) पर proliferative हैं। अन्त में, इन कोशिकाओं को तंग जंक्शन प्रोटीन 1 (TJP1) है, जो भी एक उपकला phenotype (- पी एम) के साथ संगत है व्यक्त करते हैं। नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं और एंटीबॉडी के एक एलेक्सा स्त्राव 546 एंटीबॉडी (नारंगी) का उपयोग करते हुए पाया जाता है। 2 एन डी एंटीबॉडी (अब) नियंत्रण गैर विशिष्ट ऊतक (क्यू, आर) के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल सलाखों = 50माइक्रोन। बढ़ाई 200X है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: सशर्त Reprogramming में कोशिकाओं के विकास की अवस्था। एक गैर रोगग्रस्त रोगी से सशर्त reprogramming माध्यम से कोशिकाओं को एक परिभाषित घनत्व वरीयता प्राप्त और प्रतिकृति की तीन 4 दिनों के लिए प्रत्येक दिन गिना रहे थे रहे थे। विकास की अवस्था 36-40 ज इन कोशिकाओं की गिनती का उपयोग कर और दुगनी समय 4 दिन और दिन 0. इन कोशिकाओं की दुगनी समय पर प्राप्त की संख्या के आधार पर गणना की गई है लगभग तैयार की गई थी। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
आदेश में मरीज बायोप्सी से अलग और esophageal उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) पर्याप्त रूप से कम से कम कोशिका मृत्यु के साथ बायोप्सी ऊतक अलग कर; 2) यह सुनिश्चित रॉक अवरोध हर मध्यम परिवर्तन पर सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जाता है; 3) की सिफारिश की तुलना में अधिक फीडर कोशिकाओं का उपयोग न करें; 4) एक स्वच्छ मम्मियाँ संस्कृति को बनाए रखने; और 5) पारित होने कोशिकाओं सिर्फ संगम तक पहुंचने से पहले।
सशर्त reprogramming के लिए प्राप्त की बायोप्सी नमूने में रोगी से संबंधित मतभेदों के कारण, यह विकास कैनेटीक्स, फेनोटाइप और कई मार्ग के विस्तार करने की क्षमता में मतभेद उम्मीद करना उचित है। आमतौर पर, 4 esophageal बायोप्सी सेल अलगाव के लिए प्रत्येक रोगी से प्राप्त कर रहे हैं। एक बार अलग, हम 0 दिन में लगभग 300,000-600,000 कोशिकाओं यह औसत पर पारित होने के 3 से 10 लाख से अधिक कोशिकाओं के लिए फैलता जाल। कालोनियों कि फार्म cobblestone आकारिकी उपकला सेल लाइनों के लिए वर्णित करने के लिए इसी तरह दिखना चाहिए की आकृति विज्ञान <समर्थन वर्ग = "xref"> 25 (चित्रा 2)। संस्कृति में कोशिकाओं का एक नमूना QRT- पीसीआर के माध्यम से विश्लेषण किया जाना चाहिए, प्रवाह cytometry और उपकला मार्करों के लिए immunofluorescence सुनिश्चित करने के लिए आबादी के विस्तार (चित्रा 3) मूल में वास्तव में उपकला हैं। कोशिकाओं उपकला मार्कर (ई-Cadherin, EpCAM, TJP1) व्यक्त नहीं करना चाहिए, सेल लाइन समाप्त और खारिज किया जाना चाहिए। यह उम्मीद है कि वर्तमान कोशिकाओं के 90% से अधिक है, तो वे मूल में उपकला रहे हैं EpCAM सकारात्मक रहे हैं। आदेश संस्कृतियों phenotype बदल रहा है या उपकला अभिव्यक्ति, immunofluorescence खो रहे हैं, तो मूल्यांकन नहीं है या प्रवाह cytometry उपकला मार्कर (ई cadherin), पूर्वज अभिव्यक्ति (P63), और उपकला तंग जंक्शन प्रोटीन (TJP1) का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए करने के लिए। कोशिकाओं passaged हैं यह उम्मीद है कि phenotype परिवर्तन नहीं होना चाहिए के रूप में, प्रसार में कमी नहीं होनी चाहिए और इन कोशिकाओं उपकला अभिव्यक्ति के साथ ही पूर्वज अभिव्यक्ति (चित्रा 4 प्रदर्शित करना चाहिए (चित्रा 5) की आबादी दुगनी समय हो गया लगता है। कोशिकाओं है कि अधिक से अधिक 5 दिनों के लिए दोगुना करने के लिए नहीं मिला रहे वृद्ध होनेवाला होने की संभावना है और खारिज किया जाना चाहिए।
यह वर्णित किया गया है कि इस तरह के EOE के रूप में उपस्थित सूजन प्रक्रियाओं, के साथ रोगियों से अलग कक्षों, उपकला कोशिकाओं एक कम proliferative दर है कि अधिकारी, में कमी आई ई cadherin अभिव्यक्ति (चित्रा 3, मरीजों को 26 और 28) और apoptosis 26 की एक उच्च दर। इसलिए, यह एक गंभीर रूप से बीमार मरीज को इस पद्धति का उपयोग करने से कठिनाई संवर्धन कोशिकाओं के लिए करना अनुचित नहीं है। यह संभव है कि कोशिकाओं केवल कुछ अंश या अभी भी प्रारंभिक पारित होने का सामना करेंगे। यह अभी भी मूल रूप से अलग-थलग से कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के साथ अन्वेषक प्रदान करना चाहिए। हालांकि, इस संख्या पर्याप्त नहीं हो सकता हैसभी प्रस्तावित अध्ययन के लिए। चूंकि इन कोशिकाओं अंततः esophageal बीमारी अध्ययन या एक esophageal प्रतिस्थापन का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, यह इन कोशिकाओं श्लैष्मिक उत्थान के लिए ही जिम्मेदार हैं याद रखना महत्वपूर्ण है। ऐसे fibroblasts, न्यूरॉन्स, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं को भी बस के रूप में esophageal रोग का अध्ययन करने के लिए और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं।
इस तकनीक में एक रोगी विशेष सेल स्रोत है कि रोग रोगजनन का अध्ययन करने के साथ ही esophageal ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए रोगी विशेष कोशिकाओं का एक संभावित जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए एक अमूल्य उपकरण है प्रदान करता है। शल्य आरोपण के लिए biomaterials बोने के लिए उपयोग कोशिकाओं आनुवंशिक असामान्यताएं, वायरल दृश्यों से मुक्त होना चाहिए और teratomas फार्म नहीं। स्टेम सेल (multipotent या pluripotent) के उपयोग के भेदभाव के बाद भी कई प्रकार के अवांछित सेल उत्पन्न करता है, जिनमें से कुछ teratomas फार्म कर सकते हैं अगर वे एडवेंचर्स गुजरना नहीं कियाtiation। इसके अलावा, इस सेल स्रोत phenotype के अनुरूप है और शुद्धि या अवांछित कोशिकाओं को हटाने की आवश्यकता नहीं है। आदर्श सेल स्रोत कोशिकाओं है कि एक ही संरचनात्मक स्थान है कि इंजीनियर जा रहा है में पाए जाते हैं होगा। इस दृष्टिकोण में इन esophageal उपकला कोशिकाओं एक esophageal पाड़ की म्यूकोसा फिर से आबाद करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं esophageal उत्थान के लिए आवश्यक हैं; हालांकि, इस तकनीक का ध्यान केंद्रित सुनिश्चित करने के लिए म्यूकोसा reseeded किया गया था और अधूरा के रूप में इस रिसाव, निंदा और वेध का कारण बन सकता था नहीं।
घेघा के लिए नई शल्य चिकित्सा विकल्प इंजीनियरिंग के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए इसके अलावा, इन कोशिकाओं को भी नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण इन शर्तों का इलाज करने के लिए esophageal रोग प्रक्रियाओं के साथ ही स्क्रीन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Eosinophilic ग्रासनलीशोथ (EOE) घेघा की एक एलर्जी रोग के रूप में वर्णन किया गया है, सटीक व्यवस्था और रोगजनन नहीं अभी तक पूरी तरह से वर्णित हैं। वर्तमान उपचार regiments उन्मूलन आहार, मौखिक स्टेरॉयड और कई endoscopies शामिल हैं। कोई परख क्या प्रत्येक रोगी है, जो डॉक्टरों ओर जाता है एक "अनुमान और जाँच" का उपयोग दृष्टिकोण है जो लंबी और अक्सर रोगी के लिए निराशा होती है करने के लिए भड़काऊ प्रक्रिया चलाता मूल्यांकन करने के लिए मौजूद है। चूंकि रोगी विशेष सेल विस्तार की इस पद्धति lentiviral पारगमन या आनुवंशिक संशोधन का उपयोग नहीं करता, reprogramming प्रक्रिया से कोशिकाओं के जीनोटाइप को स्थायी बदलाव की संभावना बहुत कम है। इसका मतलब यह है की कोशिकाओं को सैद्धांतिक रूप से इन विवो पर्यावरण से अपरिवर्तित ही रहेंगे। इन विट्रो में मरीज की कोशिकाओं का परीक्षण करने की क्षमता की पहचान करने के लिए ट्रिगर एजेंट उपन्यास होगा और अंतत: नए निदान या इन बाल चिकित्सा रोगियों के लिए चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए नेतृत्व कर सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
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