Abstract
הביולוגיה בונה גישת הביולוגיה הסינטתית בדרך ליצירת חיים מלאכותיים לערב את ההרכבה מלמטה למעלה של חומרים ביולוגיים או מלאכותיים. גישות כאלה קיבלו תשומת לב רבה במחקר על קו התפר שבין החיים והחומר הדומם שימשו לבניית תאים מלאכותיים בשני העשורים האחרונים. בפרט, הענק שלפוחית (Gvs) לעתים קרובות שמשה קרום תא מלאכותי. במאמר זה, אנו מתארים את הכנת Gvs encapsulating microspheres ארוז מאוד כמודל של תאים המכילים ביומולקולות מרוכז מאוד. Gvs הוכן באמצעות שיטת צנטריפוגה מים ב-שמן תחליב פשוטה. באופן ספציפי, homogenizer שמש ת חלב בתמיסה מימית המכילה את החומרים להיות במארז ואת שמן המכיל פוספוליפידים מומסים, ואת אמולסיה וכתוצאה מכך הייתה מרושת היטב על פני השטח של אחר בתמיסה מימית. מערכת שכבתית אז centrifuged to ליצור את Gvs. שיטה חזקה זו שימשה לתמצת חומרים הנעים בין מולקולות קטנות microspheres.
Introduction
למשהו הקונסטרוקטיבי, או סינטתית, גישת הביולוגיה היא שדר מרתק לחקור את הגבול שבין החי לבין דומם משנה. בגלל התא הוא היחידה המינימאלית הנדרש עבור חיים כפי שאנו כיום מבינים אותה, חוקרים שונים ניסו לבנות תאים מלאכותיים מן פשוטים, כימיקלים שאנו מבינים היטב כך תופעות המתרחשות בתוך תאים מלאכותיים כגון ניתן ללמוד, עם המטרה הסופית של הבהרה מקור החיים ולומדים את הפונקציות הבסיסיות של תאים חיים 1, 2, 3. בפרט, שלפוחית 4, שהן microcompartments הכדורית עשויות מולקולות amphiphilic ויכולה לתמצת מולקולות ביולוגיות כגון חלבונים 5, 6 ו- DNA 7, 8, 9,= ילדה "Xref"> 10, לעיתים קרובות שימשו כמודלים של ממברנות ביולוגיות.
שלפוחית יכול להיות מסווגת קטן (המוגדרים כבעלי בקוטר של <100 ננומטר), גדול (קוטר <1 מיקרומטר), או ענק (קוטר> 1 מיקרומטר). שלפוחית ענקית (Gvs) נחקרה בהרחבה בגלל שהם דומים תאי חיים בגודל, צורה, מבנה. בשל גודלו של Gvs, שינויים מורפולוגיים בממברנות GV ניתן להבחין בקלות בזמן אמת תחת מיקרוסקופ אופטי.
מספר שיטות להכנת Gvs דווחו 11, כולל השיטה הידרציה 12, 13, שיטת ההפשרה להקפיא 14, שיטת electroformation 15, 16, ושיטת מכשיר fluidic 17, 18. עם זאת, encapsulating חלבוני MACROM האחרolecules ב Gvs בריכוזים גבוהים באמצעות שיטות אלה קשה. בפרט, זה מאוד מאתגר לתמצת חומרים ביולוגיים בכמות מספקת (20-30% בנפח) לחקות את הסביבה הצפופה בתוך תאים 19, 20. כדי ליצור Gvs מיידי, וייץ ועמיתים לעבודה הקימה מים ב-שמן (w / o) צנטריפוגה אמולסיה שיטה 21, 22. לשיטה זו חמש תכונות חשובות. ראשית, משום Gvs שהכין שיטת הזה יש חוסר lamellarity 23, 24, ממברנות שלהם הם כל כך רזה כי הם יכולים להיות מעוות בקלות. דפורמציה קרום GV המושרה על ידי FtsZ (חלבון חלוקת תא חיידק), טובולין, מקרומולקולות אחרות נחקרה 25, 26, 27, 28, ו צפינו polyhe עיוות Dron דמוי של ממברנות GV המושרה על ידי אנקפסולציה של microspheres 29, 30. שנית, ניתן להכניס חלבונים בממברנה לתוך קרום שלפוחי בשיטה זו, אם כי בקושי 31. לדוגמא, קבוצת Yomo השתמשה בשיטה זו כדי לחקור את הסינתזה במבחנה ופעילות יוצרים נקבובית של החלבון הקרומי α-המוליזין 32. שלישית, אפשר ליצור Gvs הסימטרית שבה רכיבי השומנים של העלונים הפנימיים וחיצוניים 22 שונים. לדוגמה, Whittenton et al. Gvs הסימטרית שנוצרה עם שומנים קטיוני בעלון הפנימי לתמצת polynucleotides הטעון שלילי, ועם שומנים ניטראליים על העלון החיצוני כדי להקטין רעילות ו -33 הסלולר ספיגים ספציפי. רביעית, שבר הריכוז והנפח של חומרים בתוך Gvs יכול להיות גבוה יחסיתs = "Xref"> 28, 34. החמישית, סוגי חומרים מרובים יכולים להיות במארז 35. לדוגמה, Nishimura et al. במארז מערכת תרגום-שעתוק במבחנה לתוך Gvs והשתמשתי במערכת לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתוך Gvs 36. תכונות אלה חמש לעשות w / o צנטריפוגה אמולסיה שיטה הכרחית ליצירה Gvs מחק תאים.
בעבודה הקודמת, Gvs שנוצר על ידי צנטריפוגה נאספו באמצעות מזרק מצויד במחט נירוסטה באורך 16 G המכיל חלק בתמיסה מימית הסופי 22. בידי טכנאים מנוסים, בשיטה של איסוף זה יכול לגרום בקלות זיהום של GV עם חלק מהשמן. במחקר זה, השתמשנו פרוטוקול צנטריפוגה תחליב w / o שפותח על ידי קבוצת Yomo 23, 37,שבו Gvs זרז נאסף דרך חור נפתח בתחתית הצינור צנטריפוגות שבו הם מוכנים. הכנו Gvs encapsulating 1.0 מיקרומטר microspheres, הדומות בגודלן אברונים תאיים. שימוש microspheres אפשר לנו להעריך ריכוזם ידי חישוב שבריר הנפח שלהם. הקמת שיטה להכנת Gvs שבו חומרים ארוזים בצפיפות היא צעד חשוב ליצירת תאים מלאכותיים. כדי לאשר את התועלת של הפרוטוקול שלנו עבור סוגים שונים של חומרים פנימיים, גם הראינו כי GFP ו מולקולת ניאון מסיס במים קטן (uranine) יכולים להיות גלום Gvs.
Protocol
1. הכנת Gvs ידי W / O אמולסיה צנטריפוגה השיטה
- הכן פתרון המניות של 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC, 25 מ"מ) פתרון המניות של 1,2-dihexadecanoyl- האדום טקסס SN -glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium מלח (אדום טקסס DHPE, 0.20 מ"מ) כלורופורם ולאחסן את פתרונות המניה ב -20 ° C.
- כן פתרון שמן.
- ליצור סרט שומנים על פני השטח הפנימיים של בקבוקון זכוכית 5 מיליליטר על ידי מתאדה תערובת של פתרון מניות dOPC (51.0 μl ואת פתרון מניות טקסס האדום DHPE (19.2 μl) תחת זורם גז חנקן.
- דגירה הסרט בלחץ מופחת לילה ולאחר מכן להוסיף 1.0 מ"ל של פרפין נוזלי (0.86-0.89 גרם / ס"מ 3) כדי בקבוקון. עוטפים את הבקבוקון בנייר אלומיניום דגירה אותו ב 80 מעלות CO / N במנוחה. הריכוזים הסופיים של dOPC וטקסס האדומה DHPE הם 1.3 ו -3.8 x 10 - 3 מ"מ, בהתאמה, ואת dOPC: יחס הטוחן טקסס האדומה DHPE הוא 100: 0.3.
- הכן את הפיזור מהימי הפנימי.
- בעוד microtube 1.5 מיליליטר לוט, לערבב 237.5 μl של פיזור של 1.0 מיקרומטר microspheres nonfluorescent (2.5% בנפח) ו -12.5 μl של פיזור של 1.0 microspheres פלורסנט מיקרומטר (2.5% בנפח); הדבר מקביל ל -95: יחס 5 (V / V) של nonfluorescent כדי microspheres ניאון.
- להוסיף 64 מ"ג של סוכרוז ואחריו 125 μl של פתרון טריס שנאגרו (TBS, 1 M) ו 875 μl של מים ללא יונים. שבר הנפח הסופי של microspheres הוא% בנפח 0.5, ואת הריכוזי הסופי של טריס-HCl (pH 7.5) ו סוכרוז הם 0.1 ו 0.15 מ ', בהתאמה.
- וורטקס microtube למשך 30 שניות ולאחר מכן sonicate אותה במשך 10 דקות.
- הכן את הפתרון מהימי החיצוני.
- לאחר הכנה של 10 מ"ל של פתרון שנאגרו טריס (0.1 M Tris-HCl [pH 7.5], 0.15 M glucOSE) באותו ההליך כמו תקשורת מימית פנימית, מקום 1 מיליליטר של הפתרון בתוך 1.5 מיליליטר הלוט microtube. וורטקס microtube למשך 30 שניות ולאחר מכן sonicate אותה במשך 10 דקות.
- כן aw / o תחליב המכיל microspheres.
- מערבבים 1 מ"ל של הפתרון שמן (dOPC המכיל פרפין נוזלי טקסס האדום DHPE) עם 300 μl של בתמיסה מימית הפנימי בתוך 1.5 מ"ל microtube.
- ת חלב שני רכיבי microtube באמצעות homogenizer מכאני (תועמלן עם להבים כי לסובב במהירות גבוהה) פעלה 10,000 סל"ד במשך 2 דקות ב RT.
- לזרז את Gvs.
- בעדינות שכבת 300 μl של אמולסיה w / o על פני השטח העליונים של 1 מ"ל של תמיסה מימית החיצוני ב 4 מעלות צלזיוס 1.5 מ"ל לוטות microtube. לצנן את microtube במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- אסוף את Gvs.
- מיד לאחר ציננו את microtube,צנטריפוגות אותו 18,000 x ז למשך 30 דקות. השג את Gvs זירז ידי פירסינג התחתון של microtube עם הנעץ ואיסוף אגל אחד בתוך microtube מעוקר 1.5 מ"ל.
- לדלל את זירז GV צַחצוֹחִית 10-100 לקפל לפי נפח עם בתמיסה מימית החיצוני אם Gvs השיג מתקבלים בכמויות גדולות מספיק כדי לגרום תצפית קשה.
2. תצפית מיקרוסקופית של Gvs
- כן דגימה במיקרוסקופ.
- מניח תא דגירה דבק ב תגובת שרשרת פולימראז באתרו כלאה (גודל תא 9 מ"מ x 9 מ"מ x 0.3 מ"מ עובי) על גבי זכוכית מכסת מיקרוסקופ.
- שימוש micropipette, פיקדון של 25 μl של בדילול זירז Gvs על אזור הדגימה ומכניסים מיד אחר מכסה זכוכית (כ 0.15 מ"מ עובי) על גבי תא הדגירה.
- הקונטראס התערבות הפרש שיאתמונות מיקרוסקופיה t של Gvs.
- תמונות מיקרוסקופיה שיא של שלפוחית עם מיקרוסקופ (10X, 20X, ו 40X מטרות) מצויד מנורת הלוגן 12V100WHAL-L.
- עריכת תצפיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- הכנס יחידות במראה הקרינה U-FBNA ו- U-FMCHE לתוך המיקרוסקופ. התאם את היחידות עם 470-495 ננומטר 565-585 ננומטר מסנן עירור, בהתאמה, ועם מסנני פליטה שמשדרים 510-550 ננומטר ואור 600-690 ננומטר, בהתאמה.
Representative Results
שיטת צנטריפוגה תחליב w / o מודגמת photographically ו סכמטי באיור 1. התמונה סכמטי באיור 1 מצביע על כך הקובע החשוב ביותר של ההצלחה של שיטה זו הוא כי המשקל הסגולי של בתמיסה מימית הפנימי חייב להיות גדול יותר מזה של בתמיסה מימית החיצוני, כך Gvs יהיה להאיץ במהלך צנטריפוגה. בנוסף, ההיווצרות בשכבת שומנים בממשק w / o דורשת שהמערכת להיות מקוררת למשך 10 דקות לאחר אמולסיה מצוי בשכבת מימיית הפתרון החיצוני. בגלל צורת Gvs ידי העברת טיפות תחליב פני ממשק w / o, הלחצים האוסמוטי בשכבות מהימיות הפנימיות וחיצוניות חייבים להיות זהים. כמו ניסוי ביקורת, גם אנחנו Gvs מוכן המכיל לא microspheres באמצעות תהליך שניתן לראות בתרשים 1 ושלב 1.3, למעט העובדה בתמיסה מימית הפנימי היההכינו בלי microspheres.
אוסף של Gvs זירז לאחר צנטריפוגה מוצג באיור 2. בנוסף בשלב שקוף למחצה בתחתית מאוד של microtube, אנחנו גם ציין שלב ביניים לבן, עכור בתמיסה מימית החיצוני (איור 2 א). שלב ביניים זה היה עשיר מצבורים של microspheres ושמן, ואילו השלב התחתון הכיל את Gvs. לכן, לאחר הפירסינג התחתון של microtube עם (איור 2b) נעץ, אספנו את הירידה הראשונה בלבד (איור 2 ג), אשר הכילה כמויות אדירות של Gvs. חשוב לוודא כי לא יותר משתי טיפות נאספות; ירידות נוספות עשויות להכיל מצבורים של microspheres ושומנים, אשר יגרמו לצפיפות נמוכה יותר של Gvs. פיזור שלפוחי המתקבל לעתים קרובות הכיל חומרים במארז החיצוני של Gvs משום Gvs often קרע במהלך צנטריפוגה. כדי להשיג Gvs בלבד, שיטת מיון כגון דיאליזה, סינון ג'ל, או תא מופעל קרינת מיון צריך להיבחר, בגלל הגדלים של החומרים האוטמים. במידת הצורך עם התכלית שלשמה Gvs זירז הם לשמש, הם יכולים להיות מדולל עם בתמיסה מימית החיצוני. במקרים מסוימים, בשלב ביניים מורחב אל החלק התחתון של הצינור, דבר המצביע על כך כל שלפוחית שהיוותה התקיימו יחד על ידי השמן.
השגנו תמונות מיקרוסקופ מיקרוסקופ פלואורסצנטי התערבות דיפרנציאלית של Gvs ללא microspheres (איור 3 א, 3 ב) ועם microspheres (איור 3 ג -3 ו). עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 23, 37, Gvs עם lamellarity הנמוכה נוצר על ידי הפרוטוקול שלנו. ליפידים מצומדות עם טקסס האדום DHPE, אשר פולט פלורסנט אדוםדעך, שימשו כך היווצרות שלפוחית ניתן היה לאשר באופן ישיר על ידי ויזואליזציה של קרום דק. של 160 Gvs כי השגנו, 55 microspheres כמוס ו -105 היו ריקים, מתן יחס של אנקפסולציה של 34%.
אנחנו נקבע את שבר נפח (φ,% בנפח) של microspheres ב Gvs באמצעות השיטה הבאה. מכיוון שכל GV מכיל עשרות לכמה מאות microspheres, לספור את כל microspheres תחת מיקרוסקופ אופטי הוא מאתגר. לכן, אנו ערבבנו את microspheres 1.0 מיקרומטר nonfluorescent עם כמות קטנה של microspheres פלורסנט, אשר נספרו באופן ידני תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המספר הכולל (N) של microspheres הכמוס חושב על ידי הכפלת המספר (n) של microspheres פלורסנט נספר באופן ידני על ידי 20 (מבוסס על 95 המקורית: [v / v] 5 היחס של nonfluorescent כדי microspheres ניאון). הערך של66; אז הוערך Nv 100 / V, כאשר V הוא הנפח של microspheres ו- V הוא הנפח של GV הפרט. נציין כי אמידה של N מ n מוליד טעויות סופר, וטעויות אלה חייבים להילקח בחשבון בעת חישוב φ. שווי φ נאמד בין ה- N, אשר חושבה ישירות כמו 20 n, וזה בתורו הביא את ההסתברות כי φ מייצג באופן מדויק את הערך האמיתי הוא <50%. למעשה, N משתנה במידה מסוימת סביב 20 n, כך שאנחנו צריכים לשקול את זה כמו 20 (n ± i), כאשר i הוא טעות n. הערכנו אני בסדר הזה הסתברות של n ± אני יכול להיות יותר מ -50% מתקבלים על הסמך של התפלגות פואסונית. הערכנו i, אשר בתורו אפשרה לנו לחשב 20 (n ± i) וערכים של66; שכללה ספירת שגיאות עבור Gvs בקטרים של 10 ו -15 מיקרומטר (טבלה 1). על פי נוהל זה, את החלק היחסי של microspheres נפח של GV שמוצג איור 3c הוערך בטווח 11 ± 3 כרך%. הדיוק של שבר הנפח המחושב היה 10-30%.
התוצאות שלנו מעידות כי ארזנו בהצלחה 1 מיקרומטר microspheres ב Gvs בכל חלק בנפח גבוה. היינו גם יכולים לתמצת חומרים אחרים לתוך 100 Gvs mol% dOPC באמצעות אותו בתמיסה מימית החיצונית באותו פרוטוקול (איור 4). באופן ספציפי, Gvs המכיל 0.1 מיקרומטר microspheres הוכנו מפתרון טריס שנאגרו המכיל 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 M סוכרוז, ו -0.5 כרך% microspheres פלורסנט באמצעות פרוטוקול המתואר עבור Gvs המכיל microspheres 1.0 מיקרומטר ( איור 4 א). בעקבות הפרוטוקול המתואר abovדואר, Gvs dOPC המכיל GFP (0.1 M Tris-HCl [pH 7.5], 0.15 M סוכרוז, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל GFP; איור 4) ו Gvs המכיל uranine (0.1 M Tris-HCl [pH 7.5], 0.15 M סוכרוז, ו -30 מיקרומטר uranine; איור 4C) הוכנו גם.
| n | N | φ (10 מיקרומטר קוטר) | φ (15 מיקרומטר קוטר) |
| 3 | 60 ± 20 | 6.0 ± 2.0 | 1.8 ± 0.6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8.0 ± 2.0 | 2.4 ± 0.6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3.0 ± 0.6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3.6 ± 1.2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0.9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| .א טעויות נקבעו כמתואר בטקסט; n = מספר microspheres נספר באופן ידני; N = מספר כולל של microspheres הכמוס. | |||
שברים מספרים ונפח (φ,% בנפח) של מיקרוסכמות a: טבלה 1. .א טעויות נקבעו כמתואר בטקסט; n = מספר microspheres נספר באופן ידני; N = מספר כולל של microspheres הכמוס.
איור 1: Ch זרימה אמנות סכמטי תיאור של שיטת צנטריפוגה אמולסיה W / O. (א) פתרון שמן מורכב dOPC וטקסס האדום DHPE (100: 0.3 יחס טוחן) פרפין נוזלי. (ב) פיזור מימי פנימי המורכב סוכרוז microspheres במאגר טריס-HCl. (ג) בתמיסה מימית שתמנה הגלוקוז חיץ טריס-HCl. תערובת (ד) של 1 מיליליטר של תמיסת שמן 300 μl של פיזור מימי פנימי. (ה) תחליב עם homogenizer (10,000 סל"ד, 2 דקות). (ו) תחליב w / o. Layering (ז) של 300 μl של אמולסיה על 1 מ"ל של תמיסה מימית החיצוני. (ח) זירז Gvs רק לאחר צנטריפוגה. (I) סכמטי תיאור של עקרון השיטה צנטריפוגה תחליב w / o. החץ השחור מציין את הכיוון של אצה צנטריפוגלי. .jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פירסינג של microtube. (א) זירז Gvs רק לאחר צנטריפוגה (מתואר גם 1h איור). האליפסה האדומה מציינת את האגל של פיזור GV זרז. (ב) פירסינג של microtube עם נעץ. הגלולה המכילה את Gvs הושגה על ידי פירסינג microtube קרוב לתחתית עם נעץ ואיסוף טיפות מהחור. (ג) אגל של Gvs זירז (מסומן על ידי צהוב חץ) פיזור מדולל עם בתמיסה מימית החיצוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
together.within-page = "1"> 
איור 3: תמונות מיקרוסקופיות של Gvs. (א) הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות תמונת מיקרוסקופ של GV ללא microspheres. הקוטר של GV היה כ -10 מיקרומטר. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ב) תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של GV ללא microspheres. הקרינה האדומה נפלטת על ידי טקסס האדומה DHPE. (ג) תמונת מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת של GV המכיל microspheres. (ד) הקרינה מיקרוסקופ תמונה של 1.0 מיקרומטר microspheres (microspheres carboxylate י.ג.) בתוך GV. מספר microspheres פלורסנט נספר (n) היה 6. אמדנו את שגיאות (i = 2) מבוסס על התפלגות פואסון. אז הערכנו המספר הכולל של microspheres הפנימי (N = 20 (n ± i)) היה 120 ± 40. זה חושב כיGV הכיל 1.0 מיקרומטר microspheres בכל חלק נפח (φ = Nv 100 / V) של כ 11 ± 3 כרך%, כאשר V הוא נפח של microspheres ו- V הוא נפח של Gvs. (ה) פלואורסצנטי מיקרוסקופיה תמונה של קרום GV. הקרינה האדומה נפלטת על ידי טקסס האדומה DHPE. (ו) מוזג תמונה של תמונות לוחות D ו- E. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות עם ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של Gvs עם שוני חומרי Encapsulated: איור 4. מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (למעלה) מיקרוסקופ פלואורסצנטי (למטה) תמונות שלGvs המכיל (א) 0.1 מיקרומטר microspheres, (ב) GFP, ו- (ג) uranine. ברי סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
Gravities הספציפי של מדיום פיזור מהימי הפנימי ואת בתמיסה מהימית החיצונית חייב להיות שנבחר בקפידה. עבור w / o תחליב כדי לזרז לתוך בתמיסה מימית החיצוני במהלך צנטריפוגה, המשקל הסגולי של המדיום פיזור מימית הפנימי חייב להיות גדול יותר מזה של בתמיסה מימית החיצוני. ניסינו להכין Gvs באמצעות פתרונות פנימיים וחיצוניים ללא סוכרים, אבל אנחנו לא השגנו Gvs בתנאים אלה, משום בתמיסה מהימית הפנימית לא הייתה מספיק מסה כדי לחצות את ההתערבות בין שני השלבים. אם יש הבדל הלחץ האוסמוטי גדול בין שני פתרונות, Gvs כי לזרז לתוך בתמיסה מימית החיצוני עשוי להתכווץ או קרע. לכן, הלחץ האוסמוטי בתוך ומחוץ Gvs חייב להיות שווה. כדי להשיג זאת, השתמשנו סוכרוז כפי מומס בפיזור וגלוקוז מהימיים הפנימיים כמו מומס בתמיסה מהימית החיצונית; סוכרים הן היו באותו ריכוז. מלח שניss = "Xref"> 22 והסוכר 23, 35, 38 שמשו למטרות כאלה, אבל סוכר בדרך כלל מועסק כי זה פחות רעיל ועוד מסיס מאשר מלח. עם זאת, אם סוכר יותר מדי מתווסף, Gvs שעלול לבוא במגע עם החלק התחתון של זכוכית המכסה וקריסה. ישנן מספר אסטרטגיות להימנעות זו. אסטרטגיה אחת היא להפחית את ההבדל הסגולי בין התמיסות מימיות הפנימיות וחיצוניות כך Gvs לזרז בתנאים קלים; במיוחד, supernatant של פיזור GV זירז ניתן להחליף עם פתרון זהה בתמיסה מימית פנימית כדי לצמצם את האפשרות של קרע שלפוחי ידי הדבקה על זכוכית המכסה כתוצאה הציפה. אסטרטגיה נוספת היא precoat הוא משקפי כיסוי עם סרט שומנים דק 29.
הכנת דגירה תקינה של התחליב הםחָשׁוּב. השתמשנו פרפין נוזלי כדי להכין את הפתרון השמן. מינרליים שמן 26, 31, 21 dodecane, 33, ו squalane 33, 39 גם משמשים לעתים קרובות כמו שמנים ממסים. מאחר וחומרים אלה משתנים משקל סגולי, צמיגות, ואת מתח הפנים, מספרים שונים של שלפוחית להיווצר גם כאשר אותם התנאים צנטריפוגה משמשים 33. כדי להשיג את השלפוחית עם תכונות היעד, זה הכרחי כדי לייעל את gravities ו viscosities הספציפיים של תמיסות מימיות הפנימיות וחיצוניות וכן הכנת acceleration.For צנטריפוגלי של שלב הנפט, דגירה חייבת להתרחש בטמפרטורה גבוהה בתוך יבש הסביבה כגון באינקובטור או סופג לחות. במחקר זה, אנו חממנו את פרפין הנוזל 80 ° C לפזר תוספת שומני molecules.In לחלוטין, התחליב צריךלהיות מוכן רק לפי הצורך ומיד צריך להיות נתון צנטריפוגה כי זה לא יציב רק אחרי שהוא מוכן ואת w / o טיפות הפתיל בקלות אחד לשני. התחליב ניתן להכין בכמויות גדולות על ידי sonication, vortexing, או קשה. עם זאת, באמצעות homogenizer מאפשר הכנה מהירה של כמויות גדולות של תחליב תחליב קל בשמן עם צמיגות גבוהה. כמו כן, חשוב כי התחליב להיות שכבתי על בתמיסה המימית החיצונית בעדינות במהירות ולאחר מכן מקורר על 4 מעלות צלזיוס. כדי לקצר את הזמן בין תחליב ו צנטריפוגה, מערכת בתמיסה מהימית-חיצוני שמן ניתן prechilled לפני אמולסיה מצוי בשכבה אותו, ואת המערכת כולה ניתן centrifuged אז immediately.If העכירות הלבנה מופיעה מהר יותר או לאט יותר מרגיל, המכנים homogenizer יש לשטוף ביסודיות כדי להסיר דטרגנטים ניקוי. בנוסף, לפני התחליב, הפתרון השמן, בתמיסה מימית פנימית, מתחלב חייב להיות returned לטמפרטורת החדר.
אצת צנטריפוגלי נכונה היא גם חשובה. על ידי centrifuging ב 18,000 x גרם, הצלחנו להכין Gvs עם חומר פנים בודד במארז בריכוז גבוה. כאשר אנקפסולציה של חומרים מרובים נדרש, עדיף להפחית את האצת צנטריפוגלי. לדוגמא, מערכת הרכבה תקטין encapsulating שבע תרכובות הושגה עם צנטריפוגה ב פחות מ 350 x g 35. במקרים בהם צנטריפוגה אינה רצויה, Gvs ניתן להשיג על ידי התאמת ריכוז סוכר או על ידי מזרז התחליב תחת השפעת המסה שלו עצמו 38, 40, 41.
השיטה דיווחה יש בזאת שתי מגבלות עיקריות. האחת היא כי מולקולות שמן (פרפין, במקרה הזה) יכול להיות solubilized בקרום GV, כפי שצויין על ידי Weitz הקבוצה 21. כאשר החדרת חלבון הממברנה לתוך קרום GV היא רצויה, את ההשפעות של מולקולות שמן שיתוף קיימת על החלבון יש לקחת בחשבון. המגבלה השנייה היא הווריאציה של שבר נפח. במחקר זה, אנו מעריכים כי נפח שברים של microspheres ב Gvs נע בין% בנפח 4-30; שברים נפח לא היו זהים שבר נפח של בתמיסה מימית הפנימי משמש להכנת GV. למרות שהצלחנו לתמצת microspheres ב Gvs בכל חלק נפח מספיק גבוה להסתכלות במיקרוסקופ, שיטה זו אינה מתאימה להכנת Gvs עם חלוקה שבר נפח אחידה. זה כבר דווח כי חלוקת נפח שברים microsphere משתנה במהלך צנטריפוגה 34.
שיטת צנטריפוגה תחליב w / o משמשת בדרך כלל להיווצרות Gvs המכיל חומרים כמוסים. עם זאת, דיווחים מעטים תיארו את pפיצוי של Gvs encapsulating חומרים microscale 34, 42. לאחרונה, רובוטים מולקולריים המכילים מכשיר ה- DNA במארז או התקן מולקולרי נבנו 43, 44. Gvs עם תאים הם הבחירה הראשונה עבור סוגים אלה של יישומים; ולכן, טכניקות, כשלנו, שיכול לשמש עבור encapsulating microspheres ו microspheres המגנטיים עם functionalization משטח המגוון ניתן צפוי להיות שימושי 44.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים טומוקו ימגוצ'י עבור ציור התמונה סכמטי באיור 1. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט Okazaki ORION המכון Okazaki עבור אינטגרטיבית Bioscience של theNational המכונים למדעי הטבע (מהנינג'ות); על ידי פרויקט מרכז אסטרוביולוגיה (לא AB281010.) של מהנינג'ות; על ידי גרנט ב- Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים (סידור דינמי מערכות biomolecular ליצירת פונקציות משולבות) מאגודת יפן לקידום המדע (JSPs) (לא 25,102,008.); על ידי גרנט ב- Aid למדענים צעירים (B) (כדי KK, לא 15K17850.) מ JSPs; andby מענק-in-Aid למחקר פעילותן של חברות ההזנק (כדי YN, לא. 15H06653) מ JSPs. תמיכה נוספת מסופקת על ידי מענק מטעם מכון נוגוצ'י, מענק מטעם קאו הקרן לאמנויות ומדעים, ומענק ממי Kurita וסביבה הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L. Polymerase chain reaction in liposome. Chem Biol. 2 (10), 677-682 (1995).
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
