Summary
Aqui, um protocolo (MitoCeption) é apresentada para transferir mitocôndrias, isolado a partir de células estaminais mesenquimais humanas (MSC), para células estaminais glioblastoma (GSC), com o objectivo de estudar os seus efeitos biológicos sobre o metabolismo SGC e funções. Um protocolo semelhante pode ser adaptado para transferir as mitocôndrias entre outros tipos de células.
Abstract
As mitocôndrias desempenham um papel central para o metabolismo celular, a produção de energia e de controlo de apoptose. função mitocondrial inadequada foi encontrado responsável por doenças muito diversas, que vão desde patologias neurológicas ao câncer. Curiosamente, as mitocôndrias foram recentemente mostrado para exibir a capacidade de ser transferidos entre os tipos de células, nomeadamente a partir de células estaminais mesenquimais humanas (MSC) para as células cancerosas em condições de co-cultura, com metabólicas e funcionais consequências para as células mitocôndrias destinatários, aumentando ainda mais o interesse actual para as propriedades biológicas destes organelos.
Avaliação dos efeitos da mitocôndria MSC transferido nas células alvo é de importância primária para entender o resultado biológico de tais interacções célula-célula. O protocolo aqui descrito MitoCeption permite a transferência das mitocôndrias isoladas de antemão a partir das células dadoras para as células alvo, usando MSC mitocôndriase de células estaminais glioblastoma (GSC) como um sistema modelo. Este protocolo foi anteriormente usada para transferir as mitocôndrias, isolado a partir de MSC, para aderentes de células de cancro MDA-MB-231. Este protocolo de transferência de mitocôndrias é adaptado aqui para GSCS que apresentam a particularidade específica de crescer como neurospheres in vitro. A transferência das mitocôndrias isoladas pode ser seguido de células activadas por fluorescência (FACS) e de imagem confocal utilizando mitocôndrias corantes vitais. A utilização de doadores e células alvo as mitocôndrias, com diferentes haplótipos (SNPs), também permite a detecção das mitocôndrias transferidos com base na sua concentração de ADN mitocondrial circular (mtDNA) nas células alvo. Uma vez que o protocolo foi validado com estes critérios, as células que albergam as mitocôndrias transferidos pode ser ainda analisada para determinar os efeitos das mitocôndrias exógenos nas propriedades biológicas, tais como o metabolismo celular, plasticidade, proliferação e resposta à terapia.
Introduction
As mitocôndrias são organelos encontrados em células eucarióticas em que desempenham um papel central na absorção de nutrientes, assim como na produção de energia e de metabolito. Essas organelas contêm DNA mitocondrial circular (mtDNA), 16,6 kb de comprimento, que codifica as proteínas dos complexos da cadeia de transporte de elétrons, tRNAs e rRNAs 1. A funcionalidade destes organelos é crítica para a homeostase celular e diversas patologias têm sido associados com a disfunção mitocondrial 1, 2, 3. O estado mitocôndria tem, por exemplo, sido associados a inflamação, doenças infecciosas e cancro, neste último caso, com consequências para a metástase e resistência à terapia com 4, 5, 6, 7.
Mitocôndrias exibir a capacidade notável de sendo transferidos entre "doadores" e células "alvo". Isto leva a mudanças no metabolismo energético das células-alvo, bem como em outras modificações funcionais, tais como a reparação e resistência aos agentes quimioterapêuticos tecido, como foi recentemente mostrado por diferentes laboratórios 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. As células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) exibir esta capacidade de transferir mitocôndria para uma ampla variedade de células alvo, incluindo cardiomiócitos, células endoteliais, células epiteliais alveolares pulmonares, células tubulares renais e células cancerosas, conduzindo a alterações das propriedades funcionais destas células 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
As mitocôndrias de troca aparece agora como um mecanismo amplamente utilizado que permite que um número de diferentes tipos de células para se comunicar uns com os outros e modificar as suas propriedades biológicas. Esta troca mitocôndrias pode ocorrer através da formação de túneis nanotubos (TNT), envolvendo conexina 43 contendo junções comunicantes 8 ou M-Sec / TNFaip2 eo exocyst complexos 19. Alternativamente, a transferência de mitocôndrias também mostrou ser mediada por arrestina microvesículas proteína contendo o domínio 1-mediadas (ARMMs 20). Curiosamente, a eficácia da transferência de mitocôndrias foi relacionado com a taxa de expressão da Rho GTPase 1 MIRO1 21, um factor chave para explicar as diferenças na mitocôndria eficácias de transferência entre iPSC-MSCs e adultos BM-MSCs 22.
Apesar desta riqueza de dados relativos à troca de mitocôndria da célula-célula, relativamente pouco se sabe sobre a metabólico e resultados biológica dessa transferência mitocôndrias. Por isso, justifica plenamente a criação de instrumentos adequados para avaliar plenamente os efeitos biológicos desta transferência. Ao longo dos anos, várias abordagens técnicas para transferir mitocôndrias a partir de doadores de células aceitadores têm sido propostos. Isto inclui a injecção directa de mitocôndrias em oócitos de 23, 24, 25, fusão celular para gerar cybrids transmitochondrial 26, 27 e, mais recentemente, a transferência de mitocôndrias isoladas usando fototérmico nanolâminas 28.
Nós e outros já demonstraram a capacidade de mitochond isoladoRia para ser internalizada pelas células vivas, como observado tanto in vitro como in vivo 29, 30, 31, através de mecanismos propostos para envolver macropinocitose 32. Desenvolvemos também um método, chamado MitoCeption, para transferir quantitativamente mitocôndrias isoladas (a partir de MSCs) às células alvo, tal como exemplificado com o (aderente) MDA-MB-231 linha celular de cancro da mama 31. Este protocolo foi adaptado aqui para a transferência de mitocôndrias isoladas de MSC humanas de glioblastoma células estaminais (GSCS).
O glioblastoma é um tumor maligno agressivo do cérebro que rapidamente se tornam resistentes ao tratamento, principalmente devido às células estaminais do glioblastoma (GSC) presentes no interior do tumor 33. Estes GSCS crescer como neuroesferas in vitro e gerar tumores em modelos de xenoenxerto. As células cancerosas dentro de glioblastoma têm acapacidade para estabelecer ligações célula-para-célula, como demonstrado recentemente para as células tumorais do cérebro astrocíticos que interligam por meio de microtubos prolongadas, por meio da qual as mitocôndrias (bem como de cálcio e de células núcleos) pode migrar, resultando em redes astrocitoma radioterapia resistente 34. Glioblastoma pode recrutar muitas células diferentes dentro do microambiente do tumor, incluindo o MSC 35, 36. Nós mostramos que MSCs pode fazer conexões célula-célula com GSCS em co-cultura e transferir as suas mitocôndrias (dados não mostrados), que é esperado para modificar SGC propriedades funcionais. O presente protocolo descreve como a técnica MitoCeption pode ser usada para transferir as mitocôndrias, previamente isolado a partir de MSCs humanas, para GSCS humanos com a finalidade de se determinar o resultado biológico funcional. O multipotentes e altamente tumorigénicas linha GB4 SGC 37 foi utilizado neste estudo.
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Protocol
Dia 1
1. Rotulagem da Célula-tronco mesenquimais (MSC) As mitocôndrias (Opcional)
- Dois dias antes da preparação mitocôndrias, sementes MSCs humanas numa placa de cultura a 100 mm, em 10 ml de aMEM / FBS a 10%, de modo a ter 4 x 10 5 MSCs em cultura no Dia 1.
- Lavar as MSCs com PBS (4 mL) e adicionar 4 ml de aMEM / FBS a 1% (pré-aquecido a 37 ° C).
- Adicionar a quantidade necessária de mitocôndrias corante vital e incubar as células durante 30 minutos na temperatura de 37 ° C incubadora.
- Remover a solução de corante de mitocôndrias, lavar as células duas vezes com 4 ml pré-aquecido (37 ° C) aMEM / FBS a 1% e adicionar 4 ml de volta aMEM / FBS a 10%. Incubar as células a 37 ° C.
- Mudar o meio de cultura (10 ml aMEM / FBS a 10%) após 30 min e, outra vez, duas horas mais tarde.
Dia 1
2. Rotulagem dos células de glioblastoma-tronco (SGC) (opcional, consulte seção de discussão)
| Meio de cultura celular | Composição |
| meio basal GSC | DMEM / F-12 suplementado com |
| A insulina 20 mg / ml | |
| 1x suplemento N2 | |
| Glicose a 3 g / L | |
| L-glutamina 2 mM | |
| meio de proliferação GSC | Adicionar ao meio basal: |
| 1x suplemento B27 | |
| EGF 10 ng / mL | |
| bFGF 10 ng / mL | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizona 0,25 mg / ml | |
| Heparina 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacina 2 ug / ml | |
| Gentamicina 2 ug / ml | |
| meio de proliferação MSC | & #945; MEM suplementado com |
| L-glutamina 2 mM | |
| 10% de FBS | |
| bFGF a 2 ng / mL |
Tabela 1: Meios de Cultura.
- Dissociar GSCS (linha GB4 célula 32 (10 x 10 6 células) cultivadas como neurospheres no poli-HEMA frascos de cultura de células revestidas (veja as etapas 3.1 a 3.12).
- GSCS semente em uma placa de 48 poços em 10 5 células / poço em meio de proliferação SGC (500 ul) (ver Tabela 1).
- Centrifugar a placa a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Adicionar a quantidade necessária de corante vital de células e incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Adicionar 500 ul de SGC meio basal (Tabela 1) por poço da placa de 48 poços.
- Centrifugar a placa a 270 xg a 20 ° C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Repita os passos 2,5-2,6.
- Adicionar 500 ul de meio basal SGC e incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Centrifugar a placa a 270 xg a 20 ° C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Adicionar 500 ul de meio de proliferação SGC por poço da placa de 48 poços e incuba-se no 37 ° C incubadora.
Nota: A quantidade de GSCS indicado (10 X 10 6 células) permite realizar as diferentes experiências de dose-resposta e os controlos de FACS. Uma vez que as condições experimentais são mais precisamente definido esse valor pode ser reduzido.
Dia 2
3. Sementeira de Células Estaminais Glioblastoma
- Recolher as neuroesferas SGC (10 X 10 6 células) por centrifugação a 270 xg durante 5 min, a 20 ° C em um tubo de 50 ml.
- Lavar as células com 5 ml de HBSS, e centrifugar a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Aspirar o sobrenadante.
- Suavemente ressuspender o sedimento em 100 ul SGC tripsina-EDTA (0,25%) (por 10 x 10
- Incubar a 37 ° C durante 3 min.
- Adiciona-se 10 uL de CaCl2 (20 mM) e 2 ul de ADNase I (10 mg / ml).
- Dissociar as neurospheres cuidado pipetando para cima e para baixo (30-50x) com uma pipeta P200. Evitar bolhas. Verifique sob o microscópio que todos os GSCS são dissociados.
- Adicionar 10 ul de inibidor de tripsina (5%) e 10 ml de HBSS.
- Centrífuga GSCS a 270 xg durante 7 minutos a 20 ° C.
- Descartar o sobrenadante e adicionar 10 ml de SGC meio basal (Tabela 1).
- Contagem GSCS com uma câmara de contagem Thoma e depois centrifugar as células a 270 xg durante 7 minutos a 20 ° C.
- Adicionar o volume apropriado de meio de proliferação SGC (Tabela 1) para alcançar a concentração celular de 6 a 10 GSCS / ml.
- De sementes 10 5 GSCS (100 uL da suspensão de células) por cavidade de uma placa de 96 poços.
- Centrifugar as placas a 270 xg durante 7 minutos a 20 ° C para obter GSCS no botTom de poços.
- Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C até que a secção 5.
Dia 2
4. MSC mitocôndrias Isolamento
- Ajustar a temperatura microtubo de centrifugação a 4 ° C.
- Preparar dois tubos de 1,5 ml "A" e "C" que contém os reagentes para a extracção de mitocôndrias (200 ul de reagente A e 400 ul de reagente C, contendo ambos os inibidores da protease isento de EDTA). Prepare 2 outros tubos, rotulados como "MSC" e "Mito". Mantenha todos os tubos em gelo. Também preparar tubos para as diluições em série mitocôndrias.
- Lavar as MSCs com 10 ml pré-aquecido (37 ° C) PBS.
- Lavar as MSCs com 2 ml de tripsina (sem EDTA) durante 10 segundos e adicionar 1 ml de tripsina (sem EDTA). Incubar as células durante 5-10 min a 37 ° C.
- Recuperar as MSCs pela adição de 10 ml aMEM / FBS 10%, transferência para um tubo de 50 ml.
- células centrifugar a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Descartar o sobrenadante e adicionar10 ml de aMEM / FBS a 10% ao sedimento celular.
- Contar as MSCs com uma câmara de contagem Malassez.
- Centrifugar as MSCs (4-5 x 10 5) a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 M arrefecido com gelo aMEM / FBS a 10% ao sedimento celular e transferência das células para o "MSC" tubo marcado com (preparado no passo 4.2). Mantenha o tubo em gelo.
- Centrifugar o tubo contendo as MSCs em 900 xg durante 5 min, a 4 ° C.
- Remova todas as médias residual do tubo.
- Adicionar 200 ul de mitocôndrias Isolamento Reagente A (contendo os inibidores de protease isento de EDTA). Vortex a velocidade média durante 5 segundos e deixar os tubos em gelo durante exactamente 2 min.
- Adicionar 2,5 mL de mitocôndrias Isolamento Reagente B. Vortex à velocidade máxima por 10 segundos, e depois sair tubos em gelo. Repetir a cada 30 seg durante 5 min.
- Adicionar 200 ul de Reagente de Isolamento As mitocôndrias C (contendo os inibidores de protease isento de EDTA). Misturar por inclinação do tubo (ROughly 30 vezes, não vortex). Centrifuga-se o tubo a 700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante (contendo o mitocôndrias MSC) para o tubo "Mito" (preparado no passo 4.2).
- Centrifugar a 3000 x g, 15 min a 4 ° C, para obter o sedimento mitocôndrias. Descartar o sobrenadante. O sedimento contem os mitocôndrias isoladas.
- Lavar o sedimento com 200 ul de mitocôndrias do Reagente C. Em seguida, centrifugar a 12000 xg, 5 min a 4 ° C, para obter o sedimento mitocôndrias.
5. Transferência de Isolated MSC mitocôndria para GSCS (MitoCeption)
- Adicionar 200 ul da (0 ° C) meio de pré-arrefecida SGC proliferação ao sedimento de mitocôndrias isoladas de MSC (4 x 10 5).
- Dilui-se a preparação de mitocôndria (no meio de proliferação SGC) para adicionar consistentemente 20 ul de suspensão mitocondrial para o GSCS.
- Adicionar o volume de mitocôndrias isoladas nas cavidades da 96-WEll placa contendo os GSCS (do passo 3.15), na concentração desejada (0,1 a 10 ug). Adicionar lentamente a mitocôndria, perto do fundo do poço, cobrindo toda a superfície, pelo menos uma vez.
- Para controlar MSC mitocôndrias corante vital vazamento, adicionar as mesmas quantidades de preparação mitocôndrias (0,1 a 10 ug) a poços de uma placa de 96 poços contendo SGC meio de proliferação apenas (sem GSCS) (ver parte 6.2 para a detecção de fugas de corante vital).
- Centrifugar a placa de 96 poços contendo as mitocôndrias GSCS destinatário com a mitocôndria MSC (passo 5.3) e a placa de controlo (passo 5.4) a 1500 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Colocar as placas de cultura celular na incubadora a 37 ° C imediatamente após a centrifugação.
Nota: O protocolo de transferência de mitocôndrias baseia-se na centrifugação da suspensão de mitocôndrias em células cultivadas na força de centrifugação adequado, com um número de processos de centrifugação que pode ser ajustada dependendo do System células de dador / receptor mitocôndrias.
Dia 3
6. Análise da transferência de mitocôndrias por FACS e Imagem Confocal
- Preparação de amostras para a análise por FACS SGC
Nota: Se MSC mitocôndrias foram marcadas com um corante vital de antemão (ponto 1), a eficiência pode ser monitorizada por FACS, 24 horas após a transferência de mitocôndrias.- Centrifugar a placa de 96 poços com os GSCS MitoCepted a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Descartar o sobrenadante.
- Adicionar 100 ul de tripsina (sem EDTA) em cada poço. Incubar a 37 ° C durante 3 min. Pipeta-se para baixo e para dissociar as neuroesferas formados durante o período de tempo de 24 h.
- Adicionar 100 ul de SGC meio basal.
- Centrifugar a placa a 270 xg durante 5 min a 20 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender GSCS em 300 ul GSC basal médio e transferência para FACS adaptada tubos.
- Realizar a um FACSANÁLISE.
- Controlo para detecção de fugas mitocôndrias corante vital do mitocôndrias isoladas (FACS)
Nota: O objetivo deste passo é determinar o sinal de FACS de fundo que não refletem uma real transferência MSC mitocôndrias, mas sim a mera fuga de corante vital da mitocôndria MSC rotulados usado para MitoCeption (passo 5.3).- Semente células SGC, tal como descrito nas etapas 3.1 a 3.15.
- Incubar as células a 37 ° C durante 1 h.
- Centrifugar a placa de 96 poços contendo mitocôndrias única (do passo entre 5,4 e 5,6) a 1500 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Aspirar o meio de cultura a partir do SGC placa de 96 poços (passo 6.2.2) e substituí-lo por meio incubados com mitocôndrias única (sobrenadante a partir do passo 6.2.3).
- Incubar a placa de 96 poços contendo os GSCS a 37 ° C durante 2 h.
- Proceder como nas etapas 6.1.1 a 6.1.7 para análise FACS.
- Preparação do GSC samples de imagem confocal
Nota: Se a transferência de MSC mitocôndria para GSCS é para ser analisada por imagiologia de fluorescência, ambas as MSCs e GSCS necessita ser etiquetado de antemão, respectivamente com mitocôndrias (passo 1) e de células (passo 2) corantes vitais.- Prepare GSCS como nos passos 6.1.1 a 6.1.5.
- Ressuspender GSCS em 2 ml de meio de proliferação SGC contendo 2% de FBS e as sementes em placas de cultura de 35 mm (com fundo de vidro).
- Executar imagem confocal sobre os GSCS com as mitocôndrias MSC fluorescentes transferidos 24 horas mais tarde.
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Representative Results
Os passos processuais que descrevem o isolamento de mitocôndrias de células estaminais mesenquimais (MSC) e a sua transferência para as células-tronco glioblastoma segmentados (GSC) por MitoCeption são mostrados na Figura 1. GSCS são células-tronco cancerosas cultivadas como neurospheres para preservar suas propriedades de células-tronco. Para o protocolo, GSCS são semeadas como células individuais de um par de horas antes da transferência das mitocôndrias (passo 3) para permitir uma maior eficiência de transferência de mitocôndria (ver dados de FACS Figura 3B). Seguindo Secção 5 (dia 3), estas células são de novo observados como formando neuroesferas (Figura 1).
Imagiologia dos GSCS GB4, 72 h após MitoCeption com mitocôndrias MSC fluorescentemente marcado, mostra que os MSC mitocôndrias são localizadas dentro das GSCS GB4, como demonstrado pelas vistas ortogonais obtidos a partir de imagens confocais (Figura 2B). As mitocôndrias MSC transferidos são mostrados localizados ao longo dos GSCS, como isto também é o caso para as mitocôndrias SGC endógenos (Figura 2A). Imagem confocal do MitoCepted GSCS também foi realizada com MSC mitocôndrias prelabeled com um corante vital vermelho profundo de modo a que as mesmas amostras foram analisadas tanto SGC por FACS (ver Figura 3A) e de imagem (Figura 2C). A transferência de mitocôndrias MSC pode ser observada para a maioria das GSCS (painel a) e reconstrução 3D de imagens confocais SGC confirmaram a localização intracelular das mitocôndrias MSC transferido (painéis b, c). Prelabeling GSCS (no dia 1), com ambos os corantes vitais azul celulares e vermelhas mitocondrial permitiu visualizar a localização da mitocôndria MSC transferido (cor verde) em relação à mitocôndria SGC endógeno (a vermelho), após a transferência mitocôndrias MSC (Figura 2D) .
enquanto confocal de imagem permite a verificação da localização intracelular das mitocôndrias MSC transferidos seguinte MitoCeption, de células activadas por fluorescência (FACS) é a ferramenta de escolha para quantificar a transferência de mitocôndrias, fornecida mitocôndrias MSC foram prelabeled com um corante vital. Como mostrado na Figura 3A, MitoCeption com quantidades crescentes de mitocôndrias MSC fluorescentes levou a sinais de FACS aumentados. Digno de nota, este sinal (em vermelho) foi várias ordens de magnitude maior do que o sinal obtido nas condições de controle (em azul, ver passo 6.2). Esta evidência ainda desde que o sinal de FACS é representante da MSC mitocôndrias transferidos dentro GSCS e não apenas o resultado da infiltração de corante vital fluorescente da mitocôndria MSC rotulados. O protocolo de transferência de mitocôndrias aqui apresentado, executado em GSCS de células individuais, mostrou uma resposta dependente da dose (Figura 3B). A eficiência da transferência de mitocôndrias MSC também foi avaliada em Neurospheres. Embora este também levou a MSC transferência mitocôndria para os GSCS, a eficácia da transferência foi inferior, como se mostra em uma experiência representativa (Figura 3B).
A transferência de MSC mitocôndria e a sua manutenção no interior das GSCS pode ser seguido através da quantificação do ADN mitocondrial MSC (mtDNA) nos GSCS. Isto requer MSCs e GSCS a ser obtido a partir de doadores diferentes, com haplotipos distintos. A Figura 3C mostra sequências de mtDNA encontrados dentro da D-ciclo de dois dadores com polimorfismos de um único nucleótido (SNPs) indicado na posição da extremidade 3 '. Para o desenho de iniciadores de PCR, para amplificar especificamente mtDNA a partir de qualquer um dador ou do dador 2, uma mutação adicional foi introduzido na posição N-2 em relação à extremidade 3 'dos iniciadores de PCR. O doador de mtDNA 1 poderiam ser amplificadas com o conjunto de iniciadores: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'e 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (s universaisequencing iniciador 38), enquanto o conjunto de iniciadores: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(iniciador de sequenciação universal de 38) e 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' foi usada para amplificar o dador de mtDNA 2.
Figura 1: Fluxo de trabalho para a transferência de mitocôndrias isoladas de MSC GSCS por MitoCeption. Os 7 passos para a MitoCeption da MSC mitocôndria para GSCS e as subsequentes análises SGC são mostrados. Os números de etapa são indicados como na seção de protocolo. Se MSC e rotulagem SGC não é realizada, como em análises funcionais, os passos 1 e 2 podem ser omitidas e o protocolo pode ser seguido de 2 dias em. imagens de contraste de fase representam GSCS GB4 como neuroesferas (dia 1), como a cultura unicelular pronto para a transferência MSC mitocôndrias (dia 2) e 24 horas após a transferência de mitocôndrias (dia 3). Barra de escala =100 um. Na etapa 4, fotomicrografia representativa das mitocôndrias MSC isoladas, prelabeled com MitoTracker Red CMXRos antes do isolamento de MSCs. Barra de escala = 5 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de GB4 mitocôndrias endógeno e da MSC mitocôndrias após transferência para as GSCS GB4 por MitoCeption. (A, B, C) GSCS GB4 foram marcadas com um corante vital verde. (B, C, D) foram GSCS GB4 MitoCepted com 2,5 ug de preparação mitocôndrias MSC (para 10 5 GSCS). (A) GSCS foram marcadas com MitoTracker Red CMXRos e cultivadas durante 48 horas (meio de proliferação SGC w / o EGF / bFGF).Seção confocal (B) GSC e vistas ortogonais, 72 horas após MitoCeption com mitocôndrias MSC MitoTracker Red CMXRos marcado (meio de cultura: meio de proliferação GSC / FBS 2%). (C, D) MSCs foram prelabeled com uma mitocôndria vermelho escuro corante vital (mesmas condições que para a análise FACS) antes da transferência da MSC mitocôndria para GSCS. Após a transferência MSC mitocôndrias, GSCS foram semeadas em meio contendo FBS a proliferação SGC 10%. (C) vista isosuperfície (b, c) com a secção plano xy (c) de uma reconstrução GSC 3D a partir de imagens confocal (48 horas após MitoCeption). (D) GB4 GSCS foram marcadas com um corante vital azul celular e um mitocôndria vermelho corante vital antes da transferência da MSC mitocôndrias prelabeled com uma mitocôndria vermelho escuro corante vital (fotografada em verde). visualizações isosuperfície com xz (b) e xy (c) As secções planas de uma reconstrução GSC 3D a partir de imagens confocal (72 horas após a transferência mitocôndrias MSC). Todas as células Were semeados em placas de cultura com fundo de vidro e as imagens foram tiradas em células vivas. Barras de escala = 5 m, exceto para o painel de imagem C (a), onde Scale bar = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da transferência por mitocôndrias de células activadas por fluorescência (FACS) e detecção do DNA mitocondrial MSC (mtDNA) nos GSCS. (A, B) foram GSCS MitoCepted com MSC mitocôndrias prelabeled com um corante vital mitocôndrias vermelho profundo e analisadas por FACS. (A) FACS representativos resultados obtidos com MitoCepted GSCS (de vermelho, de cima para baixo: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 ug preparação mitocôndrias MSC (para 10 5 GSCS)). Em azul, por eacpainel H, controlar perfil FACS de GSCS incubadas com o meio de cultura condicionado com a mesma quantidade de MSC mitocôndrias, como utilizado para MitoCeption (ver passo 5.4). condições de controlo com GSCS não marcados em preto (em cima). (B) Relativa intensidade média de fluorescência (IMF) obtida após a transferência de mitocôndrias em GSCS de células individuais (- •) (média de 3 experiências, com MEV), em um dia neuroesferas SGC (- O) e com mitocôndrias de controlo sobrenadantes sobre SGC células individuais (-). Sequências de (C) de ADN no interior da D-ciclo mtDNA e diferenças entre SNP dadores 1 e 2. Os SNPs são indicados no azul na extremidade 3 'das sequências. Concepção de iniciadores para a amplificação específica por PCR de mtDNA a partir de qualquer doador (spe iniciadores 1 e 2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um número cada vez maior de estudos mostram que as células podem trocar mitocôndria e que estas mitocôndrias têm efeitos profundos sobre o metabolismo e as funções das células-alvo. Portanto, é essencial para dominar as ferramentas para transferir quantitativamente mitocôndrias das células do doador contra estas células alvo para permitir um estudo preciso dos seus efeitos biológicos.
O protocolo aqui descrito foi originalmente funcionou para transferir mitocôndrias isoladas de células estaminais mesenquimais humanas para a linha celular de cancro aderente MDA-MB-231 33. Como se mostra aqui, pode ser adaptado para o cancro de células estaminais que crescem como neuroesferas in vitro. Embora a transferência mitocôndrias ocorre quando as mitocôndrias MSC são adicionados para as neuroesferas GSC, verificou-se ser mais eficaz na GSCS de células individuais, como descrito no presente protocolo. Este protocolo poderia também ser extrapolados para outras células não-aderentes, como as células T, com a necessidade de umDAPT a concentração de células semeadas para o passo MitoCeption.
A preparação mitocôndrias deve ser realizada em gelo para manter a sua integridade. Para obter preparações de mitocôndrias com reduzida contaminação a partir de outros compostos de citosol, a centrifugação para a recuperação das mitocôndrias é realizada a 3000 xg durante 15 min. Para controlar a quantidade de MSC mitocôndria utilizada para a transferência para os GSCS, o teor de proteína é determinado mitocôndrias. Para este fim, os extractos de proteína mitocôndrias são preparadas utilizando tampão RIPA suplementado com inibidores de protease. A concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de ácido bicinconínico, de acordo com as instruções do fabricante. albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. Em média 10 ug de proteínas foram obtidas a partir de MSC de 100.000.
Etiquetagem MSC mitocôndrias com um corante vital permite quantificar a eficiência da transferência de mitocôndrias, por células activadas por fluorescência(FACS), e a determinação da localização das mitocôndrias transferidos por imagem confocal. Os GSCS podem ser marcados com o mesmo corante vital mitocôndrias como o MSC. Estas células serão utilizadas como controlo positivo para a análise FACS. Alternativamente, GSCS podem ser marcados com um corante vital mitocôndrias diferente da das MSCs, que permite a localização das mitocôndrias MSC transferidos relativos às mitocôndrias SGC endógenos. As mitocôndrias vermelho corante vital profunda é bem adequado para a análise de FACS, enquanto as mitocôndrias corantes verdes e vermelhos são preferidos para imagiologia confocal. De grande importância, a exposição MSC para EDTA deve ser evitado em todas as etapas do protocolo. Por conseguinte, é recomendado tripsinização de células com tripsina e sem EDTA; o cocktail de inibidores de protease utilizados para a preparação de mitocôndria deve, assim, ser desprovido de EDTA. Na presença de EDTA, foi observada uma fuga do corante vital mitocôndrias de MSC mitocôndrias. Se a transfe mitocôndriasr para GSCS é para ser analisada por microscopia, as células de glioblastoma destinatário deve também ser marcados com um corante vital. Os corantes celulares verde e azul (ver Materiais e Reagentes Table) foram preferidos como eles dão uma marcação celular mais homogênea, permitindo a reconstrução 3D a partir de imagens confocal.
Assim que o protocolo tenha sido validado pelo usuário com suas células específicas, rotulagem mitocôndrias será deixado de fora para estudos funcionais, para evitar possíveis vieses biológicos. Dose-resposta de análises sobre uma ampla gama de concentrações de mitocôndrias MSC, com diluições em série da preparação mitocôndrias, é aconselhável. De facto, deve notar-se que os efeitos biológicos para as mitocôndrias transferidos poderia ser conseguido, por concentrações baixas mitocôndria, na gama inferior de detecção por FACS ou imagiologia. Estes estudos funcionais, incluindo investigações sobre SGC metabolismo, proliferação e resposta a terapia, são realizados no dia seguinte otransferência de mitocôndrias.
Se MSC e GSCS são isolados a partir de diferentes dadores (com diferentes haplótipos de mtDNA), as mitocôndrias MSC transferidos pode ser monitorizado medindo as concentrações de MSC mitocondriais na GSCS segmentados. A discriminação entre o MSC e endógena SGC mtDNAs baseia-se na presença de SNPs, específico para cada tipo de célula, na região hipervariável D-loop de mtDNA. Por isso, entre as diversas aplicações da técnica MitoCeption, a possibilidade de transferir as mitocôndrias que alberga o ADN mitocondrial com diferentes haplótipos não só permite a detecção das mitocôndrias transferidos mas também fornece as ferramentas para estudar a biologia de manutenção mtDNA, incluindo a análise de exclusão de haplótipos.
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Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), com a qual CJ e ML.V. são filiados, entrou com um pedido de patente sobre a técnica MitoCeption (EP14306154.7).
Acknowledgments
Agradecemos Andrea Parmeggiani (L2C e DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), bem como os membros do laboratório para discussões úteis, Christophe Duperray para obter ajuda com a análise FACS, a instalação de imagem RIO Montpellier (MRI) para fornecer o ambiente adequado para FACS e microscopia confocal. BNM foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Labex Numev (convenção ANR-10-LabX-20). AB foi apoiado por uma bolsa de estudo de graduação da Universidade de Varsóvia e da União Europeia (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV é um cientista da equipe do Centro Nacional de Pesquisa Científica (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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