Summary
Her er en protokol (MitoCeption) præsenterede at overføre mitokondrier, isoleret fra humane mesenkymale stamceller (MSC), til glioblastom stamceller (GSC), med det mål at studere deres biologiske virkninger på GSC metabolisme og funktioner. En lignende protokol kan tilpasses til at overføre mitokondrier mellem andre celletyper.
Abstract
Mitokondrier spiller en central rolle for cellens stofskifte, energiproduktion og kontrol af apoptose. Utilstrækkelig mitokondriefunktionen har vist sig ansvarlig for meget forskellige sygdomme, der spænder fra neurologiske patologier til kræft. Interessant nok har mitokondrier nylig vist at vise evnen til at blive overført mellem celletyper, navnlig fra humane mesenchymstamceller (MSC) til cancerceller i cokultur betingelser, med metaboliske og funktionelle konsekvenser for mitokondrierne recipientceller, yderligere forøgelse af det aktuelle interesse for de biologiske egenskaber af disse organeller.
Evaluering af virkningerne af den overførte MSC mitokondrier i målcellerne er af største betydning for at forstå den biologiske resultatet af disse celle-celle-interaktioner. Den her beskrevne MitoCeption protokollen gør det muligt at overføre mitokondrierne isolerede forhånd fra donor celler til målcellerne, hjælp MSC mitokondrierog glioblastoma stamceller (GSR) som et modelsystem. Denne protokol er tidligere blevet anvendt til at overføre mitokondrier isoleret fra MSC'er, at adhærente MDA-MB-231 cancerceller. Denne mitokondrier transfer protocol er tilpasset her GSCS der udgør den specifikke særlige ved vokser som neurosfærer in vitro. Overførsel af de isolerede mitokondrier kan følges ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og konfokal billeddannelse under anvendelse mitokondrier vitale farvestoffer. Brugen af mitochondrier donor- og target celler med forskellige haplotyper (SNP'er) tillader også påvisning af de overførte mitokondrier baseret på koncentrationen af deres cirkulære mitokondrie-DNA (mtDNA) i målcellerne. Når protokollen er blevet valideret med disse kriterier, kan de celler, der huser de overførte mitokondrier yderligere analyseret for at bestemme virkningerne af de eksogene mitokondrier på biologiske egenskaber såsom cellens stofskifte, plasticitet, spredning og respons på behandling.
Introduction
Mitokondrier er organeller, der findes i eukaryote celler, hvor de spiller en central rolle i optagelsen af næringsstoffer samt i energi- og metabolit-produktion. Disse organeller indeholder cirkulære mitokondrie-DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, der koder for proteiner af elektrontransportkæden komplekser, tRNA'er og rRNA'er 1. Funktionaliteten af disse organeller er kritisk for cellehomeostase og adskillige patologier er blevet forbundet med mitokondrier dysfunktion 1, 2, 3. Den mitokondrier status for eksempel været forbundet med inflammation, infektionssygdomme og cancer, i sidstnævnte tilfælde med konsekvenser for metastase og modstandsdygtighed over for terapi 4, 5, 6, 7.
Mitokondrier vise den bemærkelsesværdige evne blive overført mellem "donor" og "mål" celler. Dette fører til ændringer i den energiske metabolisme af målcellerne såvel som i andre funktionelle modifikationer, såsom vævsreparation og modstandsdygtighed over for kemoterapeutiske midler, som for nyligt vist ved forskellige laboratorier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De humane mesenkymale stamceller (MSC'er) viser denne evne til at overføre mitokondrier til en bred vifte af målceller, herunder cardiomyocytter, endotelceller pulmonale alveolære epitelceller, renale tubulære celler og cancerceller, hvilket fører til ændringer af de funktionelle egenskaber af disse celler 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondrier udveksling fremstår nu som en meget anvendt mekanisme, der tillader et antal forskellige celletyper til at kommunikere med hinanden og ændre deres biologiske egenskaber. Denne mitokondrier udveksling kan ske gennem tunneling nanorør (TNT) dannelse, der involverer connexin 43-holdige gap junctions 8 eller M-Sec / TNFaip2 og exocyst komplekse 19. Alternativt blev mitokondrier overførsel også vist at være medieret af arrestin-domæne-holdige protein 1-medierede mikrovesikler (ARMMs) 20. Interessant nok blev effekten af mitokondrierne overførsel knyttet til udtrykket satsen for Rho GTPase en MIRO1 21, en afgørende faktor for at forklare forskellene i mitokondrier overføre effektiviteter mellem iPSC-MSC og voksen BM-MSC 22.
På trods af dette væld af data om celle-til-celle mitokondrier udveksling, er relativt lidt kendt om metabolisk og biologisk resultat af denne mitokondrier overførsel. Derfor er det fuldt ud berettiger oprette de nødvendige værktøjer til fuldt ud at vurdere de biologiske virkninger af denne overførsel. I årenes løb til adskillige tekniske metoder overføre mitokondrier fra donor til acceptor-celler er blevet foreslået. Dette omfatter direkte injektion af mitokondrier i oocytter 23, 24, 25, cellefusion at generere transmitochondrial cybrids 26, 27 og for nylig, overførsel af isolerede mitokondrier hjælp fototermisk nanoblades 28.
Vi og andre tidligere påvist kapacitet isolerede mitochondria skal internaliseres af levende celler, som observeret både in vitro og in vivo 29, 30, 31, gennem mekanismer foreslået at inddrage macropinocytosis 32. Vi udviklede endvidere en fremgangsmåde, kaldet MitoCeption, for kvantitativt at overføre isolerede mitokondrier (fra MSC'er) til målceller, som eksemplificeret med (klæbende) MDA-MB-231 brystcancercellelinje 31. Denne protokol blev tilpasset her til overførsel af isolerede humane MSC mitokondrier til glioblastom stamceller (GSCS).
Glioblastoma er aggressive maligne tumorer i hjernen, der hurtigt bliver resistente over for behandling, primært som følge af glioblastom stamceller (GSC) til stede i tumoren 33. Disse GSCS vokse som neurosfærer in vitro og generere tumorer i xenograftmodeller. Cancerceller inden glioblastom harkapacitet til at gøre celle-til-celle-forbindelser, som vist for nylig for astrocytiske hjerne tumorceller, interconnect via udvidede mikrorør, hvorigennem mitochondrier (samt calcium- og cellekerner) kan migrere, hvilket resulterer i radioterapi-resistent astrocytom net 34. Glioblastom kan rekruttere mange forskellige celler i tumoren mikromiljø, herunder MSC'er 35, 36. Vi viste, at MSC kan gøre celle-celle-forbindelser med GSCS i cokultur og overføre deres mitokondrier (data ikke vist), hvilket forventes at modificere GSC funktionelle egenskaber. Den nuværende protokol beskriver, hvordan MitoCeption teknik kan bruges til at overføre mitokondrier, isoleret på forhånd fra humane MSC'er, menneskelige GSCS med henblik på fastlæggelsen af deres funktionelle biologiske resultat. Den multipotente og yderst tumorigene GB4 GSC linie 37 blev anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. Mærkning af Mesenchymale Stem Cell (MSC) Mitokondrier (valgfri)
- To dage før mitokondrier forberedelse, frø humane MSC'er i en 100 mm dyrkningsskål i 10 ml aMEM / FBS 10%, for således at have 4 x 10 5 MSC'er i kulturen på dag 1.
- Skyl MSC'er med PBS (4 ml) og tilsæt 4 ml aMEM / FBS 1% (forvarmet til 37 ° C).
- Tilsæt nødvendige mængde mitokondrier vitale farvestof og inkuber cellerne i 30 minutter i 37 ° C inkubator.
- Fjern mitokondrierne farvestof opløsning, skylles cellerne to gange med 4 ml forvarmet (37 ° C) aMEM / FBS 1% og tilsæt tilbage 4 ml aMEM / FBS 10%. Cellerne inkuberes ved 37 ° C.
- Ændre dyrkningsmedium (10 ml aMEM / FBS 10%) efter 30 minutter, og, en anden gang, 2 timer senere.
Dag 1
2. Mærkning af glioblastoma Stamceller (GSC) (valgfri, se Diskussion sektion)
| Cellekulturmedium | Sammensætning |
| GSC basalt medium | DMEM / F-12 suppleret med |
| Insulin 20 mg / ml | |
| N2 supplement 1x | |
| Glucose 3 g / l | |
| L-glutamin 2 mM | |
| GSC spredning medium | Tilføj til det basale medium: |
| B27 supplement 1x | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizon 0,25 mg / ml | |
| Heparin 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacin 2 ug / ml | |
| Gentamicin 2 ug / ml | |
| MSC proliferationsmedium | & #945; MEM suppleret med |
| L-glutamin 2 mM | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tabel 1: Kultur Medier.
- Dissociér GSCS (GB4 cellelinje 32 (10 x 10 6 celler) dyrkes som neurosfærer på poly-HEMA belagt celle kultur flasker (se trin 3.1 til 3.12).
- Seed GSCS i en 48-brønds plade ved 10 5 celler / brønd i GSC proliferation medium (500 pi) (se tabel 1).
- Centrifugeres pladen ved 270 x g i 5 minutter ved 20 ° C.
- Tilsæt nødvendige mængde celle vitalfarvestoffet og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Der tilsættes 500 pi GSC basalt medium (tabel 1) pr brønd i 48-brønds plade.
- Centrifugeres pladen ved 270 x g ved 20 ° C i 5 min. Aspirere supernatanten.
- Gentag trin 2.5 til 2.6.
- Der tilsættes 500 pi GSR basalt medium og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Centrifugeres pladen ved 270 x g ved 20 ° C i 5 min. Aspirere supernatanten.
- Der tilsættes 500 pi GSC proliferationsmedium pr brønd i 48-brønds plade og inkuber i 37 ° C inkubator.
Bemærk: Mængden af GSCS angivet (10 x 10 6 celler) tillader at udføre de forskellige dosis-respons eksperimenter og FACS kontroller. Når de eksperimentelle betingelser er mere præcist defineret dette beløb kan skaleres ned.
dag 2
3. Podning af glioblastom Stamceller
- Indsamle GSR neurosfærer (10 x 10 6 celler) ved centrifugering ved 270 xg i 5 minutter, ved 20 ° C i et 50 ml rør.
- Vask cellerne med 5 ml HBSS, og der centrifugeres ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Aspirere supernatanten.
- Forsigtigt resuspender GSC pellet i 100 pi trypsin-EDTA (0,25%) (per 10 x 10
- Der inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Tilsæt 10 pi CaCI2 (20 mM) og 2 pi DNase I (10 mg / ml).
- Dissociere neurosfærer ved forsigtigt pipettering op og ned (30-50x) med en P200 pipette. Undgå bobler. Kontroller under mikroskop, at alle GSCS dissocieres.
- Tilsæt 10 pi trypsininhibitor (5%) og 10 ml HBSS.
- Centrifuger GSCS ved 270 xg i 7 min ved 20 ° C.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 10 ml GSC basalt medium (tabel 1).
- Tæl GSCS med en Thoma tællekammer og centrifugeres cellerne ved 270 xg i 7 min ved 20 ° C.
- Tilsæt passende volumen af GSC proliferation medium (tabel 1) for at nå den cellulære koncentration af 10 6 GSCS / ml.
- Seed 10 5 GSCS (100 pi af cellesuspensionen) pr brønd af en 96-brønds plade.
- Centrifugeres pladerne ved 270 x g i 7 minutter ved 20 ° C for at få GSCS ved botTom brønde.
- Inkubér 96-brønds plade ved 37 ° C indtil afsnit 5.
dag 2
4. MSC Mitokondrier Isolation
- Juster mikrorør centrifuge temperaturen til 4 ° C.
- Forbered to 1,5 ml rør "A" og "C", der indeholder reagenserne til mitokondrier ekstraktion (200 pi reagens A og 400 pi reagens C, begge indeholdende EDTA-fri proteasehæmmere). Forbered 2 andre rør, mærket "MSC" og "Mito". Hold alle rør på is. forberede Også rør til mitokondrierne seriefortyndinger.
- Wash MSC'er med 10 ml forvarmet (37 ° C) PBS.
- Wash MSC'er med 2 ml trypsin (ingen EDTA) i 10 sek, og der tilsættes 1 ml trypsin (ingen EDTA). Cellerne inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C.
- Recover MSC'erne ved tilsætning af 10 ml aMEM / FBS 10%, overførsel til et 50 ml rør.
- Centrifuger cellerne ved 270 x g i 5 minutter ved 20 ° C.
- Supernatanten fjernes, og tilføj10 ml aMEM / FBS 10% til cellepelleten.
- Tæl MSC'erne med et Malassez tællekammer.
- Centrifuge MSC'er (4-5 x 10 5) ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Supernatanten fjernes, tilsættes 1 m iskold aMEM / FBS 10% til cellepelleten og overføre cellerne til "MSC" -mærket rør (fremstillet i trin 4.2). Hold røret på is.
- Centrifuger røret med MSC'erne ved 900 xg i 5 min, ved 4 ° C.
- Fjern alle tilbageværende medium fra røret.
- Tilsæt 200 pi Mitokondrier Isolation Reagens A (indeholdende EDTA-fri proteaseinhibitorer). Vortex ved middel hastighed i 5 sekunder og efterlade rør på is i nøjagtigt 2 minutter.
- Tilføj 2,5 ul Mitokondrier Isolation Reagens B. Vortex ved maksimal hastighed i 10 sek, og derefter forlade rør på is. Gentag hver 30 sek i 5 min.
- Tilsæt 200 pi Mitokondrier Isolation Reagens C (indeholdende EDTA-fri proteaseinhibitorer). Bland ved at vippe røret (roughly 30 gange, ikke vortex). Centrifugeres røret ved 700 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (indeholdende MSC mitokondrier) til "Mito" rør (fremstillet i trin 4.2).
- Der centrifugeres ved 3.000 x g, 15 min ved 4 ° C, for at få mitokondrierne pellet. Supernatanten kasseres. Pelleten indeholder de isolerede mitokondrier.
- Skyl mitokondrier pellet med 200 pi af reagens C. Derefter centrifugeres ved 12.000 xg 5 min ved 4 ° C, for at få mitokondrierne pellet.
5. Overdragelse af Isoleret MSC mitokondrier til GSCS (MitoCeption)
- Tilsæt 200 pi af præ-afkølet (0 ° C) GSC proliferation medium til mitokondrierne pellet isoleret fra MSC'er (4 x 10 5).
- Fortynd præparatet mitokondrier (i GSC spredning medium) til konsekvent at tilføje 20 ul mitokondrie suspension til GSCS.
- Tilsæt mængden af isolerede mitokondrier i brøndene på 96-well plade indeholdende de GSCS (fra trin 3.15) ved den ønskede koncentration (0,1 til 10 ug). Tilsæt mitokondrier langsomt, tæt på bunden af brønden, der dækker hele overfladen mindst én gang.
- Til styring MSC mitokondrier vitalfarvestof lækage, tilsæt de samme mængder af mitokondrier forberedelse (0,1 til 10 ug) til brønde på en 96-brønds plade indeholdende GSC spredning medium kun (ingen GSCS) (se del 6.2 for vitalfarvestof udsivningsdetektionssystem).
- Centrifuger 96-brønds plade indeholdende mitokondrier modtagende GSCS med MSC mitokondrier (trin 5.3) og styrepladen (trin 5.4) ved 1.500 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Placer dyrkningspladerne i 37 ° C celleinkubator umiddelbart efter centrifugering.
Bemærk: mitokondrier transfer protocol Den er afhængig af centrifugering af mitokondrier suspensionen på de dyrkede celler ved passende centrifugering kraft, med en række centrifugeringer der kan justeres afhængigt af System mitochondrier donor / recipientceller.
Dag 3
6. Analyse af mitokondrier Transfer ved FACS og Konfokal Imaging
- Fremstilling af GSR prøver til FACS-analyse
Bemærk: Hvis MSC mitokondrier blev mærket med en vital farvestof forhånd (§ 1), kan effektiviteten blive overvåget af FACS, 24 timer efter mitokondrierne overførsel.- Centrifuger 96-brønds plade med MitoCepted GSCS ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Supernatanten kasseres.
- Tilsæt 100 pi trypsin (ingen EDTA) i hver brønd. Der inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter. Pipetter op og ned for at dissociere neurosfærerne dannet i 24 hr periode.
- Tilsæt 100 pi GSR basalt medium.
- Centrifugeres pladen ved 270 x g i 5 minutter ved 20 ° C, og supernatanten fjernes.
- Resuspender GSCS i 300 pi GSC basalt medium og overførsel til FACS tilpassede rør.
- Udfør FACS enANALYSE.
- Kontrol til mitokondrier vitalfarvestof lækage fra det isolerede mitokondrier (FACS)
Bemærk: Formålet med dette trin er at bestemme baggrunden FACS signal, der ikke ville afspejle en ægte MSC mitokondrier overførsel, men snarere den blotte lækage af vital farvestof fra det mærkede MSC mitokondrier bruges til MitoCeption (trin 5.3).- Seed GSR celler som beskrevet i trin 3.1 til 3.15.
- Inkuber cellerne ved 37 ° C i 1 time.
- Centrifuger 96 brønde kun indeholdende mitokondrier (fra trin 5.4 5.6) ved 1.500 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Aspirere dyrkningsmediet fra 96-brønds plade GSC (trin 6.2.2) og erstatte den med mediet inkuberet med mitokondrier kun (supernatant fra trin 6.2.3).
- Inkubér 96-brønds plade indeholdende de GSCS ved 37 ° C i 2 timer.
- Fortsæt som i trin 6.1.1 til 6.1.7 for FACS-analyse.
- Udarbejdelse af GSC Samples for konfokal billedbehandling
Bemærk: Hvis overførslen af MSC mitokondrier til GSCS skal analyseres ved hjælp af fluorescens billeddannelse begge MSC'er og GSCS skulle mærkes på forhånd, henholdsvis med mitokondrier (trin 1) og celle (trin 2) vitale farvestoffer.- Forbered GSCS som i trin 6.1.1 til 6.1.5.
- Resuspender GSCS i 2 ml GSC proliferation medium indeholdende 2% FBS og frø i 35 mm dyrkningsskåle (glasbund).
- Udfør konfokal billedbehandling på GSCS med de overførte fluorescerende MSC mitokondrier 24 timer senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De proceduremæssige skridt skitserer isolering af mitokondrier fra mesenkymale stamceller (MSC) og deres overførsel til de målrettede glioblastom stamceller (GSC) ved MitoCeption er vist i figur 1. GSCS er cancer stamceller dyrkes som neurosfærer at bevare deres stamcelle egenskaber. For protokollen, er GSCS seedet som enkelte celler et par timer før overførsel af mitokondrier (trin 3) for at tillade højere mitokondrier transfer effektivitet (se FACS data figur 3B). Efter § 5 (dag 3), er disse celler observeres igen som danner neurosfærer (figur 1).
Billeddannelse af GB4 GSCS, 72 timer efter MitoCeption med fluorescens-mærket MSC mitokondrier, viser, at MSC mitokondrier er lokaliseret inde i GB4 GSCS, hvilket fremgår af de ortogonale opnået fra konfokale billeder (figur 2B). De overførte MSC mitokondrier synes lokaliseret i hele GSCS, da dette også er tilfældet for de endogene GSR mitochondrier (figur 2A). Konfokal afbildning af MitoCepted GSCS blev også udført med MSC mitochondrier prelabeled med en dyb rød vitalfarvestof således at de samme GSR prøver blev analyseret både ved FACS (se figur 3A) og billedbehandling (figur 2C). Overførslen af MSC mitokondrier kunne observeres for de fleste GSCS (panel a) og 3D-rekonstruktion fra GSR konfokale billeder bekræftede den intracellulære lokalisering af den overførte MSC mitokondrier (panel b, c). Prelabeling GSCS (på dag 1) med både blå cellulære og røde mitokondrie vitale farvestoffer tilladt visualisere lokaliseringen af den overførte MSC mitokondrier (farvet i grønt) i forhold til den endogene GSC mitokondrier (i rødt) efter MSC mitokondrier overførsel (figur 2D) .
Mens confocal billeddannelse er muligt for den intracellulære lokalisering af den overførte MSC mitochondrier efter MitoCeption, fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) er det foretrukne værktøj til at kvantificere mitokondrier overførsel, forudsat MSC mitokondrier blev prelabeled med en vital farvestof. Som vist i figur 3A, MitoCeption med stigende mængder af fluorescerende MSC mitokondrier ført til øget FACS signaler. Bemærkelsesværdige, dette signal (i rødt) var flere størrelsesordener højere end signalet opnået i kontrol- forhold (i blåt, se trin 6.2). Denne yderligere dokumenteres, at FACS-signalet er repræsentativ for MSC mitokondrier overføres inden GSCS og ikke kun resultatet af den fluorescerende vitale farvestof lækage fra mærket MSC mitokondrier. Mitokondrierne transfer protocol præsenteret her, udført på enkeltcelle-GSCS, viste en dosisafhængig respons (figur 3B). Effektiviteten af MSC mitokondrier overførsel blev også evalueret på NEURospheres. Selv om dette førte også til MSC mitokondrier overførsel til GSCS, effektiviteten af overførsel var lavere, som vist i et repræsentativt eksperiment (figur 3B).
Overførslen af MSC mitokondrier og deres vedligeholdelse inde i GSCS kan følges ved at kvantificere MSC mitokondrie-DNA (mtDNA) i GSCS. Dette kræver MSC og GSCS der skal indhentes fra forskellige donorer, med tydelige haplotyper. Figur 3C viser mtDNA sekvenser, som findes inden for D-sløjfe af to donorer med single nucleotide (SNP'er) angivet ved 3'-enden position. Til konstruktion af PCR-primere, der specifikt amplificerer mtDNA fra enten donor 1 eller donor 2 blev en yderligere mutation blev indført ved position n-2 i forhold til 3'-enden af PCR-primerne. MtDNA fra donor 1 kunne amplificeres med det sæt af primere: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'og 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (universal sequencing primer 38), mens sættet af primere: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(universal sekventeringsprimer fra 38) og 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' blev anvendt til at amplificere mtDNA fra donor 2.
Figur 1: Workflow for overførsel af isolerede MSC mitokondrier til GSCS af MitoCeption. vises De 7 trin til MitoCeption af MSC mitokondrier til GSCS og de efterfølgende GSR analyser. STEP-numre er angivet som i protokollen sektion. Hvis MSC og GSC mærkning ikke udføres, som for funktionelle analyser, trin 1 og 2 kan udelades, og protokollen kan følges fra dag 2 på. Fasekontrast billeder repræsenterer GB4 GSCS som neurosfærer (dag 1), som encellede kultur klar til MSC mitokondrier overførsel (dag 2), og 24 timer efter mitokondrierne overførsel (dag 3). Scale bar =100 um. I trin 4, repræsentativt mikrofotografi af isolerede MSC mitokondrier, prelabeled med MitoTracker Red CMXRos før isolation fra MSC. Scale bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Scanning af GB4 endogene mitokondrier og MSC mitokondrier efter overførsel til de GB4 GSCS af MitoCeption. (A, B, C) GB4 GSCS blev mærket med en grøn vitalfarvestof. (B, C, D) GB4 GSCS blev MitoCepted med 2,5 ug MSC mitokondrier forberedelse (for 10 5 GSCS). (A) GSCS blev mærket med MitoTracker Red CMXRos og dyrket i 48 timer (GSC proliferation medium w / o EGF / bFGF).(B) GSR konfokal sektion og ortogonale, 72 timer efter MitoCeption med MitoTracker Red CMXRos-mærket MSC mitochondrier (dyrkningsmedium: GSC proliferation medium / FBS 2%). (C, D) MSC'er prelabeled med en dyb rød mitokondrier vital farvestof (samme betingelser som for FACS-analyse), inden overdragelsen af MSC mitokondrier til GSCS. Efter MSC mitokondrier overførsel blev GSCS podet i GSC proliferation medium indeholdende FBS 10%. (C) Isosurface synspunkter (b, c) med xy-planet afsnit (c) af en GSC 3D rekonstruktion fra konfokale billeder (48 timer efter MitoCeption). (D) GB4 GSCS blev mærket med en blå celle vital farvestof og en rød mitokondrier vitalfarvestof før overdragelsen af MSC mitokondrier prelabeled med en dyb rød mitokondrier vitalfarvestof (afbildet i grøn). Isosurface synspunkter med xz (b) og xy (c) plane sektioner af en GSC 3D rekonstruktion fra konfokale billeder (72 timer efter MSC mitokondrier transfer). Alle celler were podet på petriskåle med glasbund og billeder blev taget på levende celler. Scale barer = 5 um, med undtagelse af billedet C panel (a), hvor Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af mitokondrierne overdragelse ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og detektion af MSC mitokondrie-DNA (mtDNA) i GSCS. (A, B) GSCS blev MitoCepted med MSC mitokondrier prelabeled med en dyb rød mitokondrier vitalfarvestof og analyseret ved FACS. (A) Repræsentative FACS resultater opnået med MitoCepted GSCS (i rødt, fra top til bund: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 ug MSC mitokondrier forberedelse (for 10 5 GSCS)). I blå, for EACh panel, kontrol FACS profil GSCS inkuberet med dyrkningsmediet konditioneret med den samme mængde MSC mitokondrier som anvendes til MitoCeption (se trin 5.4). Kontrol betingelser med umærkede GSCS i sort (øverst). (B) Relativ gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) opnået efter mitokondrier overførsel på enkelt celle GSCS (- •) (gennemsnit af 3 forsøg, med SEM), på en-dags GSC neurosfærer (- o) og med kontrol mitokondrier supernatanter på GSC enkeltceller (-). (C) DNA-sekvenser i mtDNA D-loop og SNP forskelle mellem donorer 1 og 2. SNP'er er angivet i blå i 3'-enden af sekvenserne. Design af primere til specifik PCR amplifikation af mtDNA fra enten donor (primere spe 1 og 2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et stigende antal undersøgelser viser, at cellerne kan udveksle mitokondrier, og at disse mitokondrier har dybtgående virkninger på målcellens stofskifte og funktioner. Derfor er det vigtigt at beherske de værktøjer, der kan hældes mitokondrier fra donorcellerne til disse målceller for at muliggøre en nøjagtig undersøgelse af deres biologiske virkninger.
Protokollen beskrevet her var oprindeligt arbejdede til overføre mitokondrier isoleret fra humane mesenkymale stamceller til det klæbende cancercellelinie MDA-MB-231 33. Som vist her, kan den tilpasses til cancer stamceller, der vokser som neurosfærer in vitro. Selv mitokondrierne overførslen sker, når MSC mitokondrier føjes til GSR neurosfærer, blev det konstateret, at være mere effektive på enkelt celle GSCS, som beskrevet i denne protokol. Denne protokol kan også ekstrapoleres til andre ikke-adhærente celler, ligesom T-celler, med behovet for at enDAPT den podede cellekoncentration for MitoCeption trin.
Fremstillingen mitokondrier bør udføres på is for at bevare deres integritet. For at opnå mitokondrier præparater med reduceret forurening fra andre cytosol forbindelser, er centrifugering til genopretning af mitokondrier udføres ved 3.000 xg i 15 min. For at overvåge mængden af MSC mitokondrier anvendes til overførsel til GSCS er mitokondrierne proteinindhold bestemmes. Til dette formål er mitochondrier proteinekstrakter fremstillet under anvendelse RIPA puffer suppleret med proteaseinhibitorer. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af bicinchoninsyre assayet ifølge producentens anvisninger. Bovint serumalbumin blev anvendt som standard. I gennemsnit blev opnået 10 ug af proteiner fra 100.000 MSC'er.
Mærkning MSC mitokondrier med en vitalfarvestof tillader kvantificering af effektiviteten af mitokondrier overførsel, ved fluorescens-aktiveret celle(FACS), og bestemme lokaliseringen af de overførte mitokondrier ved konfokal billeddannelse. De GSCS kan mærkes med det samme mitokondrier vitalfarvestof som MSC'er. Disse celler vil blive anvendt som en positiv kontrol for FACS-analyse. Alternativt kan GSCS mærkes med en mitokondrier vitalfarvestof forskellig fra den af MSC'erne, hvilket tillader lokaliseringen af de overførte MSC mitokondrier i forhold til de endogene GSR mitokondrier. Den dybrøde mitokondrier vitalfarvestof er velegnet til FACS-analyse, mens de grønne og røde mitochondria farvestoffer foretrækkes til konfokal billeddannelse. Af stor betydning, bør MSC eksponering for EDTA undgås på alle trin i protokollen. Derfor celle trypsinisering anbefales med trypsin og EDTA; cocktail af proteaseinhibitorer anvendes til mitokondrier præparat bør såvel være uden EDTA. I nærvær af EDTA, blev der observeret en lækage af mitokondrierne vitale farvestof fra MSC mitokondrier. Hvis mitokondrier transfer til GSCS skal analyseres ved mikroskopi, bør de modtagende glioblastomaceller også mærkes med en vital farvestof. De grønne og blå celle farvestoffer (se Materialer og reagenser Table) blev foretrukket, da de giver en mere homogen cellemærkning, muliggør 3D rekonstruktion fra konfokale billeder.
Når protokollen er blevet godkendt af brugeren med sine specifikke celler, vil mitokondrier mærkning blive udeladt for funktionelle undersøgelser, at udelukke eventuelle biologiske bias. Dosis-respons-analyser over et bredt område af MSC mitochondrier koncentrationer, med serielle fortyndinger af mitokondrier præparat, er tilrådeligt. Faktisk bør det bemærkes, at biologiske virkninger for de overførte mitokondrier kunne opnås for lave koncentrationer mitochondrier i det nedre område for påvisning ved FACS eller billeddannelse. Disse funktionelle undersøgelser, herunder undersøgelser på GSC stofskifte, spredning og respons på terapi, udføres dagen eftermitokondrier overførsel.
Hvis MSC og GSCS er isoleret fra forskellige donorer (med forskellige mtDNA haplotyper), kan de overførte MSC mitokondrier overvåges ved at måle koncentrationerne af MSC mtDNA i de målrettede GSCS. Den diskrimination mellem MSC og endogene GSC mtDNAs er baseret på tilstedeværelsen af SNP'er, som er specifikt for hver celletype, i mtDNA hypervariable D-loop-region. Derfor mellem de forskellige anvendelser af den MitoCeption teknik, muligheden for at overføre mitokondrier huser mitokondrie-DNA med forskellige haplotyper ikke kun tillader detektering af de overførte mitokondrier, men også giver værktøjer til at studere biologi mtDNA vedligeholdelse, herunder en analyse af haplotype udstødelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), som CJ og ML.V. er tilknyttet, har indgivet en patentansøgning på MitoCeption teknik (EP14306154.7).
Acknowledgments
Vi takker Andrea Parmeggiani (L2C og DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) samt medlemmer af laboratoriet for nyttige diskussioner, Christophe Duperray efter hjælp til FACS-analyse, at Montpellier RIO imaging facilitet (MRI) for at give tilstrækkelig miljø for FACS og konfokal mikroskopi. BNM blev understøttet af en kandidat fællesskab fra LABEX Numev (konvention ANR-10-LabX-20). AB blev støttet af en bachelor stipendium fra universitetet i Warszawa og Den Europæiske Union (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV er et personale forsker fra National Center for videnskabelig forskning (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Chandel, N. S.
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
