Summary
条件付き再プログラミングを利用した人の小児食道上皮細胞の拡大は、欠陥やけがを治療し、治療的スクリーニングアッセイのためのリザーバとして機能する自家移植のために食道の構築物を設計するために利用することができる細胞の患者特有の人口を持つ研究者を提供します。
Introduction
食道組織工学と好酸球性食道炎（EoEのは）過去10年間で多くの研究室での研究の焦点となっています。このような食道閉鎖症などの先天性の欠陥は、1を食べることができないことにつながる食道の不完全な開発につながる約1 4000で出生、に見られます。 EoEのの発生率と罹患率は1993年に病気のエンティティの識別EoEのの発生率は、人年あたり0.7から10 / 100,000に変化し、有病率は0.2〜43 /10万2の範囲であって以来、増加しています。長いギャップ食道閉鎖症を治療する新しい魅力的外科的アプローチは、患者自身の細胞を用いた移植のための組織構築物を生成することにあります。合成足場に関連してこれらの細胞は、免疫抑制を必要としない自己の構築物を生成します。いくつかのグループには、すでに私たちを調査し始めています7 -食道組織工学3だけでなく、ネイティブの食道上皮細胞の使用のための幹細胞様細胞のeは粘膜4を再入力します。小児患者の食道内に存在している疾患は、多くの場合、診断または介入なしで勉強するのは難しいです。また、利用する動物モデルまたはin vitroで、正確な疾患の病因または患者特異的な差異8を包含しないEoEのような小児疾患の細胞株モデルを不死化。したがって、抗原を誘発する特定の疾患を同定する基礎となるメカニズムを評価し、薬物治療を調べるために、インビトロで患者の疾患の過程を研究する能力は、新規であると患者の治療を助けることができる情報を臨床医に提供します。
TISSUにおける使用のために提案されてきた多くの自己または患者特異的細胞型がありました電子工学およびヒト疾患の病因を研究。しかしながら、これらの細胞型のいくつかは、大きな足場をシードまたはインビトロ試験で高いスループットを実行するために特定の表現型の十分な細胞を生成する能力が限られています。多能性又は多分化能性幹細胞の使用は、多くの研究の議論の主題となっているが、これらの細胞を使用するための制限および欠点がよく9に記載されています。ヒト胚性幹細胞の使用は非常に議論し、多くの倫理的な問題を提示されています。最も重要なことは、これらの細胞は、それらが前の生きたホスト10にそれらを提供すること、それらの多能性状態と区別されていない場合、腫瘍に類似している奇形腫を形成します。また、胚性幹細胞の使用は、患者特異的ではないであろうと、同種異系応答および免疫抑制10の必要性を誘発する可能性があります。人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、そのでき多能性細胞であります患者自身の細胞から誘導することができます。このような皮膚細胞などの体細胞は、統合および非統合の様々な技術を用いて、多能性状態に誘導することができます。次いで、これらの細胞を組織工学または疾患の研究のための患者特異的細胞源として働きます。これらの細胞内への不必要な遺伝物質の統合は、多くが記載されているとの配列が完全に除去性IPSCは、彼らが11を誘導された細胞型に向けてエピジェネティックな「記憶」を節約するために表示されている場合でも問題です。移植11の前に分化していない場合、これらの細胞は、 生体内で奇形腫を形成します。多くの分化プロトコルは、しかし、分化の終了時に得られた細胞型が均一とOではないことに注意することは非常に重要であり、上皮系統12、13、14に着目し研究されていますNLY目的の細胞型の割合を有します。このことは、低い収率および所望の細胞型を精製する必要が生じます。 iPS細胞は、潜在的な患者特有の細胞源であるが、組織工学又は疾患の調査のどちらかのために目的の細胞型を得るためのプロセスは非常に非効率的です。
肺15、胸16、小腸17、結腸18、膀胱19および食道20：ヒト上皮細胞が正常に含む人体の両方の罹患および非罹患種々の組織から単離されています。ヒト初代細胞の表現型は、21、22を維持する通路の有限数があることを留意することが重要です。残念ながら、このことは、疾患の研究のために又は操作足場に播種するために必要なセルの数移植のために達成されない場合があります。したがって、新たな技術が依然として上皮表現型を維持しながら、患者の細胞を拡大するために必要とされます。フィーダー細胞及びROCK阻害剤を用いた、正常および癌性上皮細胞の再プログラミング条件は、Liu らにより2012年に記載されました。 2 3。この技術は、照射されたフィーダー細胞を、ROCK阻害剤および条件付き再プログラミング媒体を使用して、前立腺癌および乳癌の生検から得られた癌性上皮細胞を拡大するために利用されました。目標は、このような薬物スクリーニングなどのin vitroアッセイのための十分な細胞を生成することでした。この技術は、幹細胞または高度に増殖性である前駆体のような状態へのこれらの細胞の「再プログラミング」によって無期限に上皮細胞を拡大することが可能です。これらの細胞は、非腫瘍形成性であり、奇形23、24を形成する能力を有さないことが実証されています。また、無染色体異常または遺伝子操作は、この技術23,24を用いて培養中のこれらの細胞を継代した後に存在しました。最も重要なことは、これらの細胞は、目的のネイティブな細胞型に分化することができます。したがって、この技術は不死化を必要とせずに、疾患の調査や組織工学のための患者特有の上皮細胞の大規模な貯水池を提供しています。
疾患過程を研究するために、特定の器官の上皮組織を入手することは、患者のリスクを常に頻繁に制限されないことが可能です。食道疾患や欠陥を患っている患者では、内視鏡生検の取得は解離し、条件付きでその患者の食道の粘膜に特異的である不定細胞源を提供するために再プログラムすることができ上皮組織を得るための低侵襲性アプローチです。これは、その後、in vitro試験を可能にします上皮細胞の潜在的な治療のための疾患過程と画面を評価しました。非常にこのアプローチから利益を得ることができる1つの疾患過程は、食道8のアレルギー性疾患として記載された好酸球性食道炎です。アレルギー試験ならびに治療的アプローチは、患者自身の上皮細胞を用いてin vitroで評価することができ、このデータは、個別の治療計画を開発するために、治療する医師に渡すことができます。小児患者からの内視鏡生検を得ることに関連して、条件付き再プログラミングの技術は、任意の患者から無期限に正常食道上皮細胞を拡張する機能を提供しています。この細胞源は、したがって、欠陥、病気や外傷のための患者固有外科的選択肢を提供するために、天然または合成の足場と一緒に組んですることができました。不定細胞数を持つことは、完全に再播種持って食道のコンストラクトを設計に役立つだろう残りの細胞タイプの再生を促進するのを助けるために、食道の上皮細胞でルーメン。
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Protocol
インフォームドコンセントは、小児患者の両親/保護者から入手し、治験審査委員会（IRB＃13から094）に従ってた後食道生検が得られました。
1.殺菌楽器とゼラチン溶液
- オートクレーブ鉗子、かみそりの刃及び汚染を防止するために、組織を処理する前に鋏。
- 0.1％ゼラチン溶液200mLを作るために、ゼラチンを0.2gと蒸留水200mLを組み合わせます。使用前にオートクレーブし、冷却。
2.コーティング組織培養プレート
- 前の細胞単離に約2時間、組織培養皿、（100 mm）をカバーし、細胞培養インキュベーター中、37℃でインキュベートするのに十分な0.1％のゼラチンを加えます。
注：これらのプレートはまた、事前に作製し、使用する前に、インキュベーター内で維持することができます。
3.解離のための酵素溶液を作ります
- 前細胞単離するのに約30分、秤量バイアル上ミリグラム濃度あたりの単位に基づいてバランスにディスパーゼの10単位。 37℃の水浴中で10 mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）のと場所で15 mLコニカルチューブ内の粉末を配置します。
4.メイキング細胞培養培地
- F12の35ミリリットル（ハム培地）、DMEMの11.5 mLを、L-グルタミンの0.5 mLを、100×ペニシリン/ストレプトマイシンの0.5 mLを、2.5mLの：無菌コニカルチューブに以下の成分を混ぜて、条件付き再プログラミング媒体の50mLのを作るために、ウシ胎児血清（FBS）の、ヒトインスリンの250μgのヒト上皮成長因子（EGF）の500 ngの。
- 3T3培地の500ミリリットルを作るために、FBSの50ミリリットル、100×ペニシリン/ストレプトマイシン及びDMEM 500mLのとL-グルタミンの5 mLを5 mLのを混ぜます。
- ケラチノサイト無血清培地の500ミリリットルを作成するには、EGF及び（メディアで提供）は、ウシ下垂体抽出物（BPE）のサプリメントを解凍。基本培地の500ミリリットルボトルにサプリメントを追加し、10の5 mLを加え0xのペニシリン/ストレプトマイシン
フィーダーソースとして5.培養し、照射3T3細胞
- DMEM、10％FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを含む、3T3培地を準備します。
- 文化少なくとも3日間患者サンプルの到着前組織で処理されたT-75フラスコ中の3T3細胞。
- 前患者サンプルの到着、フラスコ当たり0.25％トリプシンEDTA 5mLのを使用してトリプシン処理3T3細胞へと5分間、またはほとんどの細胞が浮遊するまで37℃でインキュベートするだけ
- 反応を停止さ3T3培地の5ミリリットルを追加します。細胞懸濁液を吸引し、15 mLコニカルチューブに移します。 300×gで5分間スピン。
- 培地を吸引し、細胞計数のためにトリパンブルーの定義された量で細胞を再懸濁します。死細胞を排除するためにトリパンブルーの10μLで細胞の10μLを兼ね備えています。細胞計数のための血球計数器の負荷、この溶液10μLを。
注：このプロトについてcolが、照射された3T3細胞のための播種密度は100ミリメートルプレート60万の細胞に等しい、1cm 2当たり10,900細胞です。 - 50 mLコニカルチューブに3T3培地25mLに患者サンプルを再懸濁当たりの100mmプレートにプレートし、3000ラドで照射するのに必要な細胞の数をアリコート。
- 照射後、100ミリメートルのプレートあたり5 mLで条件付き再プログラミング培地で300×gで再懸濁で5分間細胞をスピンダウン。
- 患者の細胞のメッキは、プロトコルの後半に行われるまで脇にチューブを設定し（ステップ7.6を参照してください）。
6.小児食道生検の保存や輸送、入手方法
- コニカルチューブ15 mLに100μg/ mLのprimocinとの完全なケラチノサイト無血清培地5 mLを加え、氷上で医療施設にそれを持って来ます。
注：媒体のこれらの管は、最大2ヶ月間4℃で保存することができます。 - TIで約8食道生検を取得内視鏡検査の私と、以下のように区切ります。
- 100μg/ mLのprimocinと濡れた氷の上の場所との完全なケラチノサイト無血清培地を含む15 mLコニカルに6生検を置きます。
- 濡れた氷の上に緩衝ホルマリンと場所の5mLに1生検を置きます。
- 最適切削温度化合物とcryomold小さな生検で1生検を置きます。
- 直ちに液体窒素中に配置されたイソペンタンのビーカーに、この金型をドロップします。いったん凍結し、標本袋にcryomoldを置き、発泡スチロール容器内のドライアイス上で保存します。
- 密封可能な袋の内側とウェット氷を含む輸送用ボックスに培地またはホルマリンで生検を含むチューブを置きます。密封し、バイオハザードラベルと箱にラベルを付け、実験室に運びます。
注：ドライアイスを含むコンテナおよび冷凍生検はまた、密封し、バイオハザード標識で標識されています。
7.処理ダウンストリーム文化と分析のために、患者の組織
- 実験室に到着すると、下流の切片またはRNA抽出のためのCの冷凍庫-80にドライアイス上で凍結した生検を転送します。ホルマリンにサンプルを置きます。 4℃の冷蔵庫に保管し、一晩固定することができます。
- 300×gで、残りの生検をスピンダウンし、培地を吸引除去します。円錐管、シールのディスパーゼ溶液10mlを加え、それを15分間、水浴中で37℃でインキュベートすることを可能にします。
- インキュベーション後、300×gで生検をスピンダウン。 0.05％トリプシンEDTA 5mLの培地を再懸濁生検を吸引します。
- 100ミリメートル滅菌プレートに生検を含むトリプシンEDTA 5mLのを転送し、可能な限り細かいとして2滅菌カミソリの刃を使用して生検をミンチ。
- 新しい15 mLコニカルにみじん切りの生検を含むトリプシンEDTA 5mLのを転送します。 0.05％トリプシンEDTAの追加5 mLでプレートを2回すすぎ、円錐に追加チューブ。 37℃の水浴中で10分間チューブをインキュベートします。
- インキュベーション後、5分間300×gで（1.4 RPM）で生検をスピンダウンし、培地を吸引除去します。円錐管だけでなく、放射線照射フィーダー細胞を含む条件付き再プログラミング培地5 mLに条件付き再プログラミング媒体の5 mLを加え（ステップ5.7を参照してください）。
- 組織培養皿からゼラチンを吸引した後、細胞懸濁液とプレートの10 mLにROCK阻害剤（1μL/ mLで）を追加します。 37℃でインキュベートします。
8.細胞を培養すると拡大
- 文化の約5日後、刻んだ生検断片を含む初期培地を吸引し、5mLの滅菌PBSでシャーレに2-3回すすいでください。 10μMでのROCK阻害剤を含むプレートに新しいメディアを追加します。
- 70％の密集度に到達すると、細胞を拡大。プレートに0.05％トリプシンEDTA 5mLのに加え、37℃のインキュベーターに目を削除するには、no以上2.5分間インキュベートEフィーダー細胞。そのインキュベーション後、トリプシンEDTAを吸引し、PBS 5mLでプレートをすすぎます。
- PBSを吸引し、プレートに0.25％トリプシンEDTA 5mLのを追加し、5〜10分間、または細胞がプレートからルーズになるまでインキュベートします。反応を停止し、50 mLコニカルチューブに流体のすべてを譲渡し、5分間、300×gでスピンダウンするプレートに培地の等量を追加します。
- 条件付き再プログラミング媒体の定義された量で細胞を再懸濁し、トリパンブルーの10μLとサスペンションの10μLを混合します。総細胞数を決定するために、血球計数器でカウントします。
- 、細胞を拡大120万と一緒に150ミリメートルプレートに100万人の食道細胞を追加するには15ミリリットルの全容量で3T3細胞を照射しました。 10μMで新鮮なROCK阻害剤を追加し、ゼラチンコートした150ミリメートル皿に細胞懸濁液を追加します。
9.フリーズおよびストアヒト食道上皮細胞
- 凍結培地にするために、10％を追加条件付き再プログラミング媒体にDMSO。トリプシン処理し、計数した後、新しい50 mLコニカルチューブに凍結し、5分間、300×gでスピンダウンする細胞を分取。
- 培地を吸引し、クリオバイアル当たり2ミリリットルで培地を凍結追加します。細胞懸濁液が均質になったら、前標識されたcyrovials 10 6細胞のアリコート。長期液体窒素貯蔵にバイアルを移動する前に、少なくとも24時間、-80℃で凍結容器内に配置します。
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Representative Results
患者の生検から食道上皮細胞を単離における重要なステップの概要を図1に要約されています。上皮細胞のコロニーは約4-5日で形成され、線維芽細胞フィーダー細胞（ 図2A）に囲まれます。これらのコロニーが拡大するにつれ、彼らはより大きなコロニー（ 図2B）を形成するために他のコロニーと合併します。培養物が70％コンフルエントになったら、それらは、（ 図2C）を展開する必要があります。線維芽細胞は、従来の上皮細胞を除去し、プレートから除去されることを保証するために、0.05％トリプシンEDTAは、フィーダーを除去するために、2.5分までに使用されます。フィーダーの不在は、 図 2Dのようになります。付着上皮細胞は、その後、0.25％トリプシン-EDTAでトリプシン処理し、新たな放射線照射フィーダー細胞（ 図2E）に再プレーティングされています。
図3A ）。これらの細胞は、フローサイトメトリーを介して、上皮マーカーを継代1で分析された三人の患者から存在する細胞の90％以上は、EpCAMの（ 図3B）について陽性でした。細胞は、継代1及び3での免疫蛍光によって分析しましたこれらの3継代にわたって表現型を確実にするためには、変更されませんでした。染色は、上皮マーカーE-カドヘリンの持続性を示している（ 図4A-D）、前駆細胞マーカーP63（ 図4E-H）、増殖マーカーKI-67（ 図4I-L）および上皮タイトジャンクションタンパク質TJP1（ 図4M-P ）。
最後に、成長曲線は、条件付き再プログラミング培養におけるこれらの細胞の倍加時間を評価するために、非罹患患者からの細胞株を用いてプロットしました。細胞を、0日目に100,000細胞で播種し、4日目でわずかに50万細胞（ 図5）であることが見出されました。倍加時間は約36から40時間であると計算されました。疾患細胞しかし、すべての患者は、個人差を考慮して個別に評価される必要があり、遅い倍加時間を有することが期待されます。
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図1：小児生検から単離および培養ヒト食道上皮細胞の概要。生検は、インフォームドコンセント後の小児患者から得て、研究室へのケラチノサイト無血清培地中で輸送されます。これらの生検は、その後、滅菌カミソリの刃で組織をミンチし、最終的に0.05％トリプシン-EDTAで処理し、その後、ディスパーゼの1 U / mLで処理されます。次いで、細胞懸濁液を、条件付き再プログラミング媒体に照射されたフィーダー細胞に添加されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ヒト食道上皮細胞を培養し、拡大。条件付き再書き込みで5日後明媒体は、食道の上皮細胞は、最終的に大きなコロニー（B）を形成する収束小さな石畳のコロニー（A）を形成し始めます。組織培養皿（C）70％コンフルエンスに達すると、プレートはまだ上皮細胞（D）の密着性を維持しながら、フィーダー細胞を除去するために、0.05％トリプシン-EDTAを用いて非常に短い時間で処理されます。上皮細胞は、その後、0.25％トリプシン-EDTAを用いて除去し、新たなフィーダー細胞を再プレーティングされます。ただ、24時間これらの細胞を分割した後、彼らは新しいコロニーを形成し、（E）を増殖していきます。倍率は100倍です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：フローサイトメトリーおよび定量RT-P培養で増殖細胞のCR分析。 （A）の条件付き再プログラミングの通過1での培養中の細胞の代表的な遺伝子発現は、P63発現において6倍の増加、前駆細胞のマーカーとしてだけでなく、生検の遺伝子発現と比較して、上皮マーカーCDH1とTJP1の減少を実証しました。これは、細胞集団は、より始原のような状態にあるため、より高度に増殖性であることを示します。遺伝子発現24時間後に再プログラミング（フィーダー細胞及びROCK阻害剤の除去後）が増加CDH1とTJP1発現が、P63の発現の減少を示しています。 （B）は継代1で得られた複数の患者由来の細胞のフローサイトメトリー分析のEpCAMを発現する細胞の90％以上を示します。患者27例26及び28は、EoEの患者の細胞であるが、非EoEの患者の細胞を表します。 トンこちらをクリックしてくださいOこの図の拡大版を表示します。
図4：通路1の細胞を、照射フィーダー細胞急行E-カドヘリン（A - D）との条件付き再プログラム培地中で増殖させた。3.細胞の免疫蛍光染色と同様に前駆マーカーP63（E - H）。これらの細胞は、継代3（ - L I）のまま増殖しています。最後に、これらの細胞は、上皮表現型（ - P M）と一致しているタイトジャンクションタンパク質1（TJP1）を発現します。核はDAPI（青）で対比染色された抗体は、アレクサフルオロ546抗体（オレンジ）を使用して検出されます。第2抗体（Ab）対照非特異的組織（Q、R）を二次抗体の結合を表します。スケールバー= 50ミクロン。倍率は200倍です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：条件付き再プログラム中の細胞の成長曲線。非疾患患者からの条件付き再プログラミング培地中の細胞は、定義された密度で播種した三の複製を4日間毎日計数しました。成長曲線は、約4日目及び0日目、これらの細胞の倍加時間で得られた数値に基づいて計算された36〜40時間の時間をされ、これらの細胞数を用いて倍加生成しました。エラーバーは標準誤差を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
患者の生検から食道上皮細胞を分離し、拡大するために最も重要な手順は次のとおりです。1）適切最小限の細胞死と生検組織を解離させます。 2）ROCK阻害剤は、すべての培地交換で細胞培養培地に添加されていることを確認します。 3）推奨よりも多くのフィーダー細胞を使用しないでください。 4）クリーンな無菌の文化を維持します。 5）コンフルエンスに到達する直前に継代細胞。
条件付き再プログラミングのために得られた生検サンプル中の患者関連の違いのために、それは、増殖速度、表現型および複数の通路に拡大する能力の違いを予想するのが妥当です。典型的には、4食道生検、細胞単離のために、各患者から得られます。一度解離し、我々はこれが平均的に通路3により1000万人以上の細胞に展開され、0日目で約300,000-600,000細胞をネット。上皮細胞株について記載石畳の形態のようになります形成したコロニーの形態<SUPクラス= "外部参照"> 25（ 図2）。培養中の細胞のサンプルは、フローサイトメトリーおよび上皮マーカーのための免疫蛍光が拡大する集団が起源で実際に上皮（ 図3）であることを確認するために、定量RT-PCRによって分析されるべきです。細胞は上皮マーカー（E-カドヘリン、EpCAMを、TJP1）を発現してはならない、細胞株は終了し、廃棄されるべきです。それらは、起源が上皮である場合に存在する細胞の90％以上でのEpCAM陽性であることが期待されます。文化が表現型を変更または上皮表現を失っているかどうかを評価、免疫蛍光またはフローサイトメトリーのために上皮マーカー（E-カドヘリン）、前駆式（P63）、および上皮タイトジャンクションタンパク質（TJP1）を評価するために利用されるべきです。細胞が継代されているように、表現型は変更されないことが予想され、増殖は減少してはならない、これらの細胞は、上皮表現だけでなく、前駆式（ 図4が表示されます図5）の集団倍加時間を持っているように見えます。 5日以上倍増しないことが判明している細胞は老化である可能性が高いと破棄されるべきです。
E-カドヘリンの発現（ 図3、患者26および28）、およびアポトーシス26の高率の減少、例えば、EoEのとして存在する炎症過程を有する患者から単離された細胞は、低下し、増殖速度を有する上皮細胞を有することが記載されています。したがって、困難この方法を用いて重症患者からの細胞を培養することを有することが不合理ではありません。細胞は、ほんの数通路またはだけでも、最初の継代に耐えることが可能です。これはまだ、元々孤立よりも細胞数の多い研究者を提供する必要があります。しかし、この数は適切ではないかもしれません提案されたすべての研究のため。これらの細胞は最終的に食道疾患を研究又は食道交換を構築するために使用されているので、これらの細胞は、粘膜の再生のための唯一の原因である覚えておくことが重要です。例えば、線維芽細胞、神経細胞、平滑筋細胞および血管のような他の細胞型はまた、食道疾患の研究および組織工学用途のための同様に重要です。
この技術は、疾患の病因を研究するだけでなく、食道組織工学アプリケーションのための患者特異的細胞の潜在的な貯水池として機能するための貴重なツールである患者に特異的な細胞源を提供しています。外科的移植のための生体材料を播種するために利用される細胞は、遺伝子異常、ウイルス配列の自由で奇形腫を形成してはなりません。幹細胞（多能性または多能性）の使用は、それらがdifferen受けなかった場合、そのうちのいくつかは、奇形腫を形成することができ、分化後あまりにも多くの不要な細胞型を生成しますtiation。また、このセルソース表現型が一致して、精製または不要な細胞の除去を必要としません。理想的な細胞源が設計されている同じ解剖学的位置で発見された細胞になります。このアプローチでは、これらの食道上皮細胞は食道足場の粘膜を再投入するために使用されています。追加の細胞型は、食道再生のために必要とされます。しかし、この手法の焦点は、これが漏れ、狭窄や穿孔につながることができますように粘膜が不完全で再播種し、されなかった確実にするためでした。
食道のための新たな外科的選択肢を設計するためにこれらの細胞を利用することに加えて、これらの細胞はまた、食道疾患プロセスの研究、ならびにこれらの状態を治療するための新たな治療法をスクリーニングするために使用することができます。好酸球性食道炎（EoEのは）まだ十分に説明されていない正確な機構および病因に、食道のアレルギー疾患として記載されています。現在の治療REG形態は、除去食、経口ステロイドと複数の内視鏡検査が含まれます。いいえアッセイは、「推測とチェック」を使用した患者のために長く、多くの場合、イライラさせられるアプローチをするために医師をリードする、各患者の炎症プロセスをトリガーするもの評価するために存在しません。患者特異的細胞増殖のこの方法は、レンチウイルス形質導入または遺伝子改変を利用しないので、再プログラミング・プロセスからの細胞の遺伝子型に永続的な変更の可能性が最小限に抑えられます。これは、細胞が、理論的に生体内環境から変わらないことを意味します。トリガーエージェントが新規であるだろうし、最終的にこれらの小児患者のための新しい診断法や治療法の開発につながる可能性が識別するために、in vitroで患者の細胞を試験する能力。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
