ממוקד<em> באתרו</em> גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

Summary

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Abstract

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Introduction

ארבעת החלבונים היסטון הליבה H2A, H2B, H3, ו- H4 ממלאים תפקידים מרכזיים הדחיסה, ארגון ותפקוד של כרומוזומים איקריוטיים. שני סטים של כל אחד היסטונים אלה יוצרים את octamer היסטון, סליל מולקולרי שמנתב את העטיפה של זוגות בסיסים ~ 147 של DNA סביב עצמו, בסופו של דבר וכתוצאה מכך ההיווצרות של הנוקלאוזום ^1. נוקלאוזום הם משתתפים פעילים במגוון תהליכים מבוסס כרומוזום, כגון הסדרת שעתוק גנים לבין ההיווצרות של euchromatin ו heterochromatin פני הכרומוזומים, וככזה הוא העיקר של מחקר אינטנסיבי במהלך העשורים האחרונים. מספר המנגנונים תואר שבאמצעותו נוקלאוזום ניתן להשפיע בדרכים שיכולים להקל על ביצוע של תהליכים ספציפיים – מנגנונים אלה כוללים שינוי posttranslational של שאריות היסטון, שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP, וארגון מחדש הנוקלאוזום ATP-עצמאיוהרכבה / פירוק ^{2, 3.}

השמרים ניצני שמר האפייה הוא אורגניזם מודל חזק במיוחד להבנת תפקוד היסטון אאוקריוטים. זו ניתן לייחס במידה רבה את הרמה הגבוהה של שימור אבולוציוני של חלבונים היסטון ברחבי eukarya תחום רמת המוכנות של שמרים למגוון ניסיוני גנטיים ביוכימיים מתקרב ^4. גישות Reverse-גנטיות בשמרים היו בשימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעות של מוטציות ספציפיות היסטון על היבטים שונים של ביולוגיה הכרומטין. עבור אלו סוגים של ניסויים הוא לעתים קרובות עדיף להשתמש בתאים בם ההיסטונים המוטציה באים לידי ביטוי מן הלוקוסים הגנומי מולדתם, כמו ביטוי מן פלסמידים אוטונומיים יכול להוביל לרמות תאיים החריגות של חלבונים היסטון (עקב מספרים שונים של פלסמידים בתאים) ו שינוי מקביל של הכרומטין environments, אשר בסופו של דבר יכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות.

כאן אנו מתארים טכניקה PCR מבוססת המאפשרת mutagenesis הממוקד של גני היסטון במקומות גנומי מולדתם שאינו דורשים צעד שיבוט ותוצאות בדור של המוטציה הרצויה (ים) ללא רצפי DNA אקסוגני שאריות בגנום. טכניקה זו מנצלת את המערכה ההומולוגית היעילה שמרים ויש לו כמה תכונות משותפות עם בטכניקות דומות אחרות שפותחו על ידי קבוצות אחרות – בעיקר Delitto Perfetto, אתר ספציפי גנומי (SSG) mutagenesis, שיבוט ללא אלל מבוסס PCR שיטות החלפה ^{5, 6, 7.} עם זאת, הטכניקה נתאר יש היבט זה עושה את זה במיוחד מתאים היטב mutagenesis של גני היסטון. בתאי שמרים הפלואידים, כל אחד ההיסטונים הליבה ארבעה מקודד על ידי שתי שאינוגני llelic ו הומולוגיים מאוד: למשל, H3 היסטון מקודדים על ידי גני HHT1 ו HHT2, ואת מסגרות הקריאה הפתוחות (ORFs) משני הגנים הן מעל 90% זהות ברצף. רמה גבוהה זו של הומולוגיה יכולה לסבך ניסויים שנועדו למקד ספציפי אחד הגנים שני קידוד-היסטון עבור mutagenesis. בעוד השיטות הנ"ל לעתים קרובות דורשים שימוש לפחות כמה רצפים בתוך ORF של גן המטרה לנהוג הומולוגיים, הטכניקה שאנו מתארים כאן עושה שימוש רצפים איגוף ORFs של גנים היסטון (אשר חולקים הרבה פחות הומולוגיה ברצף) עבור צעד רקומבינציה, ובכך להגדיל את הסבירות של מיקוד המוצלח של mutagenesis אל המוקד הרצוי. יתר על כן, באזורים ההומולוגיים שמניעים רקומבינציה יכולים להיות מאוד נרחבים, ובכך תורמים עוד יותר הומולוגי ממוקדים ויעיל.

Protocol

הערה: האסטרטגיה ניסיוני ממוקד mutagenesis גנים היסטון באתרו כוללת מספר שלבים (שהעיקריים בהם פורטו איור 1). צעדים אלה כוללים: (1) החלפת גן היסטון היעד עם גן URA3, (2) דור וטיהור של מוצרי ה- PCR המתאימים שני שברים חופף חלקי של גני היסטון היעד באמצעות פריימרים מ…

Representative Results

אנו מתארים את הדור של אלל hht2 לבטא חלבון מוטנטי H3 היסטון מחסה חילוף במיקום 53 מתוך ארגינין חומצת גלוטמית (H3-R53E מוטציה) בתור דוגמה מייצגת של ממוקדת באסטרטגיה mutagenesis באתרו. יצרנו זן שב…

Discussion

הרמה הגבוהה של הומולוגיה ברצף בין שני גנים שאינם אללים שקוד לכל אחד החלבונים היסטון ארבע ליבות בתאים הפלואידים cerevisiae ס יכול לייצג אתגר עבור חוקרים המבקשים למקד ספציפית אחת משני הגנים עבור mutagenesis. שתואר לעיל מתודולוגיות mutagenesis שמרים, כולל Perfetto Delitto, אתר ספציפ…

Materials

1 kb DNA Ladder (DNA standards)	New England BioLabs	N3232L
Agarose	Sigma	A5093-100G
Boric Acid	Sigma	B0394-500G
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	R0192
EDTA solution (0.5M, pH 8.0)	AmericanBio	AB00502-01000
Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E4884-500G
Lithium acetate dihydrate	Sigma	L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler	BioRad	170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG)	Sigma	P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5X buffer	Fisher Scientific	50-443-960
Salmon sperm DNA solution	ThermoFisher Scientific	15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form)	Sigma	T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate	Sigma	236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose)	AmericanBio	AB00985-00100
Taq Polymerase and 10X Buffer	New England BioLabs	M0273X
Toothpicks	Fisher Scientific	S67859
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	AmericanBio	AB14043-01000
a-D(+)-Glucose	Fisher Scientific	AC170080025	for yeast media
Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	for yeast media
Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-2	for YPD medium
Yeast Extract	Fisher Scientific	DF0127-17-9	for YPD medium
4-aminobenzoic acid	Sigma	A9878-100G	for complete minimal dropout medium
Adenine	Sigma	A8626-100G	for complete minimal dropout medium
Glycine hydrochloride	Sigma	G2879-100G	for complete minimal dropout medium
L-Alanine	Sigma	A7627-100G	for complete minimal dropout medium
L-Arginine monohydrochloride	Sigma	A5131-100G	for complete minimal dropout medium
L-Asparagine monohydrate	Sigma	A8381-100G	for complete minimal dropout medium
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate	Sigma	A6683-100G	for complete minimal dropout medium
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880-100G	for complete minimal dropout medium
L-Glutamic acid hydrochloride	Sigma	G2128-100G	for complete minimal dropout medium
L-Glutamine	Sigma	G3126-100G	for complete minimal dropout medium
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma	H8125-100G	for complete minimal dropout medium
L-Isoleucine	Sigma	I2752-100G	for complete minimal dropout medium
L-Leucine	Sigma	L8000-100G	for complete minimal dropout medium
L-Lysine monohydrochloride	Sigma	L5626-100G	for complete minimal dropout medium
L-Methionine	Sigma	M9625-100G	for complete minimal dropout medium
L-Phenylalanine	Sigma	P2126-100G	for complete minimal dropout medium
L-Proline	Sigma	P0380-100G	for complete minimal dropout medium
L-Serine	Sigma	S4500-100G	for complete minimal dropout medium
L-Threonine	Sigma	T8625-100G	for complete minimal dropout medium
L-Tryptophan	Sigma	T0254-100G	for complete minimal dropout medium
L-Tyrosine	Sigma	T3754-100G	for complete minimal dropout medium
L-Valine	Sigma	V0500-100G	for complete minimal dropout medium
myo-Inositol	Sigma	I5125-100G	for complete minimal dropout medium
Uracil	Sigma	U0750-100G	for complete minimal dropout medium
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500	for complete minimal dropout medium
Yeast Nitrogen Base	Fisher Scientific	DF0919-07-3	for complete minimal dropout medium
5-Fluoroorotic acid (5-FOA)	AmericanBio	AB04067-00005	for  5-FOA medium