Summary
L'espansione del pediatrici cellule epiteliali umane esofagee che utilizzano riprogrammazione condizionale fornisce gli investigatori con una popolazione paziente-specifici di cellule che possono essere utilizzati per l'ingegneria costrutti esofagei per l'impianto autologo per il trattamento di difetti o lesioni e di fungere da serbatoio per test di screening terapeutici.
Introduction
ingegneria dei tessuti dell'esofago e esofagite eosinofila (EoE) sono stati al centro della ricerca in molti laboratori nel corso dell'ultimo decennio. Difetti congeniti, come atresia esofagea, si osservano in circa 1 su 4000 nati vivi, che si traduce nello sviluppo incompleto dell'esofago porta alla incapacità di mangiare 1. L'incidenza e la prevalenza di EoE sono in aumento da quando l'identificazione del soggetto malattia nel 1993. L'incidenza di EoE varia 0,7-10 / 100.000 a persona-anno e la prevalenza variava 0,2-43 / 100.000 2. Un nuovo approccio chirurgico interessante per il trattamento a lungo divario atresia esofagea consiste nel generare costrutti di tessuto per l'impianto che utilizza le cellule del paziente. Queste cellule in combinazione con impalcature sintetica genera un costrutto autologo che non richiede immunosoppressione. Alcuni gruppi hanno già iniziato ad indagare negli Stati Unitie di cellule staminali-simili per l'ingegneria tissutale esofageo 3 nonché l'uso di cellule epiteliali dell'esofago nativi per ripopolare mucosa 4 - 7. Malattie che sono presenti in esofago di pazienti pediatrici sono spesso difficili da diagnosticare o studiare senza intervento. Inoltre, utilizzando modelli animali o in vitro immortalati modelli di linee cellulari per le malattie pediatriche come EoE non comprendere l'esatta patogenesi della malattia o differenze specifiche del paziente 8. Pertanto, la capacità di studiare processo patologico di un paziente in vitro per identificare specifici innescare malattie antigeni, valutare meccanismi sottostanti e indagare trattamenti farmacologici sarebbe romanzo e fornire ai medici informazioni che possono aiutare nel trattamento del paziente.
Ci sono stati molti tipi di cellule autologhe o paziente-specifici che sono stati proposti per l'uso in tissue di ingegneria e studiare la patogenesi delle malattie umane. Tuttavia, alcuni di questi tipi cellulari sono limitati nella loro capacità di generare abbastanza cellule di un fenotipo specifico per inizializzare una grande impalcatura o eseguire high throughput studi in vitro. L'utilizzo di cellule staminali pluripotenti o multipotenti è stato l'argomento di discussione di ricerca molto, tuttavia, i limiti e le lacune per l'utilizzo di queste cellule sono stati ben descritti 9. L'uso di cellule staminali embrionali umane è molto dibattuto e presenta molti problemi etici. Soprattutto, queste cellule formano teratomi, che sono simili a un tumore, se non sono differenziati dal loro stato pluripotente prima trasporto loro in un ospite vivente 10. Inoltre, l'uso di cellule staminali embrionali non sarebbe paziente-specifico e potrebbe provocare una risposta allogenico e la necessità di soppressione immunitaria 10. Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono cellule pluripotenti che possonoessere derivato dalle cellule di un paziente. cellule somatiche, come le cellule della pelle, possono essere indotte a uno stato pluripotente utilizzando una varietà di tecniche integrative e non integrative. Queste cellule poi servire come un paziente-specifici fonti di cellule per l'ingegneria tissutale o indagine malattia. L'integrazione di materiale genetico indesiderato in queste cellule è una preoccupazione molti hanno descritto ed anche se le sequenze sono completamente rimossi iPSCs apparire per preservare una "memoria" epigenetica verso il tipo di cellula da cui sono stati ricavati 11. Queste cellule anche formeranno teratomi in vivo se non differenziati prima del trapianto 11. Molti protocolli di differenziazione sono stati indagati concentrandosi su linee dell'epitelio 12, 13, 14, tuttavia, è molto importante notare che i tipi cellulari risultanti alla fine di differenziazione non sono omogenei e oolo possiede una frazione del tipo cellulare di interesse. Questo si traduce in bassa resa e la necessità di purificare il tipo cellulare desiderato. Anche se iPSCs sono una potenziale fonte di cellule specifiche del paziente, il processo per ottenere un tipo di cellula di interesse sia per l'ingegneria dei tessuti o indagine malattia è molto inefficiente.
Cellule epiteliali umane sono state isolate con successo da una varietà sia di tessuti malati e non malati nel corpo umano, inclusi: polmone 15, seno 16, intestino tenue 17, colon 18, vescica 19 e dell'esofago 20. È importante notare che le cellule primarie umane hanno un numero finito di passi in cui il fenotipo viene mantenuta 21, 22. Sfortunatamente, questo significa che il numero di cellule necessarie per indagini di malattia o per la semina un'impalcatura ingegnerizzatoper l'impianto non può essere raggiunto. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per espandere le cellule dei pazienti, pur mantenendo un fenotipo epiteliale. Riprogrammazione condizionale di normali e tumorali cellule epiteliali che utilizzano cellule di alimentazione e inibitore ROCK è stato descritto nel 2012 da Liu et al. 2 3. Questa tecnica è stata utilizzata per espandere le cellule epiteliali cancerose ottenuti da biopsie di cancro alla prostata e al seno utilizzando cellule di alimentazione irradiati, inibitore ROCK e medie riprogrammazione condizionale. L'obiettivo era di generare abbastanza cellule per test in vitro, come lo screening di stupefacenti. Questa tecnica è in grado di espandere cellule epiteliali indefinitamente "riprogrammazione" queste cellule a uno stelo o stato progenitore simile, che è altamente proliferativo. È stato dimostrato che queste cellule sono non tumorigeniche e non possiedono la capacità di formare teratomi 23, 24. Inoltre, nessunanomalie cromosomiche o manipolazioni genetiche erano presenti dopo passaging queste cellule in coltura con questa tecnica 23, 24. Ancora più importante, queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del tipo nativo di interesse. Pertanto, questa tecnica offre un grande serbatoio di cellule epiteliali paziente-specifiche per le indagini malattie o ingegneria dei tessuti senza necessità di immortalizzazione.
Ottenere tessuto epiteliale da un organo specifico, al fine di studiare i processi di malattia è spesso limitata e non sempre è possibile a causa del rischio del paziente. Per quei pazienti affetti da malattia esofagea o difetti, endoscopica recupero biopsia è un approccio minimamente invasivo per ottenere il tessuto epiteliale che può essere dissociato e condizionatamente riprogrammato per fornire una fonte di cellule indefinita che è specifico per la mucosa dell'esofago che del paziente. Questo permette quindi per gli studi in vitrodelle cellule epiteliali per valutare processi di malattia e lo schermo per potenziali terapie. Un processo di malattia che potrebbero notevolmente beneficiare di questo approccio è esofagite eosinofila, che è stato descritto come malattia allergica dell'esofago 8. Prove allergiche e approcci terapeutici potrebbero essere valutati in vitro utilizzando cellule epiteliali del paziente e questi dati possono poi essere trasmessi al medico curante di sviluppare piani di trattamento individualizzato. La tecnica di riprogrammazione condizionale unitamente ottenere biopsie endoscopiche da pazienti pediatrici offre la possibilità di espandere normali cellule epiteliali dell'esofago indefinitamente da qualsiasi paziente. Questa fonte di cellule potrebbe quindi essere abbinato insieme con l'armatura naturale o sintetica per fornire un paziente-specifica opzione chirurgica dei difetti, malattie o traumi. Avere un numero di cellulare indefinito aiuterebbe ingegnere costrutti esofagee che possiedono una struttura completamente reseededlumen con le cellule epiteliali dell'esofago al fine di contribuire a facilitare la rigenerazione dei tipi di cellule rimanenti.
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Protocol
biopsie esofagee sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato ottenuto dai genitori / tutori dei pazienti pediatrici e in conformità con la scheda di revisione istituzionale (IRB # 13-094).
1. sterilizzazione di strumenti e la gelatina Soluzione
- forcipe autoclave, lame di rasoio e forbici prima di maneggiare il tessuto per evitare la contaminazione.
- Per 200 ml di soluzione di gelatina 0,1%, unire 200 mL di acqua distillata con 0,2 g di gelatina. Autoclavare e fresco prima dell'uso.
2. Rivestimento Piastre Tissue Culture
- Circa 2 h prima di isolare cellule, aggiungere abbastanza 0,1% di gelatina per coprire un piatto di coltura di tessuti (100 mm) e incubare a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
NOTA: Queste piastre possono anche essere effettuate in anticipo e tenute in incubatrice prima dell'uso.
3. Fare Soluzione Enzimatica per la dissociazione
- Circa 30 minuti prima di isolare cellule, pesare10 unità di dispasi su un bilancio basato sulle unità per milligrammo concentrazione dei flaconi. Posizionare la polvere in un tubo da 15 ml con 10 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e posto in un bagno d'acqua a 37 ° C.
4. cellulare fare cultura medio
- Per fare 50 ml di mezzo riprogrammazione condizionale, mescolare i seguenti ingredienti in una provetta sterile conica: 35 ml di F12 (Ham media), 11,5 ml di DMEM, 0,5 ml di L-glutammina, 0,5 ml di 100x di penicillina / streptomicina, 2,5 ml di siero fetale bovino (FBS), 250 mg di insulina umana, 500 ng del fattore di crescita epidermico umano (EGF).
- Per fare 500 ml di 3T3 media, mescolare 50 ml di FBS, 5 ml di 100x penicillina / streptomicina e 5 ml di L-glutammina con 500 ml di DMEM.
- Per fare 500 ml di cheratinociti mezzo privo di siero, scongelare integratori estratto pituitario bovina (BPE) (forniti con i media) EGF e. Aggiungere i supplementi per la bottiglia di terreno di base da 500 ml e aggiungere 5 ml di 100x penicillina / streptomicina
5. Le cellule la coltura e irradiante 3T3 come fonte alimentatore
- Preparare medio 3T3, comprendente DMEM, 10% FBS, 1x penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina.
- Cultura 3T3 nel tessuto trattato con T-75 fiaschi almeno 3 giorni prima dell'arrivo dei campioni dei pazienti.
- Poco prima dell'arrivo dei campioni dei pazienti, trypsinize 3T3 con 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA per bombola e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule sono galleggianti
- Aggiungere 5 ml di 3T3 mezzo per fermare la reazione. Aspirare la sospensione cellulare e trasferire ad un tubo da 15 ml. Spin per 5 min a 300 x g.
- Aspirare il medio e risospendere le cellule in un determinato volume di Trypan blu per il conteggio delle cellule. Unire 10 ml di cellule con 10 ml di Trypan blu di escludere le cellule morte. Carico 10 ml di questa soluzione in un emocitometro per il conteggio delle cellule.
NOTA: Per questo protocol, densità di semina per irradiati 3T3 è 10.900 cellule per cm 2, che è pari a 600.000 cellule per piastra a 100 mm. - Aliquota del numero di cellule necessarie al piatto un piatto 100 millimetri per campione del paziente e risospendere in 25 ml di 3T3 media in una provetta da 50 ml e irradiare con 3000 rad.
- A seguito di irraggiamento, le cellule spin down per 5 min a 300 xg e risospendere in media riprogrammazione condizionale a 5 ml per piastra a 100 mm.
- Impostare il tubo da parte fino al rivestimento delle cellule del paziente avviene successivamente nel protocollo (vedi punto 7.6).
6. Ottenere, conservare e trasportare pediatrici esofagee biopsie
- Aggiungere 5 ml di completo mezzo privo di siero dei cheratinociti con 100 mg / ml primocin a 15 ml provette coniche e portarlo al centro medico sul ghiaccio.
NOTA: Questi tubi di media possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 2 mesi. - Ottenere circa 8 biopsie esofagee in TIme di endoscopia e separato come segue:
- Mettere sei biopsie nel conica da 15 ml contenente completa di siero cheratinociti medie libero con 100 mg / ml primocin e posto sul ghiaccio bagnato.
- Mettere una biopsia in 5 ml di formalina tamponata e posto sul ghiaccio bagnato.
- Mettere una biopsia in una piccola biopsia cryomold con mescola ottimale temperatura di taglio.
- goccia Immediatamente questo stampo in un becher di isopentano collocato in azoto liquido. Una volta congelato, collocare il cryomold in un sacchetto campione e memorizzare sul ghiaccio secco in un contenitore di polistirolo espanso.
- Mettere le provette contenenti biopsie a medio o formalina all'interno di un sacchetto sigillato e poi in una scatola di spedizione contiene ghiaccio umido. Sigillare ed etichettare la scatola con un'etichetta di rischio biologico e trasportarla al laboratorio.
NOTA: Il contenitore che contiene il ghiaccio secco e la biopsia congelata è anche sigillato ed etichettato con un'etichetta rischio biologico.
7. ProcessingTessuto del paziente per la Cultura a valle e analisi
- All'arrivo presso il laboratorio, trasferire la biopsia congelato in ghiaccio secco a -80 ° C freezer per il sezionamento a valle o estrazione di RNA. Mettere il campione in formalina. Conservare in frigorifero C 4 ° e permettono di risolvere durante la notte.
- Spin i restanti biopsie giù a 300 xg, e aspirare il terreno. Aggiungere 10 ml di dispasi soluzione al tubo conico, guarnizione e lasciarla incubare a 37 ° C a bagnomaria per 15 minuti.
- Dopo l'incubazione, girare le biopsie giù a 300 x g. Aspirare biopsie medio e risospendere in 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA.
- Trasferire il 5 ml di tripsina-EDTA contenente le biopsie ad una piastra sterile 100 mm e sminuzzare biopsie con 2 lamette sterilizzati più sottile possibile.
- Trasferire il 5 ml di tripsina-EDTA contenente biopsie macinate in un 15 mL conica. Sciacquare la piastra due volte con un ulteriore 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA e aggiungere alla conicatubo. Incubare la provetta per 10 minuti in un bagno d'acqua 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, girare le biopsie giù a 300 xg (1,4 rpm) per 5 min e aspirare il terreno. Aggiungere 5 ml di terreno riprogrammazione condizionale per il tubo conico, nonché il 5 ml di terreno di riprogrammazione condizionale che contiene le cellule di alimentazione irradiate (vedi punto 5.7).
- Aggiungere inibitore ROCK (1 ml / mL) al 10 ml di sospensione cellulare e piatto dopo aspirando la gelatina dal piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C.
8. Coltura e cellule espansione
- Dopo circa 5 giorni di coltura, aspirare il terreno iniziale contenente i pezzi tritato-biopsia e sciacquare il piatto 2-3 volte con 5 ml di PBS sterile. Aggiungere nuovo mezzo alla piastra compreso inibitore ROCK a 10 micron.
- Giunti 70% di confluenza, espandere le cellule. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA alla piastra e incubare in un incubatore a 37 ° non più di 2,5 minuti per rimuovere °cellule di alimentazione e. Dopo che l'incubazione, aspirare il tripsina-EDTA e sciacquare la piastra con 5 ml di PBS.
- Aspirare il PBS e aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla piastra e incubare per 5-10 minuti o fino a quando le cellule sono sciolti dalla piastra. Aggiungere quantità uguali di mezzo alla piastra per bloccare la reazione e trasferire tutto il fluido in un tubo da 50 ml conica e centrifugare a 300 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in un volume definito di media riprogrammazione condizionale e mescolare 10 ml di sospensione con 10 ml di trypan blu. Contare su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule.
- Per espandere cellule, aggiungere 1 milione di cellule umane esofagee ad una piastra 150 millimetri insieme con 1,2 milioni irradiato 3T3 in un volume totale di 15 ml. Aggiungere inibitore ROCK fresco a 10 micron e aggiungere la sospensione cellulare in un piatto di gelatina rivestita 150 mm.
9. Le cellule congelare e conservare umano esofageo epiteliali
- Per rendere media di congelamento, aggiungere il 10%DMSO medio riprogrammazione condizionale. Dopo trypsinizing e conteggio, un'aliquota le cellule di congelare in un nuovo tubo 50 ml conica e centrifugare a 300 xg per 5 min.
- Aspirare il medio e aggiungete il congelamento di media ad un volume di 2 ml per esageratamente. Una volta che la sospensione cellulare è omogenea, un'aliquota da 10 6 cellule in cyrovials pre-etichettato. Mettere in un contenitore di congelamento a -80 ° C per almeno 24 h prima di spostare le fiale di conservazione in azoto liquido a lungo termine.
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Representative Results
Una sintesi dei passaggi chiave nel isolare cellule epiteliali esofagee da biopsie di pazienti è riassunto nella figura 1. Le colonie di cellule epiteliali formeranno in circa 4-5 giorni e sarà circondato da cellule di alimentazione dei fibroblasti (Figura 2A). Poiché queste colonie si espandono che si fonderanno con altre colonie di formare colonie più grandi (Figura 2b). Una volta che le culture sono diventate confluenti 70%, devono essere espanso (Figura 2C). Per garantire che i fibroblasti vengono rimosse dalla piastra prima di rimuovere le cellule epiteliali, 0,05% tripsina-EDTA è utilizzato per un massimo di 2,5 min per rimuovere gli alimentatori. L'assenza di alimentatori dovrebbe essere simile alla figura 2D. Le cellule epiteliali aderenti sono poi tripsinizzate con 0,25% tripsina-EDTA e ripiastrate su nuove cellule di alimentazione irradiati (Figura 2E).
(Figura 3A ). Queste cellule sono state anche analizzate al passaggio 1 per marcatori epiteliali tramite citometria di flusso e più del 90% delle cellule presenti da tre pazienti erano positivi per EpCAM (Figura 3B). Le cellule sono state anche analizzate mediante immunofluorescenza a passaggi 1 e 3 per assicurare il fenotipo su quelle 3 passaggi non cambiava. La colorazione dimostra la persistenza di epiteliale marcatore E-caderina (Figura 4A-D), indicatore progenitore P63 (Figura 4E-H), marker di proliferazione KI-67 (Figura 4I-L) e epiteliali TJP1 proteine di giunzione a tenuta (Figura 4M-P ).
Infine, una curva di crescita è stata tracciata con una linea cellulare da un paziente non malato per valutare il tempo di raddoppio di queste cellule in coltura riprogrammazione condizionale. Le cellule sono state seminate a 100.000 cellule al giorno 0 e sono stati trovati ad essere solo un po 'più di 500.000 cellule al giorno 4 (Figura 5). Il tempo di raddoppio è stato calcolato essere di circa 36-40 ore. Si prevede che le cellule malate avranno un tempo di raddoppio più lento, tuttavia, ogni paziente dovrebbe essere valutato separatamente per tenere conto di differenze individuali.
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Figura 1: Panoramica di isolamento e la coltura cellule umane esofageo epiteliali da pediatrici biopsie. Le biopsie sono ottenuti da pazienti pediatrici dopo consenso informato e trasportati in cheratinociti mezzo privo di siero al laboratorio. Tali biopsie sono poi trattate con 1 U / mL di dispasi, seguita da macinazione del tessuto con lamette sterili e infine trattamento con 0,05% tripsina-EDTA. La sospensione cellulare viene quindi aggiunto cellule feeder irradiate in media riprogrammazione condizionale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La coltura ed espansione di cellule umane esofagea epiteliali. Dopo 5 giorni di riprogrammazione condizionalemedio ming, le cellule epiteliali dell'esofago iniziano a formare colonie piccoli ciottoli (A), che alla fine convergono a formare colonie più grandi (B). Una volta che il piatto di coltura tissutale raggiunge il 70% di confluenza (C), le piastre sono trattati per un tempo molto breve con 0,05% tripsina-EDTA per rimuovere le cellule di alimentazione, pur mantenendo l'aderenza delle cellule epiteliali (D). Le cellule epiteliali vengono poi rimosse con 0,25% tripsina-EDTA e ripiastrate nuove cellule feeder. A soli 24 h dopo la divisione queste cellule formeranno nuove colonie e continuano a proliferare (E). L'ingrandimento è 100X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Citometria a flusso e qRT-PAnalisi CR delle cellule espanse in coltura. (A) gene espressione rappresentativa di cellule in coltura al passaggio 1 di riprogrammazione condizionale dimostrato un aumento di 6 volte nell'espressione P63, un marcatore di cellule progenitrici nonché una diminuzione marcatori epiteliali CDH1 e TJP1 rispetto all'espressione genica biopsia. Ciò indica la popolazione cellulare è in un progenitore stato simile più e quindi è più altamente proliferativo. Espressione genica 24 ore post-riprogrammazione (dopo la rimozione di cellule di alimentazione e rock Inhibitor) dimostra aumentato CDH1 e TJP1 espressione, ma una diminuzione dell'espressione P63. (B) analisi citofluorimetrica delle cellule da più pazienti ottenuti al passaggio 1 dimostrano maggiore del 90% delle cellule esprimenti EpCAM. Paziente 27 rappresenta cellule di pazienti non-EOE, mentre i pazienti 26 e 28 sono le cellule del paziente EOE. Si prega di cliccare qui to vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immunofluorescenza di cellule nei passaggi 1 e 3. Cellule cresciute in terreno riprogrammazione condizionato con cellule feeder irradiate espresso E-caderina (A - D) così come marcatore progenitore P63 (E - H). Queste cellule sono ancora proliferative al passaggio 3 (I - L). Infine, queste cellule esprimono giunzione a tenuta di proteine 1 (TJP1), che è anche coerente con un fenotipo epiteliale (M - P). I nuclei sono di contrasto con DAPI (blu) e gli anticorpi vengono rilevati utilizzando un Alexa Fluor 546 anticorpi (arancione). 2 ° anticorpo (Ab) di controllo rappresenta legame non specifico dell'anticorpo secondario al tessuto (Q, R). Barre di scala = 50micron. L'ingrandimento è 200X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Crescita Curva di cellule in Riprogrammazione condizionale. Cellule in terreno riprogrammazione condizionato da un paziente non malati sono state seminate ad una densità definita e replicati di tre sono stati contati ogni giorno per 4 giorni. La curva di crescita è stata generata utilizzando questi il conteggio delle cellule e il raddoppio di tempo è stato calcolato sulla base dei numeri ottenuti al giorno 4 e il giorno 0. Il tempo di raddoppio di queste cellule è di circa 36-40 ore. Le barre di errore indicano l'errore standard. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passi più importanti al fine di isolare ed espandere cellule epiteliali dell'esofago da biopsie di pazienti sono: 1) adeguatamente dissociare biopsia del tessuto con la morte delle cellule minimo; 2) garantire inibitore ROCK viene aggiunto al mezzo di coltura cellulare ad ogni cambio medio; 3) Non utilizzare più cellule di alimentazione di quanto raccomandato; 4) mantenere una cultura asettica pulito; e 5) le cellule di passaggio appena prima di raggiungere confluenza.
A causa delle differenze correlati al paziente in campioni bioptici ottenuti per la riprogrammazione condizionale, è ragionevole aspettarsi differenze di cinetica di crescita, fenotipo e la capacità di espandersi in più passaggi. Tipicamente, 4 biopsie esofagee sono ottenuti da ciascun paziente per l'isolamento delle cellule. Una volta dissociato, abbiamo netti circa 300,000-600,000 cellule a giorno 0. Questo si espande per oltre 10 milioni di cellule dal passaggio 3 in media. Morfologia delle colonie che formano dovrebbe essere simile alla morfologia ciottoli descritto per le linee di cellule epiteliali <sup class = "xref"> 25 (Figura 2). Un campione di cellule in coltura deve essere analizzato tramite qRT-PCR, citometria a flusso e immunofluorescenza per i marcatori epiteliali di garantire le popolazioni espansione sono effettivamente di origine epiteliale (Figura 3). Se le cellule non esprimono i marcatori epiteliali (E-caderina, EpCAM, TJP1), la linea cellulare deve essere chiuso e scartato. Si prevede che più del 90% delle cellule presenti sono EpCAM positivo se sono di origine epiteliale. Al fine di valutare se le culture stanno cambiando fenotipo o perdere epiteliale espressione, immunofluorescenza o citometria a flusso deve essere utilizzato per valutare i marcatori epiteliali (E-caderina), espressione progenitore (P63), e proteine di derivazione stretti epiteliali (TJP1). Poiché le cellule sono diversi passaggi si prevede che fenotipo non dovrebbe cambiare, proliferazione non dovrebbe diminuire e queste cellule dovrebbe visualizzare espressione epiteliale nonché espressione progenitore (Figura 4 (Figura 5). Le cellule che si trovano non a raddoppiare per più di 5 giorni sono suscettibili di essere senescente e devono essere eliminati.
È stato descritto che le cellule isolate da pazienti con processi infiammatori presenti, come EoE, possiedono cellule epiteliali che hanno un tasso di proliferazione ridotta, diminuzione dell'espressione E-caderina (Figura 3, pazienti 26 e 28) e un alto tasso di apoptosi 26. Pertanto, non è irragionevole avere cellule difficoltà coltura da un paziente gravemente malato con questo metodo. E 'possibile che le cellule in grado di resistere solo pochi passaggi o anche solo passaggio iniziale. Ciò dovrebbe ancora fornire l'investigatore con un maggior numero di cellule che originariamente isolato. Tuttavia, questo numero può non essere sufficienteper tutti gli studi proposti. Poiché queste cellule vengono usate per studiare definitiva malattia esofagea o costruire un rimontaggio esofagea, è importante ricordare queste cellule sono responsabili solo per la rigenerazione della mucosa. Altri tipi cellulari quali fibroblasti, neuroni, cellule muscolari lisce e vasi sanguigni sono anche altrettanto importante per lo studio della malattia esofagea e per applicazioni di ingegneria tissutale.
Questa tecnica offre una fonte di cellule specifiche del paziente, che è uno strumento prezioso per lo studio patogenesi della malattia oltre a servire come un potenziale serbatoio di cellule specifiche del paziente per applicazioni di ingegneria dei tessuti dell'esofago. Le cellule utilizzate per la semina biomateriali per impianto chirurgico devono essere privi di anomalie genetiche, sequenze virali e non formare teratomi. L'uso di cellule staminali multipotenti (o pluripotenti) genera anche molti tipi di cellule indesiderate seguenti differenziazione, alcuni dei quali possono formare teratomi se non hanno subito differenziazione. Inoltre, questa fonte di cellule fenotipo è coerente e non richiede depurazione o la rimozione di cellule indesiderate. La fonte cellulare ideale sarà cellule che si trovano nella stessa posizione anatomica che viene progettato. In questo approccio le cellule epiteliali esofagee vengono utilizzati per ripopolare la mucosa di un ponteggio esofagea. tipi di cellule supplementari sono necessarie per la rigenerazione esofageo; Tuttavia, l'attenzione di questa tecnica è stato quello di garantire la mucosa è stata reseeded e non incompleta come questo può portare a perdite, stenosi e perforazione.
Oltre ad utilizzare queste cellule per l'ingegneria nuove opzioni chirurgiche per l'esofago, queste cellule possono anche essere utilizzati per studiare i processi di malattia esofagea così come schermo per nuovi approcci terapeutici per il trattamento di queste condizioni. esofagite eosinofila (EoE) è descritta come una malattia allergica dell'esofago, con il meccanismo esatto e patogenesi non ancora completamente descritto. Corrente reg trattamentoiments includono diete di eliminazione, steroidi per via orale e molteplici endoscopie. Nessun test è utilizzato per valutare ciò che innesca il processo infiammatorio per ogni paziente, che porta ai medici di utilizzare un "ipotesi e verifica" approccio che è lunga e spesso frustrante per il paziente. Poiché questo metodo di espansione delle cellule specifiche del paziente non utilizza trasduzione lentivirale o modificazione genetica, la possibilità di modifiche permanenti al genotipo delle cellule dal processo di riprogrammazione è minima. Ciò significa che le cellule teoricamente rimangono invariati dall'ambiente in vivo. La possibilità di testare le cellule del paziente in vitro per identificare l'agente scatenante sarebbe romanzo e potrebbe in ultima analisi, portare allo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici o terapie per questi pazienti pediatrici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
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