Summary
Utvidelse av menneskelige pediatriske esophageal epitelceller benytter betinget omprogrammering gir etterforskere med en pasientspesifikk populasjon av celler som kan benyttes for prosjektering esophageal konstruksjoner for autolog implantasjon å behandle defekter eller skade og fungere som et reservoar for terapeutiske utvelgelsesassays.
Introduction
Esophageal tissue engineering og eosinofil øsofagitt (EoE) har vært fokus for forskning på mange laboratorier i løpet av det siste tiåret. Medfødte defekter, slik som esophageal atresi, er sett i omtrent 1 i 4000 levende fødte, noe som resulterer i mangelfull utvikling av spiserøret som fører til manglende evne til å spise en. Forekomsten og utbredelsen av EoE har vært på vei oppover helt siden identifikasjon av sykdom enhet i 1993. Forekomsten av EoE varierte 0,7 til 10/100 000 per person-år, og forekomsten varierte 0,2 til 43/100 000 2. En ny kirurgisk attraktiv metode for å behandle langt hull esophageal atresien består i å generere vev konstrukter for implantering utnytte pasientens egne celler. Disse cellene i forbindelse med syntetiske stillas vil generere et autologt konstruksjon som ikke krever immunundertrykkelse. Noen grupper har allerede begynt å undersøke osse stilk-lignende celler for øsofageal vevsteknologi 3, så vel som anvendelse av naturlige esophageal epitelceller for å re-populere mucosa 4 - 7. Sykdommer som er til stede i spiserøret av pediatriske pasienter er ofte vanskelig å diagnostisere eller studere uten intervensjon. Videre benytter dyremodeller eller in vitro udødeliggjort cellelinje modeller for barn sykdommer som EoE omfatter ikke den eksakte sykdom patogenesen eller pasientspesifikke åtte forskjeller. Derfor er evnen til å studere en pasients sykdomsprosess in vitro for å identifisere spesifikke sykdoms utløsende antigener, evaluere underliggende mekanismene og undersøke medikamentell behandling ville være nye og tilveie klinikere med informasjon som kan hjelpe til med pasientbehandling.
Det har vært mange autologe eller pasient-spesifikke celletyper som har vært foreslått for bruk i tissue engineering og studere menneskelig sykdom patogenesen. Imidlertid er noen av disse celletyper er begrenset i deres evne til å generere nok celler av en spesifikk fenotype å pode en stor stillas eller utføre høy gjennomstrømning in vitro-studier. Bruken av pluripotent eller multipotente stamceller har vært tema for mye forskning diskusjon har imidlertid begrensninger og mangler for anvendelse av disse cellene er blitt godt beskrevet ni. Bruken av menneskelige embryonale stamceller er sterkt debattert og presenterer mange etiske problemstillinger. Viktigst er disse cellene danner teratomas, som er lik til en tumor, hvis de ikke er differensiert fra sin pluripotent tilstand forut for å levere dem til en levende vert 10. Videre vil bruk av embryonale stamceller ikke være pasientspesifikk og kan utløse en allogen respons og behovet for immunsuppresjon 10. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er pluripotente celler som kanvære avledet fra en pasients egne celler. Somatiske celler, slik som hudceller, kan bli indusert til en pluripotent tilstand ved hjelp av en rekke integrerende og ikke-integrerende teknikker. Disse cellene deretter tjene som en pasient-spesifikke celle kilder for tissue engineering eller sykdom etterforskning. Integreringen av uønsket genetisk materiale inn i disse cellene er en bekymring mange har beskrevet og selv om sekvenser er helt fjernet iPSCs synes å bevare en epigenetisk "minne" mot celletype som de ble hentet 11. Disse cellene også vil danne teratomas in vivo hvis ikke differensiert før transplantasjon 11. Mange differensierings protokoller er blitt undersøkt med fokus på epitel-linjene 12, 13, 14, men det er meget viktig å merke seg at de celletyper som resulterer i enden av differensiering er ikke homogen og oare ha en brøkdel av den celletype av interesse. Dette resulterer i lavt utbytte og behovet for å rense den ønskede celletype. Selv iPSCs er en potensiell pasient-spesifikke celle kilde, til prosessen få en celle type interesse for enten tissue engineering eller sykdom etterforskning er svært ineffektiv.
Humane epitelceller har blitt isolert fra et utvalg av både syke og ikke-sykt vev i menneskekroppen inkludert: lunge 15, bryst 16, 17 tynntarm, tykktarm 18, blære 19 og spiserøret 20. Det er viktig å merke seg at humane primære celler har et endelig antall av passasjer i hvilken fenotype opprettholdes 21, 22. Uheldigvis betyr dette at antall celler som er nødvendig for sykdom undersøkelse eller for såing en konstruert stillasetfor implantering kan ikke oppnås. Derfor er nye teknikker for å utvide pasientens celler samtidig opprettholde en epitelial fenotype. Betinget omprogrammering av normale og kreft epitelceller utnytte mater celler og ROCK inhibitor ble beskrevet i 2012 av Liu et al. 2 3. Denne teknikken ble brukt til å utvide kreft epitelceller hentet fra biopsi av prostata og brystkreft ved bruk av bestrålte feeder-celler, ROCK hemmer og betinget omprogrammering middels. Målet var å generere nok celler for in vitro-analyser for eksempel narkotika screening. Denne teknikken er i stand til å utvide epitelceller på ubestemt tid med "omprogrammering" disse cellene til en stilk eller progenitor-lignende tilstand, som er svært proliferativ. Det har vist seg at disse cellene er ikke-tumorgene og ikke har evnen til å danne teratomas 23, 24. Videre nokromosomavvik eller genetiske manipulasjoner var til stede etter aging disse cellene i kultur ved hjelp av denne teknikken 23, 24. Viktigst av disse cellene er bare i stand til å differensiere til den opprinnelige celletype av interesse. Derfor er denne teknikken har et stort reservoar av pasientspesifikke epitelceller for sykdom undersøkelse eller regenerering av vev uten behov for immortalisering.
Innhenting av epitelvev fra et spesifikt organ for å studere sykdomsprosesser er ofte begrenset, og ikke alltid er mulig på grunn av pasient risiko. For de pasienter som lider av esophageal sykdom eller mangler, er endoskopisk biopsi henting en minimal invasiv metode for oppnåelse av epitelvev som kan bli dissosiert og betinget omprogrammeres for å tilveiebringe en ubegrenset kilde celle som er spesifikk for slimhinnene i den pasienten spiserøret. Dette gir da for in vitro-studierav epitelcellene til å evaluere sykdomsprosesser og skjerm for potensielle terapeutiske midler. En sykdom som kan ha stor nytte av denne tilnærmingen er Eosinofil Øsofagitt, som har blitt beskrevet som allergisk sykdom i spiserøret 8. Allergi tester samt terapeutiske tilnærminger kan vurderes in vitro ved hjelp av pasientens egne epitelceller og disse dataene kan deretter sendes ut på behandlende lege for å utvikle tilpassede behandlingsplaner. Teknikken med betinget omprogrammering i forbindelse med innhenting av endoskopiske biopsier fra pediatriske pasienter gir mulighet til å utvide normale esophageal epitelceller ubestemt tid fra en pasient. Denne cellekilde kan derfor bli slått sammen med naturlig eller syntetisk stillas for å tilveiebringe en pasientspesifikk kirurgisk alternativ for defekter, sykdom eller traumer. Å ha en ubestemt celle nummer vil hjelpe ingeniør esophageal konstruksjoner som besitter en helt reseededlumen med esophageal epitelceller for å bidra til å lette regenereringen av de gjenværende celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Esophageal biopsier ble oppnådd etter at informert samtykke er innhentet fra foreldre / foresatte til de pediatriske pasienter og i samsvar med Institutional Review Board (IRB # 13-094).
1. sterilisering Instrumenter og Gelatin Solution
- Autoclave tang, barberblad og saks før håndtering vev for å hindre forurensning.
- For å gjøre 200 mL av 0,1% gelatin-oppløsning, kombinere 200 ml destillert vann med 0,2 g gelatin. Autoklav og avkjøle før bruk.
2. Coating vevskulturplater
- Omtrent 2 timer før celleisolasjon, tilsett nok 0,1% gelatin for å dekke en vevskulturskål (100 mm) og inkuberes ved 37 ° C i en cellekulturinkubator.
MERK: Disse platene kan også lages på forhånd og oppbevares i inkubator før bruk.
3. Å gjøre Enzyme løsning for Dissosiasjon
- Omtrent 30 min før celle isolasjon, veie ut10 enheter av dispase på en balanse basert på de enheter per milligram konsentrasjon på hetteglasset. Plassere pulveret i et 15 ml konisk rør med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og plasser i et 37 ° C vannbad.
4. Making cellekulturmedium
- For å gjøre 50 ml betinget omprogrammering medium, blande de følgende ingredienser i en steril konisk rør: 35 ml F12 (Ham 's Medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-glutamin, 0,5 ml 100 x penicillin / streptomycin, 2,5 mL føtalt bovint serum (FBS), 250 ug av humant insulin, 500 ng av human epidermal vekstfaktor (EGF).
- For å gjøre 500 ml 3T3 medium, bland 50 ml FBS, 5 ml 100 x penicillin / streptomycin og 5 ml L-glutamin med 500 ml DMEM.
- For å gjøre 500 ml keratinocyte serumfritt medium, tine EGF og storfe hypofysen ekstrakt (BPE) kosttilskudd (som følger med media). Legg kosttilskudd til 500 ml flaske basen medium og tilsett 5 ml av 100x penicillin / streptomycin
5. dyrking og bestråle 3T3 celler som Feeder Source
- Forbered 3T3 medium, omfattende DMEM, 10% FBS, 1x penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin.
- Kultur 3T3 celler i vev-behandlede T-75 kolber minst 3 dager før ankomst av pasientprøver.
- Like før ankomsten av pasientprøver, trypsineres 3T3-celler ved hjelp av 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA pr kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter eller inntil de fleste celler er flytende
- Tilsett 5 ml av 3T3-medium for å stoppe reaksjonen. Aspirer cellesuspensjonen og overføring til et 15 ml konisk rør. Spinn i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirere mediet og resuspender cellene i et definert volum av Trypan blå for celletelling. Kombiner 10 ul av cellene med 10 ul av Trypan blått for å ekskludere døde celler. Belastning 10 ul av denne oppløsning på et hemocytometer for celletelling.
MERK: For denne protocol, såing tetthet for bestrålte 3T3-celler er 10.900 celler pr cm2, noe som tilsvarer 600.000 celler pr 100 mm skål. - Alikvot av antallet celler som er nødvendige til platen en 100 mm plate per pasientprøve og resuspendert i 25 ml av 3T3-medium i et 50 ml konisk rør og bestråle med 3000 rad.
- Etter bestråling, ring celler ned i 5 min ved 300 xg og resuspender i betinget omprogrammering medium på 5 ml per 100 mm plate.
- Sett røret til side inntil plating av pasientceller skjer senere i protokollen (se trinn 7.6).
6. Innhenting, bevare og transportere Pediatric Esophageal Biopsi
- Tilsett 5 ml komplett keratinocyte serumfritt medium med 100 mikrogram / ml primocin til 15 ml koniske rør og bringe den til medisinsk anlegget på is.
MERK: Disse rørene av medium kan lagres ved 4 ° C i opptil 2 måneder. - Skaffe omtrent 8 esophageal biopsier på timeg endoskopi og separat som følger:
- Plasser seks biopsier i 15 ml konisk inneholder komplett keratinocyte serumfritt medium med 100 mikrogram / ml primocin og legg på våt is.
- Plasser en biopsi i 5 ml bufret formalin og legg på våt is.
- Plasser en biopsi i en liten biopsi cryomold med optimal skjæring temperatur sammensatte.
- Straks slipper denne formen inn i et beger med isopentan plassert i flytende nitrogen. Når frosset, plasserer cryomold i en prøve pose og lagre på tørris i en polystyren skum container.
- Plasser rørene inneholder biopsier i medium eller formalin i en lukkbar pose og deretter i en eske som inneholder våt is. Tett og merke boksen med en biohazard etikett og transportere den til laboratoriet.
MERK: Beholderen som inneholder tørris og frosset biopsi er også forseglet og merket med en biohazard etikett.
7. BehandlingPasient Tissue for Nedstrøms Kultur og analyse
- Ved ankomst til laboratoriet, overfører den frosne biopsi på tørris til -80 ° C fryser i nedstrøms snitting eller RNA-ekstraksjon. Plasser prøven i formalin. Oppbevar i en 4 ° C kjøleskapet og la den løse over natten.
- Spin de rester biopsier ned ved 300 xg, og aspirer mediet. Tilsett 10 ml dispase løsning på det koniske rør, pakning og tillate den å inkubere ved 37 ° C i et vannbad i 15 min.
- Etter inkubering spinne biopsier ned ved 300 x g. Aspirer medium og resuspender biopsier i 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA.
- Overfør 5 ml trypsin-EDTA som inneholder biopsier til en 100 mm steril plate og hakke de biopsier bruker 2 steriliserte barberblad så fin som mulig.
- Overfør 5 ml av trypsin-EDTA inneholdende hakket biopsier til et nytt 15 ml konisk. Skyll platen to ganger med ytterligere 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA og legge til den koniskerør. Inkuber røret i 10 minutter i et 37 ° C vannbad.
- Etter inkubering spinne biopsier ned ved 300 xg (1,4 rpm) i 5 minutter og aspireres mediet. Tilsett 5 ml av betinget omprogrammering medium til det koniske rør, samt 5 ml betingede omprogrammere medium inneholdende de bestrålte feeder-celler (se trinn 5.7).
- Legg ROCK-inhibitor (1 pl / ml) til 10 ml av cellesuspensjonen og platen etter aspirering av gelatin fra vevskulturskål. Inkuber ved 37 ° C.
8. Dyrking og utvide Cells
- Etter ca 5 dager med kultur, aspirer første medium som inneholder kjøttdeig-biopsi biter og skyll fatet 2-3 ganger med 5 ml sterilt PBS. Legg til ny medium til platen, inkludert ROCK inhibitor ved 10 uM.
- Ved å nå 70% sammenflyt, utvider cellene. Tilsett 5 ml av 0,05% Trypsin-EDTA til platen og inkuberes i et 37 ° C inkubator ikke mer enn 2,5 minutter for å fjerne the mater celler. Etter at inkubasjonen suge trypsin-EDTA og skyll plate med 5 ml PBS.
- Aspirer PBS og tilsett 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA til plate og inkuberes i 5-10 minutter eller inntil cellene er løsnet fra platen. Legg like mengder av medium til platen for å stoppe reaksjonen og overføre alle fluidet til et 50 ml konisk rør og spinne ned ved 300 xg i 5 minutter.
- Resuspender celler i et definert volum av betingede omprogrammere medium og blande 10 ul av suspensjonen med 10 ul av trypan blå. Stol på en hemocytometer å bestemme total celle nummer.
- For å utvide cellene, tilsett 1 million humane esophageal cellene til en 150 mm plate sammen med 1,2 millioner bestrålte 3T3-celler i et totalt volum på 15 ml. Legg frisk ROCK hemmer på 10 uM og legge til cellesuspensjonen til en gelatin-belagt 150 mm fatet.
9. Freeze og Store menneskelige Esophageal Epitelceller
- For å gjøre frysing medium, legge til 10%DMSO til betinget omprogrammering medium. Etter trypsinizing og telling, alikvoter av cellene for å fryse inn i en ny 50 ml konisk rør og spinne ned ved 300 xg i 5 minutter.
- Aspirer medium og tilsett frysemedium ved et volum på 2 ml pr kryoampulle. Når cellesuspensjonen er homogen, delmengde 10 6 celler i pre-merket cyrovials. Plasser i en frysebeholder ved -80 ° C i minst 24 timer før du flytter hetteglassene til langsiktig flytende nitrogen oppbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et sammendrag av de viktigste trinnene i å isolere esophageal epitelceller fra pasient biopsier er oppsummert i figur 1. Kolonier av epitelceller vil dannes i løpet av ca. 4-5 dager, og vil bli omgitt av fibroblast feeder-celler (figur 2A). Ettersom disse koloniene utvide de vil fusjonere med andre kolonier for å danne større kolonier (figur 2B). Når kulturer har blitt 70% sammenflytende, de trenger å bli utvidet (Figur 2C). For å sikre at fibroblaster blir fjernet fra platen før fjerning av epitelceller, er 0,05% trypsin-EDTA anvendes i opp til 2,5 minutter for å fjerne forer. Fraværet av matere bør ligne på figur 2D. De adherente epitelceller blir deretter trypsinert med 0,25% Trypsin-EDTA og utsådd på nye bestrålte feeder-celler (figur 2E).
(figur 3A ). Disse cellene ble også analysert ved passasje for en epitel-markører via flowcytometri og mer enn 90% av cellene er tilstede fra tre pasienter var positive for EpCAM (figur 3B). Celler ble også analysert via immunofluorescens ved passasjer 1 og 3 for å sikre fenotypen i løpet av disse 3 passeringer var ikke i endring. Fargingen viser utholdenhet av epiteliale markør E-cadherin (figur 4A-D), progenitor markør P63 (figur 4E-H), men da proliferasjon KI-67 (figur 4I-L) og epitelial tett junction-protein TJP1 (figur 4 M-P ).
Til slutt, ble en vekstkurve opptegnet ved hjelp av en cellelinje fra en ikke-syk pasient for å vurdere doblingstiden av disse cellene i betingede omprogrammere kultur. Celler ble sådd ut ved 100.000 celler ved dag 0 og ble funnet å være bare litt mer enn 500.000 celler på dag 4 (figur 5). Doblings tid ble beregnet til å være ca 36-40 timer. Det er forventet at syke celler vil ha en langsommere fordoblingstid, men bør enhver pasient må vurderes separat for å ta hensyn til individuelle forskjeller.
1 ">
Figur 1: Oversikt over Isolering og dyrking Menneskelig Esophageal Epitelceller fra Pediatric biopsier. Biopsi er hentet fra pediatriske pasienter etter informert samtykke og transporteres i keratinocyte serumfritt medium til laboratoriet. Disse biopsier blir deretter behandlet med 1 U / ml dispase, etterfulgt av hakking vevet med sterile barberblad og til slutt behandling med 0,05% Trypsin-EDTA. Cellesuspensjonen ble deretter tilsatt til bestrålte feeder-celler i betinget medium omprogrammering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Dyrking og utvide menneskelig Esophageal Epitelceller. Etter 5 dager i betinget omprogrammereming medium, esophageal epitelceller begynner å dannes små brostens kolonier (A), som til slutt konvergerer for å danne større kolonier (B). Når vevskulturskål når 70% konfluens (C), blir platene behandles i en meget kort tid med 0,05% Trypsin-EDTA for å fjerne feeder-celler, mens det fremdeles opprettholde klebing av epitelcellene (D). Epitelcellene blir deretter fjernet med 0,25% Trypsin-EDTA og på ny sådd ut med nye feeder-celler. Bare 24 timer etter splitting disse cellene vil de danne nye kolonier og fortsetter å spre seg (E). Forstørrelse er 100X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flowcytometri og QRT-PCR Analyse av celler utvidet i kultur. (A) Representative genekspresjon av celler i kultur ved passering av en betinget reprogrammerings viste en 6 gangers økning i ekspresjon P63, en markør for stamceller så vel som en nedgang i epitel-markører CDH1 og TJP1 sammenlignet med den biopsi genekspresjon. Dette indikerer cellepopulasjonen er i en mer progenitor-aktig tilstand, og derfor er mer høyt proliferativ. Genekspresjon 24 timer etter omprogrammering (etter fjerning av feeder-celler og ROCK-hemmer) demonstrerer øket CDH1 og TJP1 uttrykk, men en reduksjon i P63 uttrykk. (B) Strømningscytometri-analyse av celler fra flere pasienter ble oppnådd ved passering 1 viser mer enn 90% av cellene som uttrykker EpCAM. Pasient 27 representerer ikke-EOE pasientens celler, mens Pasienter 26 og 28 er EOE pasientens celler. Vennligst klikk her to vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunofluorescens Farging av cellene ved passasjer 1 og 3. Celler dyrket i betinget medium omprogrammering med bestrålte feeder-celler uttrykte E-cadherin (A - D), så vel som progenitor markør P63 (E - H). Disse cellene er fortsatt proliferativ ved passasje 3 (I - L). Til slutt, disse cellene uttrykker tett junction-protein 1 (TJP1), som også er forenlig med en epitelial fenotype (M - P). Kjerner er kontra med DAPI (blå) og antistoffer påvises ved hjelp av Alexa Fluor 546 antistoff (oransje). 2. Antistoff (Ab) kontroll representerer ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoff til vevet (Q, R). Skala barer = 50um. Forstørrelse er 200X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Vekst Curve av celler i Betinget omprogrammering. Celler i betingede omprogrammere medium fra en ikke-syk pasient ble sådd ut ved en tetthet definert og replikerer av tre ble tellet hver dag i 4 dager. Vekstkurven ble generert ved hjelp av disse celletall og dobling tid ble beregnet på grunnlag av tallene innhentet på dag 4 og dag 0. Den doble tiden av disse cellene er ca 36-40 timer. Feilfelt indikere standard feil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste trinnene for å isolere og utvide esophageal epitelceller fra pasient biopsier er: 1) tilstrekkelig dissociating vevsprøver med minimal celledød; 2) sørge for ROCK inhibitor blir tilsatt til cellekulturmediet ved hver utskiftning av medium; 3) Ikke bruk flere mater celler enn anbefalt; 4) opprettholde en ren aseptisk kultur; og 5) passasje cellene like før nå samløpet.
På grunn av de pasientrelaterte forskjeller i biopsiprøver innhentet for betinget omprogrammering, er det rimelig å forvente forskjeller i vekstkinetikk, fenotype og evne til å utvide til flere passasjer. Vanligvis er 4 esophageal biopsier erholdt fra hver pasient for celleisolasjon. Når dissosiert, netto vi ca 300,000-600,000 celler på dag 0. Dette utvider til over 10 millioner celler ved passering 3 i gjennomsnitt. Morfologi av kolonier som danner bør ligne på brostein morfologi beskrevet for epiteliale cellelinjer <sup class = "xref"> 25 (figur 2). En prøve av celler i kultur skal analyseres via QRT-PCR, flow cytometri og immunofluorescens for epitel-markører for å sikre at populasjonen ekspanderende er faktisk epitelisk opprinnelse (figur 3). Dersom cellene ikke uttrykker epitelceller markører (E-cadherin, EpCAM, TJP1) bør cellelinje bli avsluttet og kastes. Det forventes at mer enn 90% av cellene som er tilstede er EpCAM positive hvis de er epitelial opprinnelse. For å vurdere om kulturene endrer fenotypen eller miste epitelial uttrykk, immunfluorescens eller strømningscytometri bør benyttes for å evaluere epiteliale markører (E-cadherin), progenitor uttrykk (P63), og epiteliale stramme koblings proteiner (TJP1). Ettersom cellene passeres det er forventet at fenotype ikke skal endres, må spredning ikke avta, og disse cellene skal vise epitelial ekspresjon, så vel som progenitor uttrykket (Figur 4 (figur 5). Celler som er funnet ikke å doble i mer enn 5 dager er sannsynlig å være senescent og skal kastes.
Det er blitt beskrevet at celler isolert fra pasienter med betennelsesprosesser er tilstede, slik som EoE, besitter epitelceller som har en redusert proliferativ hastighet, redusert E-cadherin uttrykket (figur 3, Pasienter 26 og 28) og en høy grad av apoptose 26. Derfor er det ikke urimelig å ha problemer med å dyrke celler fra en alvorlig syk pasient ved hjelp av denne metoden. Det er mulig at cellene vil bare tåle noen passasjer eller bare første passering. Dette bør likevel gi undersøkeren med et større antall celler enn opprinnelig isolert. Imidlertid kan dette tallet ikke være tilstrekkeligfor alle foreslåtte studier. Siden disse cellene blir brukt til slutt å studere esophageal sykdom eller konstruere en øsofageal erstatning, er det viktig å huske disse cellene er bare ansvarlig for mukosal regenerering. Andre celletyper som fibroblaster, nevroner, glatte muskelceller og blodårer er også like viktig å studere esophageal sykdom og for tissue engineering applikasjoner.
Denne teknikken gir et pasient-spesifikk cellekilde som er et uvurderlig verktøy for å studere sykdom patogenese, så vel som å tjene som et potensielt reservoar av pasient-spesifikke celler for esophageal vev tekniske anvendelser. Celler som brukes for såing biomaterialer for kirurgisk implantasjon må være fri for genetiske avvik, virale sekvenser og ikke form teratomas. Bruk av stamceller (multipotente eller pluripotente) genererer for mange uønsket celletyper følgende differensiering, noen som kan danne teratomas hvis de ikke gjennomgår differenfor handling. Dessuten er denne celle kilde fenotype konsistente og ikke krever rensing eller fjerning av uønskede celler. Den ideelle celle kilden vil være celler som er funnet i den samme anatomisk lokalisering som blir konstruert. I denne tilnærmingen disse esophageal epitelceller blir brukt til å repopulere slimhinnene i en esophageal stillaset. Andre celletyper er nødvendig for esophageal regenerering; imidlertid fokus for denne teknikk for å sikre at slimhinnen var reseeded og ikke ufullstendig, da dette kan føre til lekkasje, innsnevring og perforering.
I tillegg til å benytte disse celler for å konstruere nye kirurgiske muligheter for spiserøret, kan disse cellene også brukes til å studere esophageal sykdomsprosesser, så vel som skjerm for nye terapeutiske tilnærminger for behandling av disse tilstandene. Eosinofil øsofagitt (EoE) er beskrevet som en allergisk sykdom i spiserøret, og den eksakte mekanismen og patogenese ennå ikke fullstendig beskrevet. Nåværende behandling regiments inkluderer eliminering dietter, orale steroider og flere endoscopies. Ingen analysen finnes for å vurdere hva som utløser den inflammatoriske prosessen for hver pasient, noe som fører leger til å bruke en "gjetning og sjekke" tilnærming som er lang og ofte frustrerende for pasienten. Siden denne metoden for pasientspesifikk celle utvidelse ikke utnytter lentiviral transduksjon eller genetisk modifisering, muligheten for permanente endringer i genotypen av cellene fra reprogrammerings-prosessen er minimal. Dette betyr at cellene teoretisk er uendret fra in vivo miljøet. Evnen til å teste pasientceller in vitro for å identifisere utløsende agenten vil være ny og kan til slutt føre til utvikling av nye diagnostiske eller terapeutiske midler for disse pediatriske pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
