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Biology

MitoCeption: ग्लयोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के स्थानांतरण अलग मानव एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया

Published: February 22, 2017 doi: 10.3791/55245
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

Summary

इधर, एक प्रोटोकॉल (MitoCeption) GSC चयापचय और कार्यों पर उनके जैविक प्रभाव का अध्ययन करने के लक्ष्य के साथ, माइटोकॉन्ड्रिया, मानव mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) से अलग-थलग हस्तांतरण करने के लिए ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSC) को प्रस्तुत किया है। इसी तरह की एक प्रोटोकॉल अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका चयापचय, ऊर्जा उत्पादन और apoptosis के नियंत्रण के लिए एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। अपर्याप्त mitochondrial समारोह बहुत ही विविध रोगों के लिए जिम्मेदार पाया गया है, मस्तिष्क संबंधी विकृतियों से कैंसर को लेकर। दिलचस्प बात यह है माइटोकॉन्ड्रिया हाल ही में क्षमता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है प्रकार की कोशिकाओं के बीच, मानव mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) से कैंसर की कोशिकाओं को coculture की स्थिति में, चयापचय और कार्यात्मक परिणामों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के लिए हस्तांतरित किया जा विशेष रूप से, आगे बढ़ाने के मौजूदा ब्याज इन अंगों के जैविक गुणों के लिए।

लक्ष्य कोशिकाओं में स्थानांतरित एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के प्रभाव का मूल्यांकन इस तरह के सेल सेल बातचीत के जैविक परिणाम समझने के लिए प्राथमिक महत्व का है। MitoCeption यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल लक्ष्य कोशिकाओं को दाता कोशिकाओं से पहले से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण की अनुमति देता है, एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करऔर glioblastoma स्टेम सेल (GSC) एक मॉडल प्रणाली के रूप में। इस प्रोटोकॉल पहले से MSCs से माइटोकॉन्ड्रिया, पृथक हस्तांतरण करने के लिए, एमडीए MB-231 कैंसर की कोशिकाओं को पक्षपाती करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसफर प्रोटोकॉल GSCs कि इन विट्रो में neurospheres के रूप में बढ़ के विशिष्ट ख़ासियत पेश करने के लिए यहाँ अनुकूलित है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण के माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण रंगों का उपयोग कर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और confocal इमेजिंग द्वारा पीछा किया जा सकता है। अलग haplotypes (SNPs) के साथ माइटोकॉन्ड्रिया दाता और लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग भी लक्ष्य कोशिकाओं में अपने परिपत्र mitochondrial डीएनए (mtDNA) की एकाग्रता के आधार पर स्थानांतरित कर माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। एक बार जब प्रोटोकॉल इन मानदंडों के साथ मान्य किया गया है, कोशिकाओं का तबादला माइटोकॉन्ड्रिया को शरण देने आगे इस तरह के सेल चयापचय, लचीलापन, प्रसार और उपचार के लिए प्रतिक्रिया के रूप में जैविक गुणों पर बहिर्जात माइटोकॉन्ड्रिया के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं, जहां वे पोषक तत्व तेज में और साथ ही ऊर्जा और मेटाबोलाइट उत्पादन में एक केंद्रीय भूमिका निभाने में पाया अंगों कर रहे हैं। इन अंगों परिपत्र mitochondrial डीएनए (mtDNA), 16.6 केबी लंबे, कि इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों, tRNAs और rRNAs 1 के प्रोटीन को कूटबद्ध होते हैं। इन अंगों की कार्यक्षमता सेल homeostasis और कई विकृतियों माइटोकॉन्ड्रिया में शिथिलता 1, 2, 3 के साथ संबद्ध किया गया है के लिए महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया स्थिति उदाहरण के लिए चिकित्सा 4, 5, 6, 7 को मेटास्टेसिस और प्रतिरोध के लिए परिणामों के साथ इस मामले में बाद में सूजन, संक्रामक रोगों और कैंसर से जोड़ा गया है।

माइटोकॉन्ड्रिया की उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित "दाता" और "लक्ष्य" कोशिकाओं के बीच स्थानांतरित हो रही है। यह, इस तरह के ऊतकों की मरम्मत और एजेंटों के लिए प्रतिरोध के रूप में अन्य कार्यात्मक संशोधनों के साथ ही लक्ष्य कोशिकाओं के ऊर्जावान चयापचय में परिवर्तन करने के लिए सुराग के रूप में हाल ही में विभिन्न प्रयोगशालाओं 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 के द्वारा दिखाया 16। मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs), cardiomyocytes, endothelial कोशिकाओं, फेफड़े वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं, गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं सहित लक्ष्य कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता के लिए माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए इस क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए इन कोशिकाओं के कार्यात्मक संपत्तियों के संशोधनों के लिए अग्रणी 8,> 9, 10, 12, 17, 18।

माइटोकॉन्ड्रिया विनिमय अब ​​एक व्यापक रूप से इस्तेमाल व्यवस्था है कि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के एक नंबर के लिए एक दूसरे के साथ संवाद करने और उनके जैविक गुणों को संशोधित करने के लिए अनुमति देता है के रूप में प्रकट होता है। इस माइटोकॉन्ड्रिया विनिमय टनलिंग नैनोट्यूब (टीएनटी) के गठन के माध्यम से हो सकता है, connexin 43-युक्त अंतराल जंक्शनों 8 या एम-सेक / TNFaip2 और exocyst जटिल 19 शामिल हैं। वैकल्पिक रूप से, माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण भी डोमेन युक्त प्रोटीन 1 की मध्यस्थता microvesicles (ARMMs) 20 arrestin द्वारा मध्यस्थता होना दिखाया गया था। दिलचस्प बात यह है माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण की प्रभावकारिता रो GTPase 1 की अभिव्यक्ति दर MIRO1 21, iPSC- के बीच माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण efficacies में मतभेद को समझाने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक से जुड़ा हुआ थाMSCs और वयस्क BM-MSCs 22।

सेल करने वाली सेल माइटोकॉन्ड्रिया विनिमय के विषय में डेटा के इस धन के बावजूद, अपेक्षाकृत कम चयापचय और इस माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण के जैविक परिणाम के बारे में जाना जाता है। इसलिए, यह पूरी तरह से उचित उपकरण पूरी तरह से इस हस्तांतरण का जैविक प्रभाव का आकलन करने के लिए स्थापित वारंट। इन वर्षों में, कई तकनीकी दृष्टिकोण स्वीकर्ता कोशिकाओं को दाता से माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए प्रस्तावित किया गया है। इस transmitochondrial cybrids 26 उत्पन्न करने के लिए oocytes 23, 24, 25, सेल संलयन में माइटोकॉन्ड्रिया के प्रत्यक्ष इंजेक्शन भी शामिल है, 27 और, हाल ही में, photothermal का उपयोग कर अलग माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण nanoblades 28।

हम और दूसरों को पहले से पृथक mitochond की क्षमता का प्रदर्शन कियारिया, जीवित कोशिकाओं से भली भाँति जा के रूप में इन विट्रो और इन विवो दोनों में मनाया 29, 30, 31, तंत्र के माध्यम से macropinocytosis 32 को शामिल करने का प्रस्ताव रखा। हम आगे की एक विधि है, MitoCeption बुलाया विकसित की है, मात्रात्मक एमडीए MB-231 स्तन कैंसर कोशिका लाइन 31 के रूप में (पक्षपाती) के साथ उदाहरण, कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए (MSCs से) पृथक माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए। इस प्रोटोकॉल ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं को अलग-थलग मानव एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण (GSCs) के लिए यहां अनुकूलित किया गया था।

ग्लयोब्लास्टोमा मस्तिष्क है कि तेजी से मुख्य रूप से ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSC) ट्यूमर 33 के भीतर मौजूद होने के कारण उपचार के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं, के आक्रामक घातक ट्यूमर है। ये GSCs इन विट्रो में neurospheres के रूप में विकसित और जेनोग्राफ्ट मॉडल में ट्यूमर उत्पन्न करते हैं। ग्लियोब्लास्टोमा भीतर कैंसर कोशिकाओं हैके रूप में astrocytic ब्रेन ट्यूमर कोशिकाओं है कि जो माइटोकांड्रिया (साथ ही कैल्शियम और सेल नाभिक) के माध्यम से बढ़ाया microtubes, के माध्यम से आपस में पलायन कर सकते हैं, रेडियोथेरेपी के लिए प्रतिरोधी एस्ट्रोसाइटोमा नेटवर्क 34 में जिसके परिणामस्वरूप के लिए हाल ही में दिखाया क्षमता सेल करने वाली सेल कनेक्शन बनाने के लिए। ग्लयोब्लास्टोमा ट्यूमर microenvironment के भीतर कई विभिन्न कोशिकाओं भर्ती कर सकते हैं, MSCs 35, 36 सहित। हम पता चला कि MSCs coculture में GSCs साथ सेल सेल कनेक्शन बनाने और उनके माइटोकांड्रिया (नहीं दिखाया डेटा) है, जो GSC कार्यात्मक संपत्तियों को संशोधित करने की उम्मीद है हस्तांतरण कर सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे MitoCeption तकनीक उनके कार्यात्मक जैविक परिणाम को निर्धारित करने के उद्देश्य के साथ मानव MSCs से माइटोकॉन्ड्रिया, पृथक पहले से हस्तांतरण करने के लिए, मानव GSCs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Multipotent और अत्यधिक tumorigenic GB4 GSC लाइन 37 इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था।

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Protocol

पहला दिन

1. mesenchymal स्टेम सेल की लेबलिंग (एमएससी) माइटोकॉन्ड्रिया (वैकल्पिक)

  1. दो दिन माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी से पहले, एक 100 मिमी संस्कृति डिश में मानव MSCs बीज में 10 मिलीलीटर αMEM / FBS 10%, ताकि दिन 1 पर संस्कृति में 4 x 10 5 MSCs है।
  2. पीबीएस (4 एमएल) के साथ MSCs कुल्ला और 4 मिलीलीटर αMEM / FBS 1% जोड़ने (37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed)।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई के लिए आवश्यक राशि जोड़ें और कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. माइटोकॉन्ड्रिया डाई समाधान निकालें, कोशिकाओं prewarmed 4 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) αMEM / FBS 1% के साथ दो बार कुल्ला और वापस 4 मिलीलीटर αMEM / FBS 10% जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. 2 घंटा बाद में 30 मिनट के बाद संस्कृति मध्यम (10 मिलीलीटर αMEM / FBS 10%) बदलने के लिए और, एक बार,।

पहला दिन

2. ग्लयोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSC) की लेबलिंग (वैकल्पिक, चर्चा अनुभाग देखें)

सेल संस्कृति माध्यम रचना
GSC बेसल मध्यम DMEM / F-12 के साथ पूरक
इंसुलिन 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर
एन 2 पूरक 1x
ग्लूकोज 3 जी / एल
एल glutamine 2 मिमी
GSC प्रसार मध्यम बेसल मध्यम में जोड़ें:
B27 पूरक 1x
EGF 10 एनजी / एमएल
bFGF 10 एनजी / एमएल
Fungine 10 मिलीग्राम / एमएल
Fungizone 0.25 मिलीग्राम / एमएल
हेपरिन 2 मिलीग्राम / एमएल
Ciprofloxacin 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
जेंटामाइसिन 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
एमएससी प्रसार मध्यम & #945; सदस्य के साथ पूरक
एल glutamine 2 मिमी
10% FBS
bFGF 2 एनजी / एमएल

तालिका 1: संस्कृति मीडिया।

  1. GSCs (GB4 सेल लाइन 32 (10 x 10 6 कोशिकाओं) पाली हेमा लेपित सेल संस्कृति बोतल पर neurospheres के रूप में उगाया (कदम 3.12 करने के लिए 3.1 देखें) अलग कर देना।
  2. 10 5 कोशिकाओं में एक 48 अच्छी तरह से थाली में बीज GSCs / में अच्छी तरह से GSC प्रसार मध्यम (500 μl) (1 टेबल देखें)।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
  4. सेल महत्वपूर्ण डाई के लिए आवश्यक राशि जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 48 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से (तालिका 1) GSC बेसल मध्यम के 500 μl जोड़ें।
  6. 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 270 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  7. दोहराएँ 2.6 करने के लिए 2.5 कदम।
  8. GSC बेसल मध्यम के 500 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  9. 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 270 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  10. 48 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से GSC प्रसार माध्यम के 500 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    नोट: GSCs की राशि संकेत दिया (10 x 10 6 कोशिकाओं) विभिन्न खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों और FACS नियंत्रण के प्रदर्शन की अनुमति देता है। एक बार जब प्रयोगात्मक शर्तों और अधिक ठीक परिभाषित कर रहे हैं इस राशि को नीचे पहुंचा जा सकता है।

दूसरा दिन

3. ग्लयोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं की सीडिंग

  1. GSC neurospheres (10 x 10 6 कोशिकाओं) centrifugation द्वारा एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर ले लीजिए।
  2. कोशिकाओं को 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर HBSS के 5 मिलीलीटर, और सेंट्रीफ्यूज के साथ धोएं।
  3. सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  4. धीरे 100 μl trypsin EDTA (0.25%) (GSC में गोली resuspend प्रति 10 x 10
  5. 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 10 μl 2 CaCl (20 मिमी) और 2 μl DNase मैं (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
  7. धीरे से एक P200 विंदुक के साथ नीचे (30-50x) ऊपर pipetting और neurospheres अलग कर देना। बुलबुले से बचें। माइक्रोस्कोप है कि सभी GSCs अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें।
  8. 10 μl trypsin अवरोध करनेवाला (5%) और 10 मिलीलीटर HBSS जोड़ें।
  9. 20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 270 XG पर अपकेंद्रित्र GSCs।
  10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 मिलीलीटर GSC बेसल मध्यम (तालिका 1) जोड़ें।
  11. एक थोमा गिनती चैम्बर के साथ GSCs गणना और फिर 20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 270 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  12. GSC प्रसार मध्यम (1 टेबल) की उचित मात्रा 10 6 GSCs / एमएल की एकाग्रता सेलुलर तक पहुंचने के लिए जोड़ें।
  13. बीज 10 5 GSCs एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से (सेल निलंबन के 100 μl)।
  14. 20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 270 XG पर प्लेटों अपकेंद्रित्र बॉट पर GSCs पाने के लिएकुओं के टॉम।
  15. धारा 5 तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं।

दूसरा दिन

4. एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव

  1. 4 डिग्री सेल्सियस तक microtube सेंट्रीफ्यूज तापमान को समायोजित करें।
  2. दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों 'ए' और 'सी' माइटोकॉन्ड्रिया निष्कर्षण (200 μl अभिकर्मक ए और 400 μl अभिकर्मक सी, दोनों EDTA मुक्त protease inhibitors युक्त) के लिए अभिकर्मकों युक्त तैयार करें। 2 अन्य ट्यूब, लेबल "एमएससी" और "Mito" तैयार करें। बर्फ पर सभी ट्यूबों रखें। इसके अलावा माइटोकॉन्ड्रिया धारावाहिक dilutions के लिए ट्यूबों तैयार करते हैं।
  3. prewarmed 10 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ धो MSCs।
  4. 2 मिलीलीटर 10 सेकंड के लिए trypsin (कोई EDTA) और 1 मिलीलीटर trypsin (कोई EDTA) जोड़ने के साथ धो MSCs। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. 10 मिलीलीटर αMEM / FBS 10%, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण जोड़कर MSCs की वसूली।
  6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और जोड़ने10 मिलीलीटर αMEM / FBS 10 सेल गोली%।
  8. एक Malassez गिनती चैम्बर के साथ MSCs गणना।
  9. अपकेंद्रित्र MSCs (4-5 x 10 5) 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर।
  10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सेल गोली 1 मीटर ठंडा αMEM / FBS 10% जोड़ सकते हैं और "एमएससी" -labeled ट्यूब (4.2 कदम पर तैयार) कोशिकाओं हस्तांतरण। बर्फ पर ट्यूब रखें।
  11. अपकेंद्रित्र ट्यूब 5 मिनट के लिए 900 XG पर MSCs युक्त, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  12. ट्यूब से सभी अवशिष्ट मध्यम निकालें।
  13. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव अभिकर्मक ए (EDTA मुक्त protease inhibitors युक्त) के 200 μl जोड़ें। 5 सेकंड के लिए मध्यम गति से भंवर और ठीक 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों छोड़ दें।
  14. 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव अभिकर्मक बी भंवर के 2.5 μl जोड़ें, और फिर बर्फ पर ट्यूबों छोड़ दें। 5 मिनट के लिए हर 30 सेकंड दोहराएँ।
  15. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव अभिकर्मक सी (EDTA मुक्त protease inhibitors युक्त) के 200 μl जोड़ें। ट्यूब झुकने से मिक्स (आरओughly 30 बार, नहीं भंवर करते हैं)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  16. "Mito" ट्यूब (4.2 कदम पर तैयार) को सतह पर तैरनेवाला (एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया युक्त) हस्तांतरण।
  17. 3,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, पर अपकेंद्रित्र माइटोकॉन्ड्रिया गोली पाने के लिए। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में शामिल है।
  18. 12,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट पर फिर अभिकर्मक सी के 200 μl, सेंट्रीफ्यूज के साथ माइटोकॉन्ड्रिया गोली कुल्ला, माइटोकॉन्ड्रिया गोली पाने के लिए।

GSCs करने के लिए अलग एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के 5. स्थानांतरण (MitoCeption)

  1. MSCs (4 x 10 5) से अलग माइटोकॉन्ड्रिया गोली पूर्व ठंडा (0 डिग्री सेल्सियस) GSC प्रसार माध्यम के 200 μl जोड़ें।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी (GSC प्रसार माध्यम में) लगातार GSCs को mitochondrial निलंबन के 20 μl जोड़ने के लिए पतला।
  3. पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रा 96-W के कुओं में जोड़ेपक्ष (कदम 3.15 से) GSCs, वांछित एकाग्रता (0.1 करने के लिए 10 माइक्रोग्राम) में युक्त थाली। अच्छी तरह से नीचे के करीब है, धीरे-धीरे माइटोकॉन्ड्रिया जोड़े, कम से कम एक बार पूरी सतह को कवर।
  4. एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई रिसाव को नियंत्रित करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली GSC प्रसार मध्यम केवल (कोई GSCs) (महत्वपूर्ण डाई रिसाव का पता लगाने के लिए भाग 6.2 देखें) युक्त के कुओं के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी (0.1 10 माइक्रोग्राम के लिए) का एक ही मात्रा में जोड़ें।
  5. अपकेंद्रित्र 96 अच्छी तरह से थाली 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1,500 XG पर एमएससी माइटोकांड्रिया (कदम 5.3) और नियंत्रण प्लेट (कदम 5.4) के साथ माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्तकर्ता GSCs हैं।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति प्लेटों तुरंत बाद centrifugation रखें।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसफर प्रोटोकॉल centrifugations के एक नंबर syst के आधार पर समायोजित किया जा सकता है के साथ, पर्याप्त centrifugation बल पर संवर्धित कोशिकाओं पर माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन की centrifugation पर निर्भर करता हैमाइटोकॉन्ड्रिया दाता / प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की उन्हें।

तीसरा दिन

6. FACS और confocal इमेजिंग द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया स्थानांतरण का विश्लेषण

  1. FACS विश्लेषण के लिए GSC नमूनों की तैयारी
    नोट: यदि एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया पहले से एक महत्वपूर्ण डाई (खंड 1) के साथ लेबल रहे थे, दक्षता माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण के बाद 24 घंटे, FACS द्वारा नजर रखी जा सकती है।
    1. अपकेंद्रित्र 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर MitoCepted GSCs के साथ 96 अच्छी तरह से थाली।
    2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. 100 μl trypsin (कोई EDTA) प्रत्येक कुएं में जोड़ें। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। Pipet और नीचे neurospheres 24 घंटा समय अवधि में गठित अलग कर देना।
    4. GSC बेसल माध्यम के 100 μl जोड़ें।
    5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 270 XG पर थाली अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. 300 μl GSC में Resuspend GSCs बेसल मध्यम और FACS के लिए स्थानांतरण ट्यूबों के लिए अनुकूलित।
    7. FACS एक प्रदर्शन करनाalysis।
  2. पृथक माइटोकॉन्ड्रिया से माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई रिसाव के लिए कंट्रोल (FACS)
    नोट: इस कदम का उद्देश्य पृष्ठभूमि FACS संकेत है कि एक वास्तविक एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण को प्रतिबिंबित नहीं होता, बल्कि MitoCeption (कदम 5.3) के लिए इस्तेमाल किया लेबल एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया से महत्वपूर्ण डाई के मात्र रिसाव को निर्धारित है।
    1. 3.15 के लिए कदम 3.1 में वर्णित के रूप में GSC कोशिकाओं बीज।
    2. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. अपकेंद्रित्र 96 अच्छी तरह से थाली माइटोकॉन्ड्रिया केवल 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर (कदम 5.4 से 5.6 के लिए) से युक्त।
    4. GSC 96 अच्छी तरह से थाली (कदम 6.2.2) से संस्कृति के माध्यम Aspirate और मध्यम माइटोकॉन्ड्रिया केवल (कदम 6.2.3 से सतह पर तैरनेवाला) के साथ incubated से यह जगह।
    5. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से GSCs युक्त थाली सेते हैं।
    6. कदम 6.1.1 FACS विश्लेषण के लिए 6.1.7 करने के लिए के रूप में आगे बढ़ें।
  3. GSC samp की तैयारीconfocal इमेजिंग के लिए लेस
    नोट: GSCs को एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा रहा है, दोनों MSCs और GSCs माइटोकांड्रिया (चरण 1) और सेल (चरण 2) महत्वपूर्ण रंगों के साथ क्रमश: पहले से लेबल किया जा करने की जरूरत है।
    1. GSCs कदम 6.1.5 के लिए 6.1.1 के रूप में तैयार करें।
    2. 2 मिलीलीटर GSC प्रसार 35 मिमी संस्कृति व्यंजन (गिलास नीचे) में 2% FBS और बीज युक्त मध्यम में Resuspend GSCs।
    3. स्थानांतरित कर फ्लोरोसेंट एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया 24 घंटा बाद में साथ GSCs पर confocal इमेजिंग प्रदर्शन करना।

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Representative Results

Mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) और MitoCeption द्वारा लक्षित ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSC) को उनके स्थानांतरण से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की रूपरेखा प्रक्रियात्मक कदम चित्र 1 में दिखाया गया है। GSCs कैंसर स्टेम neurospheres उनके स्टेम सेल गुणों को संरक्षित करने के रूप में विकसित कोशिकाओं रहे हैं। प्रोटोकॉल के लिए, GSCs माइटोकांड्रिया (चरण 3) उच्च माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण दक्षता अनुमति देने के लिए के हस्तांतरण से पहले कुछ घंटों के एकल कक्षों के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं (देखें FACS डेटा चित्रा 3 बी)। धारा 5 (3 दिन) के बाद, इन कोशिकाओं के गठन neurospheres (चित्रा 1) के रूप में फिर से मनाया जाता है।

GB4 GSCs की इमेजिंग, fluorescently लेबल एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के साथ MitoCeption के बाद 72 घंटा, पता चलता है कि एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया, GB4 GSCs अंदर स्थानीय कर रहे हैं के रूप में ओर्थोगोनल confocal छवियों से प्राप्त विचारों के द्वारा प्रदर्शन (चित्रा 2 बी)। का तबादला एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया, GSCs भर में स्थानीय रूप में प्रकट यह भी अंतर्जात GSC माइटोकांड्रिया (2A चित्रा) के लिए मामला है। MitoCepted GSCs के Confocal इमेजिंग भी एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया एक गहरे लाल महत्वपूर्ण डाई तो यह है कि एक ही GSC नमूने FACS द्वारा दोनों का विश्लेषण किया गया साथ prelabeled (चित्रा 3A देखें) और इमेजिंग (चित्रा 2 सी) के साथ प्रदर्शन किया गया था। एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण के सबसे GSCs के लिए मनाया जा सकता है (एक पैनल) और GSC confocal छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण का तबादला एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के intracellular स्थानीयकरण की पुष्टि की (पैनल बी, सी)। दोनों नीले और लाल सेलुलर mitochondrial महत्वपूर्ण स्थानांतरित कर एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण visualizing अनुमति रंगों के साथ (1 दिन) GSCs Prelabeling अंतर्जात GSC माइटोकॉन्ड्रिया के सापेक्ष (हरे रंग में) (लाल रंग में), एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया स्थानांतरण के बाद (चित्रा 2 डी) ।

जबकि confoकैलोरी इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण यों की पसंद का उपकरण की जाँच की अनुमति देता है निम्न MitoCeption, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का तबादला एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के intracellular स्थानीयकरण है, बशर्ते एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया एक महत्वपूर्ण डाई के साथ prelabeled थे। बढ़ी हुई FACS संकेतों के नेतृत्व फ्लोरोसेंट एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की बढ़ती मात्रा के साथ चित्रा 3 ए, MitoCeption में दिखाया गया है। उल्लेखनीय है, यह संकेत (लाल रंग में) परिमाण संकेत नियंत्रण की स्थिति में प्राप्त की तुलना में अधिक के कई आदेशों था (नीले रंग में, 6.2 कदम देखें)। यह आगे प्रदान की सबूत है कि FACS संकेत एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया GSCs अंदर स्थानांतरित कर के प्रतिनिधि और न केवल लेबल एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया से फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण डाई रिसाव का परिणाम है। माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल, एकल कोशिका GSCs पर प्रदर्शन, एक खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया (3B चित्रा) से पता चला है। एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया स्थानांतरण की क्षमता भी Neur पर मूल्यांकन किया गया थाospheres। हालांकि यह भी GSCs को एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए नेतृत्व, स्थानांतरण की प्रभावकारिता कम के रूप में एक प्रतिनिधि प्रयोग (चित्रा 3 बी) में दिखाया गया था।

एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया और GSCs अंदर उनके रखरखाव के हस्तांतरण GSCs में एमएससी mitochondrial डीएनए (mtDNA) बढ़ाता द्वारा पीछा किया जा सकता। यह जरूरी है MSCs और GSCs अलग haplotypes के साथ, विभिन्न दानदाताओं से प्राप्त किया जा सके। चित्रा -3 सी एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) के साथ दो दाताओं की डी-पाश के भीतर पाया mtDNA दृश्यों 3 'अंत की स्थिति में संकेत से पता चलता है। पीसीआर प्राइमरों के डिजाइन, विशेष स्थिति में या तो दाता 1 या 2 दाता, एक अतिरिक्त उत्परिवर्तन पेश किया गया था mtDNA बढ़ाना N-2 पीसीआर प्राइमरों के 3 'को समाप्त करने के रिश्तेदार के लिए। दाता 1 से mtDNA प्राइमरों के सेट के साथ परिलक्षित किया जा सकता है: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA -3 'और 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (यूनिवर्सल रों, किताब 38) equencing जबकि प्राइमरों के सेट: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '38 से (यूनिवर्सल अनुक्रमण प्राइमर) और 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG -3' दाता 2 से mtDNA बढ़ाना इस्तेमाल किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: MitoCeption द्वारा GSCs को अलग-थलग एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण के लिए कार्यप्रवाह। GSCs और बाद GSC विश्लेषण करने के लिए एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की MitoCeption के लिए 7 कदम दिखाए जाते हैं। कदम संख्या प्रोटोकॉल अनुभाग में संकेत के रूप में कर रहे हैं। एमएससी और GSC लेबलिंग नहीं किया जाता है, तो कार्यात्मक विश्लेषण के लिए के रूप में, चरण 1 और 2 छोड़ा जा सकता है और प्रोटोकॉल पर 2 दिन से पीछा किया जा सकता। चरण विपरीत छवियों neurospheres के रूप में GB4 GSCs (1 दिन), कोशिकीय संस्कृति एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण (2 दिन) और माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण (3 दिन) के बाद 24 घंटे के लिए तैयार के रूप में प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार =100 माइक्रोन। चरण 4 में, अलग-थलग एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया, MSCs से अलगाव से पहले MitoTracker लाल CMXRos साथ prelabeled के प्रतिनिधि सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: MitoCeption द्वारा GB4 GSCs करने के लिए स्थानांतरण के बाद GB4 अंतर्जात माइटोकॉन्ड्रिया की इमेजिंग और एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की। (ए, बी, सी) GB4 GSCs एक हरे रंग की महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबल रहे थे। (बी, सी, डी) GB4 GSCs 2.5 माइक्रोग्राम एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी (10 5 GSCs के लिए) के साथ MitoCepted थे। (ए) GSCs और MitoTracker लाल CMXRos साथ लेबल रहे थे (डब्ल्यू / ओ EGF / bFGF GSC प्रसार मध्यम) 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत।(बी) GSC confocal अनुभाग और orthogonal विचारों, MitoTracker लाल CMXRos लेबल एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के साथ MitoCeption के बाद 72 घंटा (संस्कृति मध्यम: GSC प्रसार मध्यम / FBS 2%)। (सी, डी) MSCs GSCs को एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के हस्तांतरण से पहले एक गहरे लाल माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई (FACS विश्लेषण के लिए के रूप में एक ही परिस्थितियों) के साथ prelabeled थे। एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण के बाद, GSCs GSC प्रसार युक्त FBS 10% माध्यम में वरीयता प्राप्त थे। (सी) isosurface दृश्य (बी, सी) confocal छवियों से एक GSC 3 डी पुनर्निर्माण के xy विमान खंड (ग) (MitoCeption के बाद 48 घंटा) के साथ। (डी) GB4 GSCs एक नीले सेल महत्वपूर्ण डाई और एक लाल माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया एक गहरे लाल माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई के साथ prelabeled के हस्तांतरण से पहले (हरे रंग में imaged) के साथ लेबल रहे थे। xz (ख) और XY (सी) के साथ isosurface विचारों confocal छवियों (72 घंटा एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण के बाद) से एक GSC 3 डी पुनर्निर्माण के विमान वर्गों। सभी कोशिकाओं wअरे कांच नीचे के साथ संस्कृति व्यंजन पर वरीयता प्राप्त और छवियों को जीवित कोशिकाओं पर ले जाया गया। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन, छवि सी पैनल के लिए छोड़कर (क) जहां स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: माइटोकॉन्ड्रिया GSCs में एमएससी mitochondrial डीएनए के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा हस्तांतरण छँटाई (FACS) और पता लगाने (mtDNA) की मात्रा। (ए, बी) GSCs एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया एक गहरे लाल माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई के साथ prelabeled और FACS द्वारा विश्लेषण के साथ MitoCepted थे। (ए) प्रतिनिधि FACS परिणाम MitoCepted GSCs के साथ प्राप्त (ऊपर से नीचे तक, लाल रंग में: 1.2, 2.5, 5, 0.6 10 माइक्रोग्राम एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी (10 5 GSCs के लिए))। नीले रंग में, पूर्वी वायु कमान के लिएज पैनल, नियंत्रण के रूप में MitoCeption (कदम 5.4 देखें) के लिए इस्तेमाल किया GSCs की FACS प्रोफ़ाइल संस्कृति के माध्यम एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की एक ही राशि के साथ वातानुकूलित साथ incubated। काला (ऊपर) में लेबल हटाया गया GSCs के साथ नियंत्रण की स्थिति। (3 प्रयोगों की औसत, SEM) के साथ एक दिवसीय GSC neurospheres पर - (•) (बी) के सापेक्ष मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) एकल कोशिका GSCs पर माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण के बाद प्राप्त (- ओ) और GSC पर नियंत्रण माइटोकॉन्ड्रिया supernatants साथ एकल कक्षों (-)। MtDNA डी-पाश के भीतर (सी) डीएनए दृश्यों और दाताओं 1 और 2 के बीच SNPs एसएनपी मतभेद दृश्यों के 3 'अंत में नीले रंग में संकेत कर रहे हैं। या तो दाता से mtDNA के विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्राइमरों के डिजाइन (प्राइमरों spe 1 और 2)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अध्ययनों से पता चलता है कि कोशिकाओं की संख्या बढ़ रही माइटोकॉन्ड्रिया का आदान-प्रदान कर सकते हैं और इन माइटोकॉन्ड्रिया लक्ष्य सेल चयापचय और कार्यों पर गहरा प्रभाव पड़ता है। इसलिए, यह उपकरण गुरु को मात्रात्मक उनके जैविक प्रभाव का सही अध्ययन को सक्षम करने के लिए इन कोशिकाओं को लक्ष्य दाता कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए आवश्यक है।

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित मूल रूप से बाहर काम किया पक्षपाती कैंसर कोशिका लाइन एमडीए MB-231 33 के लिए मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से अलग माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण करने के लिए किया गया था। यहाँ दिखाया गया है, यह कैंसर स्टेम कोशिकाओं है कि इन विट्रो में neurospheres के रूप में विकसित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण होती है एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया GSC neurospheres करने के लिए जोड़ रहे हैं, यह वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एकल कक्ष GSCs पर अधिक कुशल हो पाया था। इस प्रोटोकॉल भी अन्य गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए extrapolated किया जा सकता है, टी कोशिकाओं की तरह, एक की आवश्यकता के साथMitoCeption कदम के लिए वरीयता प्राप्त सेल एकाग्रता dapt।

माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी उनकी अखंडता को बनाए रखने के लिए बर्फ पर किया जाना चाहिए। अन्य cytosol यौगिकों से घटाकर संदूषण के साथ माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारियों को प्राप्त करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया की वसूली के लिए centrifugation 15 मिनट के लिए 3,000 XG पर किया जाता है। GSCs के हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया की राशि की निगरानी करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन सामग्री निर्धारित किया जाता है। इस प्रयोजन के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन के अर्क RIPA बफर प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं। प्रोटीन एकाग्रता bicinchoninic एसिड परख का उपयोग निर्धारित किया गया था, निर्माता के निर्देशों के अनुसार। गोजातीय सीरम albumin एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। औसत पर प्रोटीन के 10 माइक्रोग्राम 100,000 MSCs से प्राप्त किया गया।

एक महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबल एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया, माइटोकॉन्ड्रिया स्थानांतरण की क्षमता बढ़ाता की अनुमति देता है प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वाराछँटाई (FACS), और confocal इमेजिंग द्वारा तबादला माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण का निर्धारण। GSCs MSCs के रूप में ही माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबल किया जा सकता है। इन कोशिकाओं FACS विश्लेषण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। वैकल्पिक रूप से, GSCs अंतर्जात GSC माइटोकॉन्ड्रिया के सापेक्ष स्थानांतरित कर एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण अनुमति एक माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई MSCs के उस से अलग के साथ लेबल किया जा सकता है। गहरे लाल माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई अच्छी तरह से FACS विश्लेषण के लिए अनुकूल है, जबकि हरे और लाल रंगों माइटोकॉन्ड्रिया confocal इमेजिंग के लिए पसंद किया जाता है। काफी महत्व की, EDTA के लिए एमएससी जोखिम प्रोटोकॉल के सभी चरणों में बचा जाना चाहिए। इसलिए, सेल trypsinization trypsin और कोई EDTA के साथ चला जाता है; माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी के लिए इस्तेमाल प्रोटीज अवरोधकों का कॉकटेल चाहिए, साथ ही, EDTA से रहित हो। EDTA की उपस्थिति में, एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया से माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण डाई का रिसाव मनाया गया। अगर माइटोकॉन्ड्रिया transfeGSCs करने के लिए आर माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा रहा है, प्राप्तकर्ता glioblastoma कोशिकाओं को भी एक महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबल किया जाना चाहिए। हरे और नीले रंगों सेल (देखें सामग्री और अभिकर्मकों तालिका) पसंद किया गया क्योंकि वे एक अधिक सजातीय सेल लेबलिंग दे, confocal छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण सक्षम करने से।

एक बार जब प्रोटोकॉल अपने विशिष्ट कोशिकाओं के साथ उपयोगकर्ता द्वारा मान्य किया गया है, माइटोकॉन्ड्रिया लेबलिंग कार्यात्मक अध्ययन के लिए बाहर छोड़ दिया जाएगा, संभावित जैविक पूर्वाग्रहों को रोकना। खुराक-प्रतिक्रिया एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर विश्लेषण करती है, माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी के धारावाहिक dilutions के साथ, सलाह दी जाती है। वास्तव में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्थानांतरित माइटोकॉन्ड्रिया के लिए जैविक प्रभाव कम माइटोकॉन्ड्रिया सांद्रता के लिए, कम रेंज में पता लगाने के लिए FACS या इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। GSC चयापचय, प्रसार और चिकित्सा के जवाब पर जांच सहित इन कार्यात्मक अध्ययन, अगले दिन बाहर किया जाता हैमाइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण।

MSCs और GSCs (विभिन्न mtDNA haplotypes) के साथ विभिन्न दानदाताओं से अलग कर रहे हैं, का तबादला एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया लक्षित GSCs में एमएससी mtDNA की सांद्रता को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है। एमएससी और अंतर्जात GSC mtDNAs के बीच भेदभाव SNPs की उपस्थिति, प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए विशिष्ट, mtDNA hypervariable डी-पाश क्षेत्र में पर आधारित है। इसलिए, MitoCeption तकनीक के विभिन्न अनुप्रयोगों के अलावा, विभिन्न haplotypes साथ mitochondrial डीएनए को शरण देने माइटोकॉन्ड्रिया स्थानांतरित करने की संभावना न केवल स्थानांतरित कर माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी, mtDNA रखरखाव के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के haplotype बहिष्कार का विश्लेषण सहित उपकरण प्रदान करता है।

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Disclosures

INSERM (इंस्टीट्यूट में राष्ट्रीय डी ला Santé एट डी ला Recherche MEDICALE), जिसके साथ मुख्य न्यायाधीश और ML.V. संबद्ध हैं, MitoCeption तकनीक (EP14306154.7) पर एक पेटेंट आवेदन दायर किया है।

Acknowledgments

हम एंड्रिया Parmeggiani (L2C और DIMNP, पेरिस), बेनोइट Charlot (आईईएस, पेरिस) के रूप में अच्छी तरह से धन्यवाद उपयोगी विचार विमर्श के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों के रूप में, क्रिस्टोफ़ Duperray प्रदान करने के लिए FACS विश्लेषण, मोंटपेलियर रियो इमेजिंग सुविधा (एमआरआई) के साथ मदद के लिए FACS और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त माहौल। BNM LabEx Numev (सम्मेलन ANR-10-LabX -20) से स्नातक की फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। एबी वारसॉ और यूरोपीय संघ के विश्वविद्यालय से स्नातक की फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12)। MLV वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय केन्द्र (CNRS) से एक कर्मचारी वैज्ञानिक है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mitochondria Isolation Kit for Tissue  Fisher Scientific  10579663
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 11520536
B-27 Supplement W/O VIT A (50x) Fisher Scientific  11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+  Sigma H4385
poly Heme  Sigma  P3932
aMEM w/o glutamine Ozyme BE12-169F
DMEM/F-12 without glutamine Fisher Scientific  11540566
L-Glutamine  Invitrogen  25030-024 
Glucose  Sigma  G7021
Insuline  Sigma  I 1882 
Human bFGF  R&D Systems 233-FB-025
Human EGF  Peprotech  AF-100-15 
Heparin Sigma H3149 
CaCl2 MERCK 2382
Trypsine Inhibitor Sigma  T9003
DNase I SIGMA  10104159001
Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM Invitrogen  25200056
Trypsin Gibco  15090-046
Protease inhibitors EDTA free Sigma 4693159001
Ciprofloxacine  Sigma 17850-5G-F
Fungine  Invivogen ant-fn-1
Fungizone  Thermofisher 15290018
Gentamycin Euromedex EU0410
MitoTracker Green FM Molecular Probes M7514
MitoTracker Red CMXRos Molecular Probes  M7512
MitoTracker Deep Red FM Molecular Probes  M22426 
CellTracker Green CMFDA Molecular Probes C7025
CellTracker Blue CMF2HC Molecular Probes C12881
RIPA Santa Cruz sc-24948
FluoroDish Sterile Culture Dish World Precision Instruments FD35-100
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
FACS tubes Beckman Coulter 2,523,749
FACS apparatus Gallios   3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS  Roche 3515885001

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 120 माइटोकॉन्ड्रिया हस्तांतरण मानव mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSC) चयापचय mitochondrial डीएनए neurospheres
MitoCeption: ग्लयोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के स्थानांतरण अलग मानव एमएससी माइटोकॉन्ड्रिया
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Nzigou Mombo, B., Gerbal-Chaloin,… More

Nzigou Mombo, B., Gerbal-Chaloin, S., Bokus, A., Daujat-Chavanieu, M., Jorgensen, C., Hugnot, J. P., Vignais, M. L. MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (120), e55245, doi:10.3791/55245 (2017).

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