Summary
Erweiterung der menschlichen pädiatrischen Ösophagus-Epithelzellen Verwendung bedingten Neuprogrammierung bietet Ermittler mit einem Patienten-spezifische Population von Zellen, die für das Engineering-Ösophagus-Konstrukte für die autologe Implantation verwendet werden können Defekte oder Verletzungen und dienen als Reservoir für die therapeutische Screening-Assays zu behandeln.
Introduction
Speiseröhren Tissue Engineering und eosinophile Ösophagitis (EoE) in den Mittelpunkt der Forschung in vielen Labors in den letzten zehn Jahren. Angeborene Defekte wie Ösophagusatresie, werden in etwa 1 : 4.000 Lebendgeburten gesehen, die in der unvollständigen Entwicklung der Speiseröhre führt zu der Unfähigkeit führt 1 zu essen. Die Inzidenz und Prävalenz von EoE sind auf dem Vormarsch , seit die Identifizierung des Krankheitsbild 1993 Die Inzidenz von EoE von 0,7 / 100.000 pro Person in einem Jahr bis 10 variiert und die Prävalenz von 0,2 bis 43 / 100.000 2 reichte. Eine neue attraktive chirurgischen Ansatz lange Lücke Ösophagusatresie Behandlung besteht Gewebekonstrukte für die Implantation bei der Erzeugung von patienteneigenen Zellen verwendet. Diese Zellen in Verbindung mit synthetischen Gerüst wird eine autologe Konstrukt zu erzeugen, die nicht Immunsuppression erfordert. Einige Gruppen haben bereits damit begonnen, die uns zu untersuchen7 - e der stielartigen Zellen für Speiseröhren Tissue Engineering 3 sowie die Verwendung von nativen Zellen der Speiseröhre epithelialen der Schleimhaut 4 neu zu besiedeln. Krankheiten, die in der Speiseröhre von pädiatrischen Patienten vorhanden sind, sind oft schwer ohne Eingriff zu diagnostizieren oder zu studieren. Darüber hinaus verewigt Verwendung von Tiermodellen oder in vitro - Modellen Zelllinie für Kinderkrankheiten wie EoE nicht die genaue Pathogenese der Erkrankung oder patientenspezifische Unterschiede umfassen 8. Daher ist die Fähigkeit eines Patienten Krankheitsprozess in vitro untersuchen , um bestimmte Krankheit auslösenden Antigene zu identifizieren, zu Grunde liegenden Mechanismen zu bewerten und medikamentöse Behandlungen zu untersuchen wäre neu und bieten Kliniker mit Informationen , die in der Patientenbehandlung helfen können.
Es wurden viele autolog oder patientenspezifische Zelltypen war die für die Verwendung in tissu vorgeschlagen wurden,e-Engineering und die menschliche Krankheit Pathogenese zu studieren. Einige dieser Zelltypen werden jedoch in ihrer Fähigkeit beschränkt genügend Zellen eines bestimmten Phänotyp zu erzeugen , ein großes Gerüst oder führen einen hohen Durchsatz in vitro Studien auf Saatgut. Die Verwendung von pluripotente oder multipotente Stammzellen hat das Thema vieler Forschungs Diskussion jedoch Einschränkungen und Nachteile für diese Zellen verwendet wurden und 9 beschrieben. Die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen ist stark diskutiert und präsentiert viele ethische Fragen auf. Am wichtigsten ist , bilden diese Zellen Teratome, die auf einen Tumor ähnlich sind, wenn sie von ihren pluripotenten Zustand nicht differenziert werden, bevor sie in einen lebenden Wirt 10 liefert. Ferner kann die Verwendung von embryonalen Stammzellen nicht patientenspezifisch und könnte eine allogene Reaktion und die Notwendigkeit einer Immunsuppression 10 hervorzurufen. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind pluripotente Zellen, die könnenaus patienteneigenen Zellen abgeleitet werden. Somatische Zellen, wie Hautzellen kann zu einem pluripotenten Zustand mit einer Vielzahl von integrative und nicht-integrative Techniken induziert werden. Diese Zellen dienen dann als patientenspezifische Zellquellen für das Tissue Engineering oder Krankheit Untersuchung. Die Integration von unerwünschten genetischen Materials in diesen Zellen ist ein Anliegen , viele beschrieben haben , und selbst wenn Sequenzen vollständig entfernt iPSCs erscheinen eine epigenetische "Gedächtnis" in Richtung der Zelltyp zu erhalten , von denen sie 11 abgeleitet wurden. Diese Zellen werden auch Teratome in vivo bilden , wenn nicht mehr als 11 vor der Transplantation differenziert. Viele Differenzierungs Protokolle wurden auf epithelialen Abstammungslinien 12 untersucht Fokussierungs, 13, 14, jedoch ist es sehr wichtig zu beachten , dass die Zelltypen am Ende der Differenzierung resultierenden sind nicht homogen und only besitzen einen Bruchteil der Zelltyp von Interesse. Dies führt zu einer geringen Ausbeute und die Notwendigkeit, den gewünschten Zelltyp zu reinigen. Obwohl iPSCs Quelle eine potentielle patientenspezifische Zell sind, um das Verfahren ein Zelltyp von Interesse entweder für das Tissue Engineering oder Krankheit Untersuchung erhalten sehr ineffizient ist.
Lunge 15, der Brust 16, Dünndarm 17, Kolon 18, der Blase 19 und die Speiseröhre 20: menschliche Epithelzellen wurden aus einer Vielzahl von sowohl erkrankten und nicht erkrankten Geweben im menschlichen Körper einschließlich erfolgreich isoliert. Es ist wichtig zu beachten , dass die menschliche Primärzellen eine endliche Anzahl von Durchgängen aufweisen , in dem der Phänotyp 21, 22 gehalten wird. Unglücklicherweise bedeutet dies, dass die Anzahl der Zellen für die Krankheits Untersuchung benötigt wird oder für ein angelegtes Gerüst Animpfenzur Implantation nicht erreicht werden kann. Daher werden neue Techniken benötigt Patientenzellen zu erweitern, während immer noch eine epitheliale Phänotyp beibehalten wird. Bedingte Umprogrammierung von normalen und Krebszellen epithelialen Feeder - Zellen und ROCK - Inhibitor verwendet wurde im Jahr 2012 von Liu et al. 2 3. unter Verwendung von bestrahlten Feeder-Zellen, ROCK-Inhibitor und bedingte Umprogrammierung Medium Diese Technik wurde verwendet Krebs Epithelzellen aus Biopsien von Prostata- und Brustkrebs erhalten zu erweitern. Ziel war es , genügend Zellen für in vitro - Assays , wie beispielsweise Arzneimittel - Screening erzeugen. Diese Technik ist in der Lage von Epithelzellen auf unbestimmte Zeit durch "Reprogrammierung" dieser Zellen zu einem Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zustand erweitert, die hochproliferative ist. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen nicht-tumorigen und besitzen nicht die Fähigkeit , Teratome 23, 24 zu bilden. Weiterhin keineChromosomenanomalien oder genetische Manipulationen waren anwesend , nachdem diese Zellen in Kultur Passagierung mit dieser Technik 23, 24. Am wichtigsten ist, sind diese Zellen nur in der Lage, in der nativen Zelltyp von Interesse zu unterscheiden. Daher bietet diese Technik ein großes Reservoir an patientenspezifische Epithelzellen für Krankheit Untersuchung oder das Tissue Engineering, ohne die Notwendigkeit für Verewigung.
Gewinnung von Epithelgewebe von einem bestimmten Organ, um Krankheitsprozesse zu studieren, ist oft begrenzt und nicht immer möglich, da das Patientenrisiko. Für jene Patienten, die an Erkrankungen der Speiseröhre oder Defekte, endoskopische Biopsie Retrieval ist eine minimal-invasive Ansatz zur Gewinnung von Epithelgewebe leiden, die dissoziiert werden können und bedingt eine unbegrenzte Zellquelle bereitzustellen umprogrammiert, die auf die Schleimhaut dieses Patienten-Ösophagus spezifisch ist. Dies ermöglicht dann für in - vitro - Studiender Epithelzellen Krankheitsprozesse und Bildschirm für potenzielle Therapeutika zu bewerten. Ein Krankheitsprozess, die sich stark von diesem Ansatz profitieren könnten , ist eosinophile Ösophagitis, die als allergische Erkrankung der Speiseröhre 8 beschrieben wurde. Allergietests sowie therapeutische Ansätze könnten in vitro ausgewertet werden , um die eigene Epithelzellen des Patienten verwenden und diese Daten können dann auf den behandelnden Arzt übergeben werden individuelle Behandlungspläne zu entwickeln. Die Technik der bedingten Umprogrammierung in Verbindung mit endoskopischen Biopsien von pädiatrischen Patienten erhalten, bietet die Fähigkeit, normale Speiseröhre epithelialen Zellen von jedem Patienten auf unbestimmte Zeit zu erweitern. Diese Zellquelle daher zusammen mit natürlichen oder synthetischen Gerüst gepaart werden, um eine patientenspezifische chirurgische Option für Defekte, eine Krankheit oder ein Trauma zu liefern. eine unbestimmte Anzahl von Zellen zu haben würde helfen, Speiseröhren Konstrukte entwickeln, die eine vollständig reseeded besitzenzu helfen, erleichtern die Regeneration der verbleibenden Zelltypen mit Ösophagus-Epithelzellen, um das Lumen.
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Protocol
Ösophagus-Biopsien wurden nach Einverständniserklärung der Eltern / Erziehungsberechtigte der pädiatrischen Patienten und gemäß Institutional Review Board (IRB # 13-094) erhalten.
1. Sterilisation von Instrumenten und Gelatinelösung
- Autoklav Zange, Rasierklingen und Scheren vor Gewebe Handhabung Kontamination zu verhindern.
- Zu 200 ml 0,1% ige Gelatinelösung zu machen, zu kombinieren 200 ml destilliertem Wasser mit 0,2 g Gelatine. Autoklav und kühl vor dem Gebrauch.
2. Beschichtungsgewebekulturplatten
- Etwa 2 h vor der Zellisolierung, fügen Sie genug 0,1% Gelatine mit einer Gewebekulturschale zu decken (100 mm) und Inkubation bei 37 ° C in einer Zellkultur-Inkubator.
ANMERKUNG: Diese Platten können auch vor der Zeit und gehalten in den Inkubator vor der Verwendung hergestellt werden.
3. Herstellung Enzymlösung für die Dissoziation
- Etwa 30 Minuten vor der Zellisolierung abzuwiegen10 Einheiten Dispase auf einer Waage auf der Basis der Einheiten pro Milligramm Konzentration auf dem Fläschchen. Legen Sie das Pulver in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und in einem 37 ° C Wasserbad.
4. Herstellung Zellkulturmedium
- Um 50 ml bedingten Umprogrammierung Medium, mischen Sie die folgenden Bestandteile in einen sterilen konischen Röhrchen: 35 ml F12 (Ham-Medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-Glutamin, 0,5 ml 100x Penicillin / Streptomycin, 2,5 ml fötales Rinderserum (FBS), 250 ug Humaninsulin, 500 ng des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF).
- Zu machen, 500 ml 3T3-Medium, Mischungs 50 ml FBS, 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin und 5 ml L-Glutamin mit 500 ml DMEM.
- Um 500 ml Keratinozyten-Serum-freiem Medium, tauen EGF und Rinder (BPE) Ergänzungen (mit den Medien zur Verfügung gestellt). Fügen Sie die Ergänzungen der 500-ml-Flasche Basismedium und mit 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin
5. Die Anzucht und Bestrahlen 3T3-Zellen als Feeder Quelle
- Bereiten 3T3 Medium mit DMEM, 10% FBS, 1x Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
- Kultur 3T3 - Zellen in Gewebe behandelten T-75 - Flaschen mindestens 3 Tage vor der Ankunft von Patientenproben.
- Unmittelbar vor der Ankunft von Patientenproben, trypsinize 3T3-Zellen 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben verwendet und für 5 min oder bis die meisten Zellen bei 37 ° C inkubieren schweben
- 5 ml 3T3-Medium, um die Reaktion zu stoppen. Absaugen die Zellsuspension und Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Spin für 5 min bei 300 x g.
- Absaugen Mediums und Resuspendieren der Zellen in einem definierten Volumen von Trypan Blau zur Zellzählung. Kombinieren Sie 10 ul der Zellen mit 10 & mgr; l Trypanblau tote Zellen auszuschließen. Last 10 ul dieser Lösung auf ein Hämozytometer zur Zellzählung.
HINWEIS: Für dieses Protocol, Einsaatdichte für bestrahlte 3T3 - Zellen ist 10.900 Zellen pro cm 2, die zu 600.000 Zellen pro 100 mm Platte gleich ist. - Aliquot der Anzahl der Zellen notwendig, um eine 100-mm-Platte pro Patientenprobe und resuspendieren in 25 ml 3T3 Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen an der Platte und mit 3000 rads bestrahlen.
- Nach der Bestrahlung Spin Zellen nach unten für 5 Minuten bei 300 g und Resuspendieren in bedingten Umprogrammierung Medium mit 5 ml pro 100 mm Platte.
- Stellen Sie den Schlauch zur Seite, bis die Beschichtung von Patientenzellen erfolgt später im Protokoll (siehe Schritt 7.6).
6. Beschaffung, Konservierung und Transport von Pediatric Ösophagus Biopsien
- 5 ml komplettes Keratinozyten-Serum-freiem Medium mit 100 ug / ml primocin bis 15 ml konische Röhrchen und bringen sie in die medizinische Einrichtung auf dem Eis.
ANMERKUNG: Diese Rohre des Mediums kann für bis zu 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden. - Erhalten Sie ca. 8 Ösophagus Biopsien am timich der Endoskopie und getrennt wie folgt:
- Legen Sie sechs Biopsien in den 15 ml konischen mit vollständigen Keratinozyten-Serum freies Medium mit 100 ug / ml primocin und auf nassem Eis.
- Legen Sie eine Biopsie in 5 ml gepuffertem Formalin und auf nassem Eis.
- Legen Sie eine Biopsie in einer kleinen Biopsie cryomold mit optimalen Schnitttemperatur Verbindung.
- fallen sofort diese Form in einen Becher mit Isopentan in flüssigem Stickstoff gegeben. Einmal eingefroren, legen Sie die cryomold in einer Probe Beutel und lagern auf Trockeneis in einem Polystyrol-Schaumbehälter.
- Die Röhrchen Biopsien in Medium oder Formalin in einem verschließbaren Beutel und dann in einen Versandkarton enthält nassem Eis enthält. Siegel und beschriften Sie die Box mit einem Biohazard-Label und transportieren sie ins Labor.
HINWEIS: Der Behälter, der das Trockeneis und gefrorene Biopsie enthält, wird auch mit einem biohazard Aufkleber verschlossen und beschriftet.
7. VerarbeitungPatientengewebe für Downstream Kultur und Analyse
- Bei der Ankunft im Labor, übertragen Sie die gefrorene Biopsie auf Trockeneis auf -80 ° C Gefrierschrank für nachgeschaltete Schnitte oder RNA-Extraktion. Legen Sie die Probe in Formalin. Speichern Sie in einem 4 ° C Kühlschrank und lassen über Nacht zu beheben.
- Drehen Sie die restlichen Biopsien nach unten bei 300 g und absaugen Medium. 10 ml Dispase-Lösung zu dem konischen Rohr, Dichtung und ermöglichen es für 15 min bei 37 ° C in einem Wasserbad inkubiert.
- Nach der Inkubation spinnen die Biopsien bei 300 x g nach unten. Absaugen Medium und resuspendieren Biopsien in 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA.
- Übertragen Sie die 5 ml Trypsin-EDTA die Biopsien zu einer 100 mm sterile Platte enthält und Hackfleisch die Biopsien mit 2 sterilisierten Rasierklingen so fein wie möglich.
- Übertragen Sie die 5 ml Trypsin-EDTA gehackten Biopsien zu einem neuen 15 ml konischen. Spülen Sie die Platte zweimal mit einem zusätzlichen 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA und fügen Sie dem konischenTube. Inkubieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad.
- Nach der Inkubation spinnen die Biopsien bei 300 g nach unten (1,4 RPM) für 5 min und das Medium absaugen. 5 ml bedingten Umprogrammierung Mediums zu dem konischen Rohr sowie die 5 ml bedingten Umprogrammierung Medium, das die bestrahlte feeder-Zellen enthält (siehe Schritt 5.7).
- Rock-Inhibitor (1 ul / ml) zu dem 10 ml Zellsuspension und der Platte, nachdem die Gelatine aus der Gewebekulturschale abgesaugt. Inkubieren bei 37 ° C.
8. Die Anzucht und Ausbau der Zellen
- Nach ca. 5 Tagen Kultur absaugen Ausgangsmedium die gehackten-Biopsie Stücke und spült die Kapsel 2-3 mal mit 5 ml sterilem PBS enthält. Neuen Medium auf die Platte einschließlich ROCK-Inhibitor bei 10 uM.
- Bei 70% Konfluenz erreichen, erweitern die Zellen. 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA zur Platte und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator nicht mehr als 2,5 min zu entfernen the-Feeder-Zellen. Im Anschluss an diese Inkubation absaugen Trypsin-EDTA und spülen Sie die Platte mit 5 ml PBS.
- Saugen Sie das PBS und 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf die Platte und Inkubation für 5-10 Minuten oder bis die Zellen von der Platte lose sind. Hinzufügen gleiche Mengen von Medium zu der Platte um die Reaktion zu stoppen und zu übertragen, die gesamte Flüssigkeit in ein 50 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren bei 300 xg für 5 min.
- Die Zellen in einem definierten Volumen des bedingten Umprogrammierung Medium und 10 & mgr; l der Suspension mit 10 & mgr; l Trypanblau mischen. Zählen Sie auf einem Hämozytometer Gesamtzellzahl zu bestimmen.
- So erweitern Zellen, fügen Sie 1 Million menschliche Speiseröhre Zellen auf eine 150-mm-Platte zusammen mit 1,2 Millionen bestrahlten 3T3-Zellen in einem Gesamtvolumen von 15 ml. Fügen Sie frisches ROCK-Inhibitor bei 10 uM und fügen Sie die Zellsuspension auf eine mit Gelatine beschichtete 150-mm-Schale.
9. Einfrieren und Lagerung der menschliche Speiseröhre Epithelzellen
- Um Gefriermedium, mit 10%DMSO zu bedingten Umprogrammierung Medium. Nach Trypsinisierung und Zählen, Aliquotierung der Zellen in ein neues 50 ml konischen Röhrchen einzufrieren und bei 300 g für 5 min Spin-Down.
- Saugen Sie das Medium und fügen Sie in einem Volumen von 2 ml pro Cryovial Einfriermedium. Nachdem die Zellsuspension homogen, Aliquot 10 6 Zellen in vormarkiert cyrovials. In einem Gefrierbehälter bei -80 ° C für mindestens 24 h vor dem Bewegen der Phiolen zur langfristigen Lagerung in flüssigem Stickstoff.
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Representative Results
Eine Zusammenfassung der wichtigsten Schritte in der Speiseröhre Epithelzellen von Patienten Biopsien Isolierung ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Kolonien von Epithelzellen wird in etwa 4-5 Tagen bilden und wird von Fibroblasten - Feeder - Zellen (2A) umgeben sein. Da diese Kolonien erweitern werden sie mit anderen Kolonien verschmelzen zu größeren Kolonien (2B) bilden. Sobald die Kulturen 70% konfluent geworden sind, müssen sie erweitert werden (Abbildung 2C). Um sicherzustellen, dass Fibroblasten, die aus der Platte die Epithelzellen zu entfernen, bevor entfernt werden, 0,05% Trypsin-EDTA ist für bis zu 2,5 Minuten verwendet, um die Speiser entfernen. Das Fehlen der Anleger sollte ähnlich aussehen 2D - Abbildung. Die adhärenten Epithelzellen werden dann mit 0,25% Trypsin-EDTA und replattiert auf neue bestrahlte feeder - Zellen (Figur 2E) trypsiniert.
(3A demonstriert ). Diese Zellen wurden bei Passage 1 für epithelialen Marker über Durchflusszytometrie und größer als 90% der Zellen vorhanden von drei Patienten analysiert , waren positiv für EpCAM (3B). Zellen wurden auch durch Immunofluoreszenz bei Durchlässe 1 und 3 analysiert der Phänotyp über diese drei Passagen, um sicherzustellen, nicht veränderte. Die Färbung zeigt die Persistenz von epithelialen Marker E-Cadherin (4A-D), Vorläufermarker P63 (4E-H), Proliferationsmarker Ki-67 (Abbildung 4E-L) und epithelialen tight junction Protein TJP1 (Abbildung 4 M-P ).
Schließlich wurde eine Wachstumskurve unter Verwendung einer Zelllinie von einem nicht-erkrankten Patienten aufgetragen, um die Verdopplungszeit der Zellen in Kultur bedingten Umprogrammierung zu bewerten. Die Zellen wurden bei 100.000 Zellen am Tag 0 ausplattiert und bei nur etwas mehr als 500.000 Zellen zu Tag 4 (Figur 5) gefunden wurden. Die Verdopplungszeit wurde etwa 36-40 h berechnet werden. Es wird erwartet, dass erkrankten Zellen eine langsamere Verdopplungszeit haben, sollte jedoch jeder Patient getrennt beurteilt werden, um individuelle Unterschiede zu berücksichtigen.
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Abbildung 1: Übersicht über die Isolierung und Kultivierung humaner Epithelzellen der Speiseröhre aus Pediatric Biopsien. Biopsien werden von pädiatrischen Patienten nach Einverständniserklärung erhalten und in Keratinozyten-Serum-freiem Medium ins Labor transportiert. Diese Biopsien werden dann mit 1 U / ml Dispase, gefolgt von Zerkleinern des Gewebes mit sterilen Rasierklingen behandelt und schließlich mit 0,05% Trypsin-EDTA-Behandlung. Die Zellsuspension wird dann auf bestrahlten Feeder-Zellen in bedingten Umprogrammierung Medium zugegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Anzucht und Erweiterung des menschlichen Epithelzellen der Speiseröhre. Nach 5 Tagen in bedingten umprogrammierenming Medium, beginnen Epithelzellen der Speiseröhre kleinen Pflaster Kolonien (A) zu bilden, die schließlich zusammenlaufen zu größeren Kolonien bilden (B). Sobald die Gewebekulturschale erreicht 70% Konfluenz (C) werden die Platten für eine sehr kurze Zeit mit 0,05% Trypsin-EDTA behandelt , um die feeder - Zellen zu entfernen, während immer noch die Einhaltung der Epithelzellen (D) beibehalten wird . Die Epithelzellen werden dann mit 0,25% Trypsin-EDTA und replattiert mit neuen Feederzellen entfernt. Nur 24 Stunden nach der diese Zellen aufgeteilt werden sie neue Kolonien bilden und sich zu vermehren (E) weiter. Die Vergrößerung ist 100X. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Durchflusszytometrie und qRT-PCR Analyse von Zellen in Kultur expandiert. (A) Repräsentative Genexpression von Zellen in Kultur bei Passage 1 von bedingten Umprogrammierung zeigte eine 6 fache Erhöhung der Expression P63, einen Marker von Vorläuferzellen sowie eine Abnahme der epithelialen Marker CDH1 und TJP1 im Vergleich zur Biopsie Genexpression. Dies zeigt die Zellpopulation in einem Vorläuferähnlichen Zustand ist und daher mehr hochproliferative. Die Genexpression von 24 h nach der Umprogrammierung (nach der Entfernung von Feeder-Zellen und ROCK-Inhibitor) demonstriert erhöhte CDH1 und TJP1 Ausdruck, sondern eine Abnahme der P63-Expression. (B) Die Durchflusszytometrie - Analyse von Zellen von mehreren Patienten bei Passage 1 erhalten , zeigen mehr als 90% der EpCAM - exprimierenden Zellen. 27 Patienten repräsentiert nicht EoE Patientenzellen, während die Patienten 26 und 28 EoE sind Patientenzellen. Bitte klicken Sie hier to eine größere Version dieser Figur sehen.
Abbildung 4: Immunfluoreszenzanfärbung von Zellen , die bei Passages 1 und 3 in bedingten Umprogrammierung Medium gezüchteten Zellen mit bestrahlten Feeder - Zellen exprimieren E-Cadherin (A - D) sowie Vorläufer Marker P63 (E - H). Diese Zellen sind noch proliferative bei Passage 3 (I - L). Schließlich exprimieren diese Zellen tight junction Protein 1 (TJP1), die auch in Übereinstimmung mit einem epithelialen Phänotyp (M - P). Kerne gegengefärbt mit DAPI (blau) und Antikörpern nachgewiesen werden unter Verwendung eines Alexa Fluor 546-Antikörper (orange). 2. Antikörper (Ab) -Steuerung stellt eine unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers an das Gewebe (Q, R). Maßstabsbalken = 50um. Die Vergrößerung ist 200X. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Wachstumskurve von Zellen in Conditional Reprogrammierung. Zellen in bedingtem Umprogrammierung Medium aus einem nicht-erkrankten Patienten wurden in einer definierten Dichte ausgesät und repliziert von drei pro Tag für 4 Tage wurden gezählt. Die Wachstumskurve wurde diese Zellzahlen erzeugt und unter Verwendung Verdopplungszeit wurde berechnet auf der Grundlage der Zahlen am Tag 4 und Tag 0. Die Verdopplungszeit der Zellen etwa 36-40 h erhalten wird. Fehlerbalken zeigen Standardfehler. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte, um Epithelzellen der Speiseröhre von Patienten-Biopsien zu isolieren und zu erweitern sind: 1) ausreichend Biopsiegewebe mit minimaler Zelltod dissoziierenden; 2) sorgen für ROCK-Inhibitor zu dem Zellkulturmedium bei jedem Mediumwechsel gegeben; 3) Nehmen Sie nicht mehr Feeder-Zellen verwenden als empfohlen; 4) halten eine saubere aseptischen Kultur; und 5) Passage Zellen unmittelbar vor dem Erreichen der Konfluenz.
Aufgrund der patientenbezogenen Unterschiede in Biopsieproben für die bedingte Umprogrammierung erhalten, ist es vernünftig Unterschiede in Wachstumskinetik, Phänotyp und die Fähigkeit zu erwarten, um mehrere Durchgänge zu erweitern. Typischerweise werden vier Ösophagus Biopsien von jedem Patienten zur Zellisolierung erhalten. Sobald distanzierte wir etwa 300,000-600,000 Zellen am Tag 0 Damit erweitert sich auf über 10 Millionen Zellen durch Passage 3 im Durchschnitt netto. Morphologie der Kolonien, die für epithelialen Zelllinien beschrieben: Cobblestone Morphologie ähnlich aussehen bilden sollte <sup class = "xref"> 25 (Abbildung 2). Eine Probe von Zellen in Kultur sollten über qRT-PCR analysiert werden, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz für epithelialen Marker die Populationen erweitert sind in der Tat epithelialen Ursprungs (Abbildung 3) zu gewährleisten. Sollten sich die Zellen nicht epithelialen Marker (E-Cadherin, EpCAM, TJP1) exprimieren, sollte die Zelllinie beendet und verworfen werden. Es wird erwartet, dass mehr als 90% der vorhandenen Zellen, EpCAM-positiv sind, wenn sie in epithelialen Ursprungs sind. Um zu beurteilen, ob die Kulturen Phänotyp verändern oder verlieren epithelialen Ausdruck, Immunofluoreszenz oder Zytometrie sollte epithelialen Marker verwendet fließen werden, um zu bewerten (E-Cadherin), Vorläufer Ausdruck (P63) und epithelialen tight junction-Proteine (TJP1). Da die Zellen passagiert werden , erwartet wird , dass Phänotyp ändern sollte nicht, Proliferation sollte nicht zu verringern und diese Zellen epitheliale Expression sowie Vorläufer Ausdruck anzuzeigen (Abbildung 4 (Abbildung 5) zu haben. Zellen, die nicht zu verdoppeln, für mehr als 5 Tage gefunden werden, sind wahrscheinlich seneszenten sein und verworfen werden sollte.
Es wurde beschrieben, dass die von Patienten mit entzündlichen Prozessen vorhanden sein , wie EoE besitzen Epithelzellen isolierte Zellen , die eine verringerte Proliferationsrate aufweisen, verminderte E-Cadherin - Expression (Abbildung 3, Patienten 26 und 28) und eine hohe Rate der Apoptose 26. Daher ist es nicht unvernünftig Schwierigkeiten Kultivierung von Zellen aus einem schwerkranken Patienten zu haben, mit dieser Methode. Es ist möglich, dass Zellen nur wenige Passagen oder auch nur anfänglichen Durchgang standhalten. Dies sollte immer noch die Prüfer mit einer größeren Anzahl von Zellen als ursprünglich isoliert bereitzustellen. Jedoch kann diese Zahl nicht angemessenfür alle vorgeschlagenen Studien. Da diese Zellen schließlich verwendet werden, um Erkrankungen der Speiseröhre zu studieren oder ein Speiseröhrenersatz konstruieren, ist es wichtig, diese Zellen für die Schleimhautregeneration nur verantwortlich sind, zu erinnern. Andere Zelltypen wie Fibroblasten, Neuronen, Zellen der glatten Muskulatur und Blutgefäße sind auch ebenso wichtig für die Untersuchung von Erkrankungen der Speiseröhre und für das Tissue Engineering-Anwendungen.
Diese Technik bietet eine patientenspezifische Zellquelle, die für das Studium der Pathogenese der Erkrankung sowie dient als potenzielle Reservoir von patientenspezifischen Zellen für Speiseröhren Tissue Engineering-Anwendungen ein unschätzbares Werkzeug ist. Die Zellen verwendet für Biomaterialien für die chirurgische Implantation Impfen muss teratomas frei von genetischen Anomalien, viralen Sequenzen und nicht bilden. Die Verwendung von Stammzellen (multi- oder pluripotente) erzeugt zu viele unerwünschte Zelltypen folgende Differenzierung, von denen einige Teratome bilden, wenn sie nicht differen unterziehenhandlungen. Außerdem ist diese Zellquelle Phänotyp konsistente und nicht der Reinigung oder Entfernung von unerwünschten Zellen benötigen. Die ideale Zellquelle werden die Zellen, die in der gleichen anatomischen Stelle gefunden werden, die entwickelt wird. Bei diesem Ansatz werden diese Epithelzellen der Speiseröhre verwendet, um die Schleimhaut des Ösophagus-Gerüst wieder zu bevölkern. Zusätzliche Zelltypen sind für Speiseröhren Regeneration benötigt wird; jedoch war der Schwerpunkt dieser Technik die Schleimhaut, um sicherzustellen, wurde reseeded und nicht unvollständig, da dies zu Leckage, Stenose und Perforation führen kann.
Zusätzlich zu diesen Zellen zu nutzen für das Engineering neue chirurgische Optionen für die Speiseröhre, können diese Zellen auch Erkrankungen der Speiseröhre Prozesse verwendet werden, als auch für neue therapeutische Ansätze als Bildschirm zu untersuchen, diese Bedingungen zu behandeln. Eosinophile Ösophagitis (EoE) als eine allergische Erkrankung der Speiseröhre beschrieben, wobei der genaue Mechanismus und Pathogenese noch nicht vollständig beschrieben. Die derzeitige Behandlung regFormen umfassen Eliminationsdiäten, orale Steroide und mehrere Endoskopien. Kein Test vorhanden ist, um zu bewerten, was den Entzündungsprozess für jeden Patienten auslöst, die Ärzte führt eine "Vermutung und überprüfen Sie" verwenden Ansatz, der für den Patienten lange und oft frustrierend ist. Da dieses Verfahren von patientenspezifischen Zellexpansion nicht lentiviraler Transduktion oder genetische Modifikation nicht nutzt, ist die Möglichkeit der ständigen Änderungen der Genotyp der Zellen von der Umprogrammierung minimal. Das bedeutet , die theoretisch Zellen aus der in vivo - Umgebung unverändert. Die Fähigkeit , Patienten - Zellen in vitro zu testen , das auslösende Agens zu identifizieren wäre neu und schließlich zur Entwicklung neuer Diagnostika oder Therapeutika für diese pädiatrischen Patienten führen könnte.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
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