Summary
כאן, פרוטוקול (MitoCeption) מוצג להעביר המיטוכונדריה, מבודדת מתאי גזע mesenchymal אדם (MSC), לתאי גזע גליובלסטומה (GSC), במטרה ללמוד ההשפעות הביולוגיות שלהם על מטבוליזם ופונקציות GSC. פרוטוקול דומה ניתן להתאים להעביר המיטוכונדריה בין סוגי תאים אחרים.
Abstract
המיטוכונדריה לשחק תפקיד מרכזי בחילוף החומרים בתא, ייצור אנרגיה ובקרה של אפופטוזיס. במיטוכונדריה הלקויה כבר נמצאה אחראי מחל מגוונות מאוד, החל פתולוגיות נוירולוגיות לסרטן. מעניין לציין, כי המיטוכונדריה הוכחה לאחרונה כדי להציג את היכולת שיועבר בין סוגי תאים, בעיקר מתאי גזע mesenchymal אדם (MSC) לתאים סרטניים בתנאי coculture, עם השלכות מטבוליות פונקציונליות תאי הנמען המיטוכונדריה, עוד שיפור הריבית הנוכחית עבור התכונות הביולוגיות של אברונים אלה.
הערכת ההשפעות של המיטוכונדריה הועבר MSC בתאי המטרה היא בעלת חשיבות מרכזית להבנת התוצאה הביולוגית של אינטראקציות תאים תאים כאלה. פרוטוקול MitoCeption המתואר כאן מאפשר העברת המיטוכונדריה מבודד מראש מתאי התורם לתאי היעד, באמצעות המיטוכונדריה MSCותאי גזע גליובלסטומה (GSC) כמערכת מודל. פרוטוקול זה נעשה שימוש בעבר להעביר המיטוכונדריה, מבודד MSCs, כדי חסיד תאים סרטניים מד"א- MB-231. פרוטוקול העברת המיטוכונדריה זה מותאם כאן GSCs המציג את הייחוד הספציפי של גדל כמו neurospheres במבחנה. העברת המיטוכונדריה המבודד ניתן ואחריו תא קרינת מיון מופעל (FACS) והדמית confocal באמצעות המיטוכונדריה צבעים חיוניים. השימוש בתאי תורם היעד המיטוכונדריה עם haplotypes הברור (SNPs) גם מאפשר זיהוי של המיטוכונדריה הועבר מבוסס על הריכוז של הדנ"א המיטוכונדרי חדרם (mtDNA) בתאי המטרה. לאחר הפרוטוקול יאומת עם קריטריונים אלה, התאים מחסת המיטוכונדריה הועברה ניתן לבצע עיבוד נוסף כדי לקבוע את ההשפעות של המיטוכונדריה אקסוגניים על תכונות ביולוגיות כגון חילוף חומרים בתא, פלסטיות, שגשוג ואת תגובה לטיפול.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים המצוי בתאי איקריוטיים שבו הם משחקים תפקיד מרכזי ספיגת חומרים מזינים כמו גם בייצור אנרגיה המטבוליט. אברונים אלה מכילים DNA המיטוכונדרי עגול (mtDNA), ארוך 16.6 kb, המקודד חלבונים של מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים, tRNAs ו rRNAs 1. הפונקציונליות של אברונים אלה חיונית הומאוסטזיס תא וכמה פתולוגיות קושרו עם המיטוכונדריה בתפקוד 1, 2, 3. מעמדו המיטוכונדריה יש למשל נקשר דלקת, מחלות זיהומיות וסרטן, במקרה זה האחרון שיש לו השלכות על גרורות והתנגדות לטיפול 4, 5, 6, 7.
המיטוכונדריה להציג את היכולת המדהימה של מקבל מועברים בין "תורם" ותאיים "יעד". זה מוביל לשינויים במטבוליזם האנרגטי של תאי היעד, כמו גם שינויים פונקציונליים אחרים כגון ריפוי רקמות ועמיד בפני תרופות כימותרפיות, כפי שמוצג לאחרונה על ידי מעבדות שונות 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. תאי הגזע mesenchymal האדם (MSCs) להציג את היכולת הזו כדי להעביר המיטוכונדריה למגוון רחב של תאים היעד, כולל שריר הלב, תאי אנדותל, תאי אפיתל המכתשית ריאתי, תאים צינורי כליות ותאי סרטן, מה שמוביל שינויים של תכונות פעילות של תאים אלה 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
המיטוכונדריה החליפין כעת נראה כמנגנון בשימוש נרחב המאפשר מספר תאים מסוגים שונים כדי לתקשר אחד עם השני ולשנות התכונות הביולוגיות שלהם. חילופי המיטוכונדריה זה יכול להתרחש דרך צינורות מנהור היווצרות (TNT), מעורבים צמתים הפער המכילים 43 connexin 8 או M-Sec / TNFaip2 ואת exocyst 19 מורכבים. לחילופין, העברת המיטוכונדריה הוצגה גם בתיווכה arrestin המכילים תחום חלבון microvesicles 1 בתיווך (ARMMs) 20. מעניין, את היעילות של העברת המיטוכונדריה היה צמוד לשער ביטוי של 1 GTPase Rho MIRO1 21, גורם מפתח להסברת ההבדלים efficacies העברת המיטוכונדריה בין iPSC-MSCs ומבוגר BM-MSCs 22.
למרות העושר הזה של נתונים בדבר תא אל תא חליפין המיטוכונדריה, מעט יחסית ידוע על מטבוליות התוצאה ביולוגית של העברת המיטוכונדריה זה. לכן, זה לגמרי מצדיק הקים את הכלים המתאימים על מנת להעריך את ההשפעות הביולוגיות מלא מההעברה. במהלך השנים, גישות טכנולוגיות כמה להעביר המיטוכונדריה מתורם תאי acceptor הוצע. זה כולל הזרקה ישירה של המיטוכונדריה לתוך ביציות 23, 24, 25, איחוי תאים כדי ליצור cybrids transmitochondrial 26, 27 ולאחרונה, העברת המיטוכונדריה מבודד באמצעות photothermal nanoblades 28.
אנחנו ואחרים בעבר הדגימו את היכולת של mitochond המבודדריה להפנים תאים חיים, כפי שנצפה הן במבחנה in vivo 29, 30, 31, דרך המנגנונים המוצעים לערב macropinocytosis 32. בנוסף, אנו פתחנו שיטה, בשם MitoCeption, להעביר כמותית המיטוכונדריה מבודד (מ MSCs) כדי למקד תאים, כפי שהודגמו עם (החסיד) מד"א- MB-231 תאי סרטן שד קו 31. פרוטוקול זה הותאם כאן להעברת המיטוכונדריה MSC אדם המבודדת תאי גזע גליובלסטומה (GSCs).
גליובלסטומה הן גידולים ממאירים אגרסיביים של המוח במהירות לפתח עמידות לטיפול, בעיקר בשל תאי גזע גליובלסטומה (GSC) נוכחים בתוך הגידול 33. GSCs אלה גדלים כמו neurospheres במבחנה וליצור גידולים במודלים xenograft. יש תאים סרטניים בתוך גליובלסטומהיכולת לעשות תא אל תא קשרים, כפי שמוצג לאחרונה עבור תאים סרטניים במוח astrocytic כי קישוריות באמצעות microtubes המורחבת, שדרכו המיטוכונדריה (וכן גרעיני סידן תא) יכולה להעביר, וכתוצאה מכך רשתות אסטרוציטומה עמידות הקרנות 34. גליובלסטומה יכול לגייס תאים שונים בתוך microenvironment הגידול, כולל MSCs 35, 36. הראינו כי MSCs יכול ליצור קשרים תאים תאים עם GSCs ב coculture ולהעביר המיטוכונדריה שלהם (מידע לא מוצג), אשר צפויה לשנות תכונות פעילות GSC. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד הטכניקה MitoCeption ניתן להשתמש כדי להעביר המיטוכונדריה, לפני כן מבודד MSCs האדם, כדי GSCs אדם עם לצורך קביעת התוצאה ביולוגי הפעילות שלהן. מולטיפוטנטיים ומאוד tumorigenic קו Gb4 GSC 37 נעשה שימוש במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
יום 1
1. תיוג של תא גזע mesenchymal (MSC) המיטוכונדריה (אופציונלי)
- יומיים לפני ההכנה המיטוכונדריה, זרע MSCs האדם בצלחת תרבות 100 מ"מ, 10 מ"ל αMEM / FBS 10%, כדי שיהיה 4 x 10 5 MSCs בתרבות ביום 1.
- לשטוף MSCs עם PBS (4 מ"ל) ולהוסיף 4 מ"ל αMEM / FBS 1% (prewarmed עד 37 ° C).
- להוסיף את הכמות הנדרשת של צבע המיטוכונדריה חיוני דגירת תאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס החממה.
- הסר את הפתרון לצבוע המיטוכונדריה, לשטוף תאים פעמיים עם 4 מ"ל prewarmed (37 ° C) αMEM / FBS 1% ולהוסיף בחזרה 4 מ"ל αMEM / FBS 10%. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס.
- שנה את המדיום תרבות (10 מ"ל αMEM / FBS 10%) לאחר 30 דקות, זמן אחר, 2 שעות מאוחר יותר.
יום 1
2. תיוג של תאי גזע Glioblastoma (GSC) (אופציונלי, ראה סעיף דיון)
| תרבית תאים בינוני | הרכב |
| בינוני הבזליים GSC | DMEM / F-12 השלימו עם |
| אינסולין 20 מ"ג / מ"ל | |
| 1x תוסף N2 | |
| גלוקוז 3 גר '/ ל | |
| L- גלוטמין 2 מ"מ | |
| בינוני התפשטות GSC | הוסף מדיום הבסיס: |
| 1x תוסף B27 | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 מ"ג / מ"ל | |
| Fungizone 0.25 מ"ג / מ"ל | |
| הפרין 2 מ"ג / מ"ל | |
| ציפרופלוקסאצין 2 מיקרוגרם / מ"ל | |
| גנטמיצין 2 מיקרוגרם / מ"ל | |
| בינוני התפשטות MSC | & #945; MEM השלים עם |
| L- גלוטמין 2 מ"מ | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
טבלה 1: תרבות מדיה.
- לנתק GSCs (שורת תאים Gb4 32 (10 x 10 6 תאים) גדל כמו neurospheres על צלוחיות תרבית תאים מצופים פולי-המה (ראה צעדים 3.1 כדי 3.12).
- GSCs זרע בצלחת 48-גם ב 10 5 תאים / גם במדיום התפשטות GSC (500 μl) (ראו טבלה 1).
- צנטריפוגה את הצלחת ב 270 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- להוסיף את הכמות הנדרשת של חיוני לצבוע תא דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 500 μl של מדיום הבסיס GSC (טבלה 1) לכל טוב של צלחת 48-היטב.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 270 XG ב 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
- חזור על שלבים 2.5 כדי 2.6.
- הוסף 500 μl של מדיום בסיס GSC לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 270 XG ב 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב supernatant.
- הוסף 500 μl של מדיום הפצת GSC לכל טוב של צלחת 48-היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה.
הערה: כמות GSCs מצוינת (10 x 10 6 תאים) מאפשר ביצוע ניסויי מנה-התגובה השונה ובקרות FACS. ברגע תנאי הניסוי הם לייתר דיוק מוגדר סכום זה יכול להיות scaled למטה.
יום 2
3. מתזמן של תאי גזע Glioblastoma
- אסוף את neurospheres GSC (10 x 10 6 תאים) על ידי צנטריפוגה ב 270 XG במשך 5 דקות, בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בתוך שפופרת 50 מ"ל.
- שטפו תאים עם 5 מ"ל של HBSS, צנטריפוגות ב 270 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- לשאוב supernatant.
- בעדינות resuspend גלולה GSC ב 100 טריפסין-EDTA μl (0.25%) (מחיר 10 x 10
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- הוסף 10 μl 2 CaCl (20 מ"מ) ו -2 μl DNase אני (10 מ"ג / מ"ל).
- לנתק את neurospheres ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (30-50x) עם טפטפת P200. הימנע בועות. בדוק תחת מיקרוסקופ שכל GSCs הם ניתק.
- הוסף 10 μl מעכב טריפסין (5%) ו -10 מ"ל HBSS.
- צנטריפוגה GSCs ב 270 XG במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant ולהוסיף 10 מ"ל בינוני הבזליים GSC (טבלה 1).
- רוזן GSCs עם תא ספירת תומה ואז צנטריפוגות התאים ב 270 XG במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- להוסיף נפח מתאים של המדיום התפשטות GSC (טבלה 1) כדי להגיע ריכוז הסלולר של 10 6 GSCs / מ"ל.
- GSCs Seed 10 5 (100 μl של השעיה התא) לכל גם צלחת 96-היטב.
- צנטריפוגה הצלחות ב 270 XG במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס כדי לקבל GSCs על בוטטום של בארות.
- דגירת צלחת 96-היטב על 37 מעלות צלזיוס עד סעיף 5.
יום 2
4. בידוד המיטוכונדריה MSC
- כוונו את הטמפרטורה צנטריפוגות microtube עד 4 מעלות צלזיוס.
- כן שני צינורות 1.5 מיליליטר "A" ו- "C" המכיל חומרים כימיים עבור החילוץ המיטוכונדריה (ריאגנט 200 μl ו 400 μl מגיב C, הן המכילים מעכבי פרוטאז חינם-EDTA). כן 2 צינורות אחרים, שכותרתו "MSC" ו "מיטו". שמור את כל הצינורות על קרח. כמו כן להכין צינורות עבור דילולים סדרתי המיטוכונדריה.
- לשטוף MSCs עם 10 מ"ל prewarmed (37 ° C) PBS.
- לשטוף MSCs עם 2 מ"ל טריפסין (לא EDTA) במשך 10 שניות ולהוסיף 1 מ"ל טריפסין (לא EDTA). דגירת תאים עבור 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשחזר את MSCs על ידי הוספת 10 מ"ל αMEM / FBS 10%, והעברת צינור 50 מ"ל.
- תאי צנטריפוגה ב 270 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant ולהוסיף10 מיליליטר αMEM / FBS 10% על גלולת התא.
- ספירת MSCs עם תא ספירת Malassez.
- צנטריפוגה MSCs (4-5 x 10 5) עמ '270 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant, להוסיף 1 מ 'קר כקרח αMEM / FBS 10% על גלולה התא ולהעביר את התאים אל הצינור "MSC" -labeled (מוכן בשלב 4.2). שמור את הצינור על הקרח.
- צנטריפוגה הצינור המכיל את MSCs ב 900 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
- הסר את כל בינוני שיורית מהצינור.
- הוסף 200 μl של בידוד המיטוכונדריה מגיב A (המכיל מעכבי פרוטאז חינם-EDTA). וורטקס במהירות בינונית במשך שניות 5 ולהשאיר צינורות על קרח דק 2 בדיוק.
- להוסיף 2.5 μl של בידוד המיטוכונדריה מגיב ב וורטקס במהירות מרבית למשך 10 שניות, ולאחר מכן לעזוב צינורות על קרח. חזור על כל 30 שניות למשך 5 דקות.
- הוסף 200 μl של בידוד המיטוכונדריה מגיב C (המכיל מעכבי פרוטאז חינם-EDTA). מערבבים על ידי הטיית הצינור (roughly 30 פעמים, לא מערבולת). צנטריפוגה התחתית XG 700 במשך 10 דקות ב 4 °.
- מעבירים את supernatant (המכיל את המיטוכונדריה MSC) אל הצינור "מיטו" (שהוכן בשלב 4.2).
- צנטריפוגה ב 3000 XG, 15 דקות ב 4 ° C, כדי לקבל גלולת המיטוכונדריה. בטל supernatant. הגלולה המכילה את המיטוכונדריה המבודד.
- יש לשטוף את גלולת המיטוכונדריה עם 200 μl של המגיב C. לאחר מכן, צנטריפוגה XG ב 12,000, 5 דקות ב 4 ° C, כדי לקבל גלולת המיטוכונדריה.
5. העברה של המיטוכונדריה MSC המבודדת GSCs (MitoCeption)
- הוסף 200 μl של מדיום ההתפשטות מראש מקורר (0 ° C) GSC על גלולת המיטוכונדריה המבודדת MSCs (4 x 10 5).
- לדלל את הכנת המיטוכונדריה (במדיום התפשטות GSC) להוסיף בעקביות 20 μl של ההשעיה המיטוכונדריה אל GSCs.
- מוסיף את הנפח של המיטוכונדריה מבודד לתוך הבארות של 96-well צלחת המכילה את GSCs (משלב 3.15), בריכוז הרצוי (0.1 כדי 10 מיקרוגרם). מוסיפים את המיטוכונדריה לאט, קרוב לתחתית הבאר, המכסה את כל פני השטח לפחות פעם אחת.
- לשליטת דליפה חיונית לצבוע המיטוכונדריה MSC, להוסיף אותן הכמויות של הכנת המיטוכונדריה (0.1 עד 10 מיקרוגרם) כדי בארות של צלחת 96-היטב המכילה בינוני התפשטות GSC בלבד (ללא GSCs) (ראה חלק 6.2 לגילוי דליפה חיוני לצבוע).
- צנטריפוגה את הצלחת 96-היטב המכילה את GSCs הנמען המיטוכונדריה עם המיטוכונדריה MSC (שלב 5.3) ואת הצלחת המלאה (שלב 5.4) ב 1500 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- מניחים את הצלחות התרבות בחממה C תא 37 ° מיד לאחר צנטריפוגה.
הערה: פרוטוקול העברת המיטוכונדריה מסתמך על צנטריפוגה של ההשעיה המיטוכונדריה על התאים בתרבית לעבר כוח צנטריפוגה הנאות, עם מספר centrifugations כי יכול להיות מותאם תלוי system של תאי תורם / נמען המיטוכונדריה.
יום 3
6. ניתוח של העברת המיטוכונדריה ידי FACS והדמיה Confocal
- הכנת דגימות GSC לניתוח FACS
הערה: אם המיטוכונדריה MSC תויגו עם חיוני לצבוע מראש (סעיף 1), ניתן לנטר את היעילות על ידי FACS, 24 שעות לאחר העברת המיטוכונדריה.- צנטריפוגה את הצלחת 96-היטב עם GSCs MitoCepted ב 270 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant.
- הוספת 100 טריפסין μl (לא EDTA) בכל טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. Pipet מעלה ומטה כדי לנתק את neurospheres נוצר ב -24 שעות זמן.
- הוספת 100 μl של מדיום בסיס GSC.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 270 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו להתעלמות supernatant.
- Resuspend GSCs ב 300 בינוני הבזליים μl GSC והעברת FACS מותאמים צינורות.
- בצעו את FACSalysis.
- בקרה לדליפת המיטוכונדריה חיוני לצבוע מהמיטוכונדריה המבודד (FACS)
הערה: מטרת שלב זה היא לקבוע את אות רקע FACS שלא משתקפת העברת MSC המיטוכונדריה אמיתית, אלא זליגת העצם חיוני לצבוע מהמיטוכונדריה MSC שכותרתו המשמש MitoCeption (שלב 5.3).- זרעים תאים GSC כמתואר בשלבים 3.1 כדי 3.15.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- צנטריפוגה את הצלחת 96-היטב המכיל מיטוכונדריה בלבד (מ- בשלב 5.4 כדי 5.6) ב 1500 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
- לשאוב את המדיום תרבות מהצלחת 96-היטב GSC (שלב 6.2.2) ולהחליף אותו על ידי המדיום מודגרות עם המיטוכונדריה בלבד (supernatant משלב 6.2.3).
- דגירת צלחת 96-היטב המכילה את GSCs ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- פעל באופן בצעדים 6.1.1 כדי 6.1.7 לניתוח FACS.
- הכנת samp GSCles הדמיה confocal
הערה: אם העברת המיטוכונדריה MSC כדי GSCs היא להיות מנותח על ידי דימות פלואורסצנטי, הן MSCs ו GSCs צריך להיות מתויג מראש, בהתאמה עם המיטוכונדריה (שלב 1) ותא (שלב 2) צבעים חיוניים.- כן GSCs כמו צעדים 6.1.1 ל 6.1.5.
- Resuspend GSCs ב 2 מ"ל בינוני התפשטות GSC המכיל 2% FBS וזרעי במנות תרבות 35 מ"מ (תחתית זכוכית).
- בצע הדמיה confocal על GSCs עם המיטוכונדריה MSC פלורסנט העבירה 24 שעות מאוחר יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השלבים פרוצדורליים אשר מתווים את הבידוד של המיטוכונדריה מתאי גזע mesenchymal (MSC) והעברנו את תאי גזע גליובלסטומה הממוקדים (GSC) על ידי MitoCeption מוצגים באיור 1. GSCs הם תאי גזע סרטניים גדלו כמו neurospheres לשמר נכסי תאי גזע שלהם. בשביל הפרוטוקול, GSCs הם זורעים כמו תאים בודדים כמה שעות לפני העברת המיטוכונדריה (שלב 3) כדי לאפשר יעילות העברת המיטוכונדריה גבוהות יותר (ראה איור 3B נתוני FACS). בעקבות סעיף 5 (יום 3), תאים אלה הם נצפו שוב כמקימי neurospheres (איור 1).
הדמיה של Gb4 GSCs, 72 שעות לאחר MitoCeption עם המיטוכונדריה fluorescently שכותרתו MSC, מראה כי המיטוכונדריה MSC הן נקודות בתוך Gb4 GSCs, כפי שהוכחה על ידי התצוגות המאונכות המתקבלות תמונות confocal (איור 2 ב). המיטוכונדריה MSC שהועברה מופיעה מקומית ברחבי GSCs, כמו זה גם המקרה של המיטוכונדריה GSC אנדוגני (איור 2 א). הדמיה Confocal של MitoCepted GSCs בוצע גם עם המיטוכונדריה MSC prelabeled עם חיוני לצבוע אדום עמוק, כך דגימות אותו GSC נותחו הן על ידי FACS (ראה איור 3 א) והדמיה (איור 2 ג). העברת המיטוכונדריה MSC יכולה להיבחן עבור רוב GSCs (לוח א ') ושחזור 3D מתמונות confocal GSC אשר את הלוקליזציה התאית של המיטוכונדריה MSC העבירה (ב לוחות, ג). Prelabeling GSCs (ביום 1) עם שני צבעים חיוניים כחול הסלולר ואדום המיטוכונדריה מותר לדמיין את לוקליזציה של המיטוכונדריה MSC העבירה (בצבע ירוק) ביחס המיטוכונדריה GSC אנדוגני (באדום), בעקבות העברת המיטוכונדריה MSC (איור 2 ד) .
בעוד confoהדמית cal מאפשרת את בדיקת הלוקליזציה התאית של המיטוכונדריה MSC העבירה הבאה MitoCeption, תא מופעל קרינת מיון (FACS) היא הכלי מועדף לכמת את העברת המיטוכונדריה, ובלבד המיטוכונדריה MSC היו prelabeled עם חיוני לצבוע. כפי שניתן לראות באיור 3 א, MitoCeption עם כמויות גדלות והולכות של המיטוכונדריה MSC ניאון הובילו אותות FACS מוגברות. ראוי לציון, האיתותים (באדום) היו בכמה סדרי גודל גבוה יותר מאשר האות המתקבל בתנאים המלאים (בכחול, ראה שלב 6.2). עוד נקבע זה ראיות כי האות FACS הוא נציג של המיטוכונדריה MSC העבירה בתוך GSCs ולא רק תוצאה של דליפה חיוני לצבוע פלורסנט מהמיטוכונדריה MSC שכותרתו. פרוטוקול העברת המיטוכונדריה שהוצג כאן, שבוצע על GSCs תא בודד, הראה תגובה תלויה-מינון (איור 3 ב). היעילות של העברת המיטוכונדריה MSC גם הוערכה על neurospheres. אמנם זה גם הוביל העברת המיטוכונדריה MSC אל GSCs, את היעילות של העברת נחלש, כפי שמוצג ניסוי נציג (איור 3 ב).
העברת המיטוכונדריה MSC ותחזוקה שלהם בתוך GSCs ניתן ואחריו לכימות DNA המיטוכונדרי MSC (mtDNA) ב GSCs. זה דורש MSCs ו GSCs שיופקו מתורמים שונים, עם haplotypes הברור. איור 3 ג תערוכות רצפי mtDNA נמצאים בתוך D-הלולאה של שני תורמים עם פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד (SNPs) הצביע במיקום הסוף '3. על העיצוב של פריימרים PCR, כדי להגביר mtDNA במיוחד משני התורם 1 או התורם 2, מוטציה נוספת הוצג במיקום n-2 ביחס לסוף '3 של פריימרים PCR. ב- mtDNA מתורם 1 יכול להיות מוגבר עם סט של צבעי יסוד: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 '5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3 "(סעיף אוניברסליequencing פריימר 38), בעוד קבוצה של פריימרים: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(פריימר רצף אוניברסלי מ -38) 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' שימש כדי להגביר את mtDNA מתורם 2.
איור 1: Workflow להעברת המיטוכונדריה MSC מבודד כדי GSCs ידי MitoCeption. 7 שלבים עבור MitoCeption של המיטוכונדריה MSC כדי GSCs והניתוחים GSC הבאים מוצגים. מספרי הצעד מסומנים כמו בקטע הפרוטוקול. אם MSC וסימון GSC הוא לא יבוצעו בפועל עבור ניתוחים תפקודיים, שלבי 1 ו -2 ניתן להשמיט והפרוטוקול ניתן בעקבות מיום 2 על. בניגוד שלב תמונות מייצגות GSCs Gb4 כמו neurospheres (יום 1), כתרבות unicellular מוכן להעברת המיטוכונדריה MSC (יום 2) ו -24 שעות לאחר העברת המיטוכונדריה (יום 3). סרגל קנה מידה =100 מיקרומטר. בשלב 4, photomicrograph נציג של המיטוכונדריה MSC מבודד, prelabeled עם MitoTracker האדום CMXRos לפני במנותק MSCs. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדמיה של המיטוכונדריה Gb4 אנדוגני של המיטוכונדריה MSC לאחר ההעברה GSCs Gb4 ידי MitoCeption. (A, B, C) Gb4 GSCs תויגו עם צבע חיוני ירוק. (B, C, D) Gb4 GSCs היה MitoCepted עם הכנת המיטוכונדריה 2.5 מיקרוגרם MSC (עבור 10 5 GSCs). (א) GSCs תויגו עם MitoTracker האדום CMXRos ותרבותי במשך 48 שעות (בינוני התפשטות GSC w / o EGF / bFGF).(ב) בסעיף confocal GSC ונוף מאונך, 72 שעות לאחר MitoCeption עם MitoTracker האדום CMXRos שכותרתו המיטוכונדריה MSC (בינוני תרבות: בינוני התפשטות GSC / 2% FBS). (C, D) MSCs היו prelabeled עם חיוני לצבוע המיטוכונדריה אדום עמוק (אותם תנאים כמו לניתוח FACS) לפני העברת המיטוכונדריה MSC כדי GSCs. לאחר העברת המיטוכונדריה MSC, GSCs היו זורעים במדיום התפשטות GSC המכיל 10% FBS. (C) נופים Isosurface (ב, ג) לסעיף במישור xy (ג) של שחזור 3D GSC מתמונות confocal (48 שעות לאחר MitoCeption). (ד) Gb4 GSCs תויג עם צבע כחול תא חיוני צבע אדום המיטוכונדריה חיוני לפני העברת המיטוכונדריה MSC prelabeled עם חיוני לצבוע המיטוכונדריה אדום עמוק (צלם בירוק). נופי Isosurface עם XZ (ב) ו- XY (ג) סעיפי מטוס של שחזור 3D GSC מתמונות confocal (72 שעות לאחר העברת המיטוכונדריה MSC). כל התאים were זורע על כלי תרבות עם תחתית זכוכית תמונות צולמו על תאי חיים. ברי סולם = 5 מיקרומטר, למעט לוח C תמונה (א) שבו סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: כימות העברת המיטוכונדריה ידי תא הקרינה מיון מופעל (FACS) וזיהוי של הדנ"א המיטוכונדרי MSC (mtDNA) ב GSCs. (A, B) GSCs היו MitoCepted עם המיטוכונדריה MSC prelabeled עם חיוני לצבוע המיטוכונדריה אדום עמוק ונותחו על ידי FACS. (א) FACS נציג התוצאות שהושגו עם MitoCepted GSCs (באדום, מלמעלה למטה: 0.6; 1.2; 2.5; 5; 10 מיקרוגרם הכנה המיטוכונדריה MSC (עבור 10 5 GSCs)). בכחול, עבור EACלוח שעות, לשלוט FACS פרופיל של GSCs מודגרות עם מדיום התרבות ממוזג עם אותה הכמות של המיטוכונדריה MSC כפי שמוצג עבור MitoCeption (ראה שלב 5.4). תנאי בקרה עם GSCs ללא תווית בשחור (למעלה). (ב) עוצמת הקרינה הממוצעת יחסית (MFI) המתקבל לאחר העברת המיטוכונדריה על GSCs תא בודד (- •) (ממוצע של 3 ניסויים, עם SEM), על neurospheres GSC של יום אחד (- o) ועם supernatants המיטוכונדריה שליטה על GSC תאים בודדים (-). (C) רצפי DNA בתוך mtDNA D-לולאה והפרשי SNP בין התורמים 1 ו -2 SNPs מסומנים בכחול בסוף '3 של רצפים. עיצוב של פריימרים עבור הגברת PCR ספציפית של mtDNA מתורם או (פריימרים spe 1 ו -2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר גדל והולך של מחקרים מראה כי תא יכול להחליף מיטוכונדריה כי המיטוכונדריה אלה יש השפעה עמוקה על חילוף החומרים בתא המטרה ופונקציות. לכן, זה הכרחי כדי להשתלט על הכלי להעביר המיטוכונדריה כמותית מתאי התורם לתאי היעד הבאים כדי לאפשר מחקר מדויק של ההשפעות הביולוגיות שלהם.
הפרוטוקול המתואר כאן היה הסתדר במקור להעביר המיטוכונדריה מבודד אדם בתאי גזע mesenchymal לקו תאים סרטניים חסיד מד"א- MB-231 33. כפי שניתן לראות כאן, זה יכול להיות מותאמים עבור תאי גזע סרטניים הגדלים כמו neurospheres במבחנה. למרות העברת המיטוכונדריה מתרחשת כאשר המיטוכונדריה MSC מתווספת neurospheres GSC, נמצא להיות יעיל יותר על GSCs תא בודד, כמתואר בפרוטוקול הנוכחי. פרוטוקול זה גם יכול להיות אקסטרפולציה שאינו חסידים תאים אחרים, כמו תאי T, עם הצורך עלdapt את ריכוז תאי הזרע עבור שלב MitoCeption.
הכנת המיטוכונדריה צריכה להתבצע על קרח כדי לשמור על שלמותם. כדי להשיג הכנות המיטוכונדריה עם זיהום מופחת תרכובות cytosol אחרות, צנטריפוגה להחלמתם של המיטוכונדריה מתבצעת 3,000 XG במשך 15 דקות. כדי לפקח על כמות המיטוכונדריה MSC המשמשת להעברה אל GSCs, תוכן המיטוכונדריה החלבון נקבע. לשם כך, תמציות חלבון המיטוכונדריה מוכנות באמצעות חיץ Ripa השלים עם מעכבי פרוטאז. ריכוז החלבון נקבע באמצעות assay חומצת bicinchoninic, על פי הוראות היצרן. אלבומין בסרום שור שימש כסטנדרט. בממוצע 10 מיקרוגרם של חלבונים התקבלו 100,000 MSCs.
המיטוכונדריה תיוג MSC עם צבע חיוני מאפשרת לכמת את היעילות של העברת המיטוכונדריה, על ידי תא מופעל קרינהמיון (FACS), וקביעת לוקליזציה של המיטוכונדריה הועבר על ידי הדמיה confocal. GSCs יכול להיות מתויג עם צבע חיוני באותה המיטוכונדריה כמו MSCs. תאים אלה ישמשו כביקורת חיובית לניתוח FACS. לחלופין, GSCs יכול להיות מתויג עם צבע המיטוכונדריה חיוניים שונה מזו של MSCs, המאפשר לוקליזציה של המיטוכונדריה MSC העבירה ביחס המיטוכונדריה GSC אנדוגני. צבע אדום עמוק המיטוכונדריה חיוניים הוא גם מתאים לניתוח FACS בעוד צבעים המיטוכונדריה ירוק ואדום עדיפים הדמיה confocal. חשיבות רבה, חשיפת MSC כדי EDTA יש להימנע בכל השלבים של הפרוטוקול. לכן, תא trypsinization מומלץ עם טריפסין ולא EDTA; הקוקטייל של מעכבי פרוטאז שלפיהם נערך המיטוכונדריה, צריך גם להיות נטול EDTA. בנוכחות EDTA, דליפה של צבע המיטוכונדריה החיוני מן המיטוכונדריה MSC נצפתה. אם המיטוכונדריה transfer כדי GSCs הוא להיות מנותח על ידי מיקרוסקופ, תאי גליובלסטומה הנמען צריכים להיות מסומנים גם עם צבע חיוני. צבעי התא הירוקים וכחול (ראה חומרים ריאגנטים טבלה) הועדפו כפי שהם נותנים תיוג תא הומוגנית יותר, מה שמאפשר שחזור 3D מתמונות confocal.
לאחר הפרוטוקול יאומת על ידי המשתמש עם התאים שלו ספציפית, תיוג המיטוכונדריה יישאר מחוץ ללימודים תפקודיים, כדי למנוע הטיות ביולוגיות אפשריות. מנה-תגובה מנתח פני טווח רחב של ריכוזים המיטוכונדריה MSC, עם דילולים סדרתי של הכנה המיטוכונדריה, מומלץ. למעשה, ראוי לציין כי השפעות ביולוגיות של המיטוכונדריה העבירה יכולות להיות מושגת על ריכוזי המיטוכונדריה נמוכים, בתחום הנמוך לגילוי על ידי FACS או הדמיה. מחקרים פונקציונליים אלה, כוללים חקירות על חילוף חומרים, התפשטות ותגובת GSC לטיפול, מתבצעים למחרתהעברת המיטוכונדריה.
אם MSCs ו GSCs מבודדים מתורמים שונים (עם haplotypes mtDNA השונה), המיטוכונדריה MSC העבירה יכולה להיות פיקוח על ידי מדידת ריכוזי mtDNA MSC ב GSCs הממוקד. האפליה בין MSC ו- אנדוגני GSC mtDNAs מבוססת על הנוכחות של SNPs, ספציפית לכל סוג תא, באזור D-לולאת hypervariable mtDNA. לכן, בין היישומים השונים של טכניקת MitoCeption, את האפשרות להעביר המיטוכונדריה מחסת הדנ"א המיטוכונדרי עם haplotypes השונה לא רק מאפשרת זיהוי של המיטוכונדריה העבירה אלא גם מספקת את הכלים כדי ללמוד את הביולוגיה של תחזוקת mtDNA, כוללת הניתוח של דרת haplotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la משוכלל ונדיר Medicale), שבה CJ ו ML.V. מזוהים, הגישה בקשה לרישום פטנט על הטכניקה MitoCeption (EP14306154.7).
Acknowledgments
אנו מודים אנדריאה Parmeggiani (L2C ו DIMNP, מונפלייה), בנואה שארלו (IES, מונפלייה) וכן אנשי המעבדה לדיונים מועילים, כריסטוף Duperray לעזרה עם ניתוח FACS, מתקן הדמיה RIO מונפלייה (MRI) למתן סביבה נאותה עבור FACS ו מיקרוסקופיה confocal. Bnm נתמכה על ידי מענק בוגר LabEx Numev (האמנה ANR-10-LABX-20). AB נתמכה על ידי עמיתי ראשון מאוניברסיטת ורשה והאיחוד האירופי (N ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV הוא מדען צוות מהמרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
