Abstract
건설적인 생물학 및 인공 생명을 만드는 합성 생물학 접근 방식은 생물학적 또는 비 생물학적 물질의 상향식 (bottom-up) 어셈블리를 포함한다. 이러한 접근 방식은 생활과 무생물 문제 사이의 경계에 대한 연구에 상당한 관심을받은 지난 20 년 동안 인공 세포를 구성하는 데 사용되었다. 특히, 거대 소포 (GVS)는 종종 인공 세포막로서 사용되어왔다. 본 논문에서는 고도로 응축 된 생체 분자를 포함하는 셀의 모델로 높은 포장 마이크로 캡슐화 GVS의 준비에 대해 설명합니다. GVS 간단한 유 중수 에멀젼을 원심 분리 방법에 의해 제조 하였다. 즉, 균질의 물질이 캡슐화 함유하는 수용액에 용해 인지질을 함유하는 오일을 유화하는 데 사용하고, 생성 된 에멀젼을 다른 수용액의 표면 상에 조심스럽게 적층했다. 계층화 된 시스템은 t을 원심 분리O를 GVS를 생성합니다. 이 강력한 방법은 작은 분자 미립자에 이르는 물질을 캡슐화하기 위해 사용되었다.
Introduction
건설적인, 또는 합성 생물학 접근 방식은 생활 사이의 경계를 탐구하고 문제를 무생물을위한 매력적인 수단이다. 셀은 생활에 필요한 최소 단위이기 때문에 우리는 현재를 이해, 다양한 연구자 인공 세포 내에서 발생하는 현상을 연구 할 수 있도록 해명의 궁극적 인 목표와 함께, 간단한, 잘 알려진 화학 물질 인공 세포를 구성하는 시도 삶의 기원과 살아있는 세포 1, 2, 3의 기본적인 기능을 연구. 특히, 4 소포 양친 매성 분자로 이루어지는 구형의 미세 구획은 이러한 단백질 5, 6, DNA 7, 8, 9 등의 생체 분자를 캡슐화 할 수있는,아가씨 = "외부 참조"> (10)는 종종 생체막의 모델로 이용되고있다.
소체는, 크게 (직경 <1 ㎛) 또는 거 (직경> 1 ㎛) (<100 nm의 직경을 갖는 것으로 정의 됨) 소형으로 분류 될 수있다. 들은 크기, 형상 및 구조로 살아있는 세포 유사하기 때문에 거대 소체 (GVS)은 광범위하게 연구되어왔다. GVS의 크기에 의해, GV 멤브레인의 형태 학적 변화를 용이하게 광학 현미경으로 실시간으로 관찰 할 수있다.
GVS 제조 방법은 여러 가지 수화 제 12, 13, 동결 융해 법 (14), 전기 주조 방법 (15, 16), 상기 유체 기기에있어서 17, 18를 포함하여 11보고되었다. 그러나, 캡슐화 단백질 및 기타 macrom이러한 방법에 의한 고농도 GVS에 olecules 어렵다. 특히, 셀 (19), (20) 내부의 혼잡 환경을 모방하기에 충분한 양 (20 내지 30 부피 %)의 생체 물질을 캡슐화하는데 매우 도전적이다. GVS 즉시, 바이 츠 동료 유화 원심 분리 방법 (21, 22) (W / O) 유중 설립 형성한다. 이 방법은 다섯 가지 중요한 기능을 가지고 있습니다. 이 방법에 의해 제조 GVS 낮은 lamellarity 23 (24)을 가지고 있기 때문에 첫째, 세포막은 쉽게 변형 될 수있는 정도로 얇다. FtsZ (세균 세포 분열 단백질), 튜 불린 및 기타 거대 분자에 의해 유도 GV 막의 변형은 27, 26, 25 (28)을 연구하고 있으며, 우리는 polyhe 관찰 구체 (29) (30)의 밀봉에 의한 GV 막의 dron 형상 변형. 둘째, 막 단백질 31 어려움 불구이 방법에 의해 소포 막에 삽입 될 수있다. 예를 들어, Yomo 그룹은 막 단백질 α-32의 용혈 관내 합성 및 기공 형성 활성을 연구하기 위해이 방법을 사용 하였다. 셋째, 내측 및 외측 소엽의 지질 성분이 다른 22되는 비대칭 GVS를 생성 할 수있다. 예를 들어이 Whittenton 외. 음으로 하전 된 폴리 뉴클레오티드를 캡슐화하는 내부 전단지에 양이온 성 지질,와 외부 전단지에 중성 지질과 생성 비대칭 GVS는 독성과 특이 세포 흡수 (33)을 감소시킵니다. 넷째, GVS 내부 물질의 농도 및 부피 분율이 상대적으로 높을 수있다S = "외부 참조"> 28, 34. 다섯째, 재료의 여러 가지 유형 (35)을 캡슐화 할 수있다. 예를 들면은, 니시무라 외. GVS로 시험 관내 전사 번역 시스템을 캡슐화하고 GVS 36에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 시스템을 사용 하였다. 이 다섯 기능은 유화 원심 분리 세포 흉내 GVS를 생성하기위한 필수적인 방법 O / w를 확인합니다.
이전 연구에서, 원심 분리에 의해 생성 GVS 최종 수용액 (22)의 일부를 포함하는 길이 16 G 스테인리스 바늘이 장착 된 주사기를 이용하여 수집 하였다. 미숙 기술자의 손이 수집 방법 쉽게 오일의 일부와 GV의 오염을 초래할 수있다. 본 연구에서 우리는 Yomo 기 (23), (37)에 의해 개발 된 W / O 에멀젼을 원심 분리 프로토콜을 사용구멍들이 제조되는 원심 관의 하단 연 통하여있는 GVS 침전을 수거한다. 우리는 세포 내 소기관의 크기와 비슷합니다 1.0 μm의 미소를 캡슐화 GVS를 준비했다. 마이크로 스피어의 사용은 우리가 체적 분율을 계산하여 농도를 추정 할 수 있었다. 물질이 조밀되는 GVS의 제조 방법의 확립 인공 세포를 생성하기위한 중요한 공정이다. 내부 재료의 다양한 유형에 대한 우리의 프로토콜의 유틸리티를 확인하려면, 우리는 또한 GFP와 작은 수용성 형광 분자 (uranine)가 GVS에 캡슐화 될 수 있음을 보여 주었다.
Protocol
원 / O 에멀젼 원심 분리 방법에 의해 GVS 1. 준비
- 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린의 원액 (DOPC, 25 mM)을 텍사스 레드 1,2- dihexadecanoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine의 원액, 트리 에틸 소금 (텍사스 레드 준비 DHPE, 0.20 클로로포름 밀리미터) 및 -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장합니다.
- 오일 솔루션을 준비합니다.
- DOPC 스톡 용액 (51.0 μL, 질소 가스 흐름하에 텍사스 레드 DHPE 스톡 용액 (19.2 μL)의 혼합물을 증발시켜 5 mL 유리 병의 내부 표면에 지질 막을 형성한다.
- 하룻밤 감압 필름을 품어 다음 (g / cm 3 0.86-0.89) 유리 병에 액체 파라핀 1.0 ml에 추가 할 수 있습니다. 알루미늄 호일의 병을 감싸고 나머지 80 ° CO / N에 그것을 품어. 3 밀리미터 - DOPC 텍사스 레드 DHPE의 최종 농도는 1.3 및 3.8 × 10이다각각 및 DOPC : 0.3 : 텍사스 레드 DHPE 몰비는 100이다.
- 내부 수성 분산액을 준비합니다.
- 1.5 ml의 뚜껑있는 마이크로 튜브에 1.0 μm의 비 형광 마이크로 스피어 (2.5 부피 %), 1.0 ㎛의 형광 마이크로 스피어 (2.5 부피 %)의 분산액 12.5 μL의 분산액 237.5 μL를 혼합; 형광 마이크로 스피어에 비 형광 5 (v / v)의 비율이 95에 대응한다.
- 트리스 완충 용액 125 μL (TBS, 1 M) 및 탈 이온수 875 ㎕를 다음 자당의 64 mg을 추가합니다. 미소 구체의 최종 부피 분율은 0.5 체적 %이고, 트리스 - 염산 (pH를 7.5) 수크로오스의 최종 농도는 각각 0.1 M 및 0.15이다.
- 소용돌이 30 초에 대한 마이크로 튜브 후 10 분 정도 초음파 처리.
- 외부 수용액을 준비합니다.
- 트리스 완충 용액 10 ㎖를 제조 한 후 (0.1 M 트리스 -HCl [pH가 7.5, 0.15 M glucOSE) 내 수성 매질과 같은 절차에 마이크로 튜브를 뚜껑이있는 1.5 ml의 용액 1 ㎖를 배치했다. 소용돌이 30 초에 대한 마이크로 튜브 후 10 분 정도 초음파 처리.
- 마이크로 스피어를 포함하는 아 / O 에멀젼을 준비합니다.
- 1.5 ml의 마이크로 튜브의 내부 수용액 300 μL와 오일 용액 (액체 파라핀 함유 DOPC 및 텍사스 레드 DHPE) 1 mL를 섞는다.
- 기계적 균질 기 (고속 회전 블레이드 교반기)를 사용하여 모세관의 두 성분들을 유화 실온에서 2 분 동안 10,000 rpm으로 작동.
- GVS을 침전.
- 부드럽게 마이크로 튜브를 뚜껑이있는 1.5 ml의 4 ° C에서 외측 수용액 1 ㎖의 상면 w / o 에멀젼의 300 μl를 층을 포함한다. 4 ℃에서 10 분 동안 마이크로 튜브를 진정.
- GVS를 수집합니다.
- 즉시 마이크로 튜브를 차게 한 후,30 분 동안 18,000 x g에서이를 원심 분리. 압정으로 마이크로 튜브의 바닥을 관통하고 멸균 1.5 ml의 마이크로 튜브에 한 방울을 수집하여 침전 GVS를 얻습니다.
- 얻어진 GVS 관찰을 어렵게 할 정도로 다량으로 얻어진 경우 희석 석출 GV는 외측 수성 용액 부피 10-100 배 액적.
GVS 2. 현미경 관찰
- 현미경 표본을 준비합니다.
- 현미경 커버 유리 상단에 현장 중합 효소 연쇄 반응 및 혼성화 (챔버 크기 두께 9mm X 9mm X 0.3 mm)에 대한 접착 배양 챔버를 놓습니다.
- 마이크로 피펫을 사용하여, 희석 기탁 25 μL가 검지 영역 GVS 침전 즉시 배양 챔버의 상부에 다른 커버 유리 (약 0.15 mm 두께)를 배치했다.
- 기록 미분 간섭 콘트라GVS의 t 현미경 이미지.
- 12V100WHAL-L 할로겐 램프가 장착 된 현미경 (10X, 20X, 40X 및 목적)와 소포의 기록 현미경 이미지.
- 형광 현미경 관찰을 실시한다.
- 현미경으로 U-FBNA 및 U-FMCHE 형광 미러 장치를 삽입합니다. 각각 각각 510-550 nm의 600-690 nm의 빛을 전송 방출 필터 470-495 nm의 565-585 nm의 여기 필터와 장치를 장착한다.
Representative Results
원 / O 에멀젼을 원심 분리 방법은 사진으로도 1에 개략적으로 도시되어있다. 도 1의 개략적 인 화상이 방법의 성공의 가장 중요한 결정 인자가 GVS 원심 동안 침전되도록 내측 수용액의 비중 외측 수용액보다 커야한다는 것을 의미한다. 또한, w / O 인터페이스에서 지질 단일 층의 형성은 에멀젼 외측 수용액에 적층 된 후 시스템이 10 분 동안 냉각 될 것을 요구한다. 승 / O 인터페이스를 통해 에멀젼 방울의 이동에 의해 GVS 양식 때문에, 내부 및 외부 수성 층의 삼투 압력은 동일해야합니다. 컨트롤 실험으로서, 프로세스에 의해 더 미세 함유하지 않는 우리 GVS 또한 제조도 1에 도시 된 내측 수용액 것을 제외하고는 단계 1.3마이크로없이 준비했다.
원심 분리 후 침전 된 GVS의 컬렉션 그림 2에 표시됩니다. 마이크로 튜브의 바로 아래쪽의 반투명 위상뿐만 아니라, 또한 외주 수용액 (도 2a)에 백색 혼탁 중간 위상을 관찰 하였다. 아래 단계는 GVS를 포함하는 반면이 중간 단계는, 미소와 석유의 집계 풍부했다. 따라서, 고정 핀 (도 2b)으로 모세관의 바닥을 관통 한 결과 GVS 대량 함유 처음 드롭 (도 2C)을 수집 하였다. 더 이상 두 방울 수집하지 않습니다 있는지 확인하는 것이 중요하다; 추가 하락은 GVS의 낮은 밀도가 발생합니다 미소와 지질의 집계를 포함 할 수있다. 얻어진 소포 분산은 종종 GVS 외부 캡슐화 물질을 포함 ofte GVS 때문에원심 분리 동안 n 개의 파열. 단 GVS 얻으려면 투석, 겔 여과 또는 형광 - 활성화 세포 분류와 같은 방법은 캡슐화 물질의 크기로 인해, 정렬이 선택되어야한다. 석출 GVS 사용되어야하는 목적을 위해 필요한 경우, 이들은 외측 수성 용액으로 희석 될 수있다. 어떤 경우에는, 중간상을 형성하는 소포가 오일에 의해 함께 결합 된 것을 시사 튜브의 하부로 연장.
우리는 마이크로없이 GVS의 미분 간섭 현미경과 형광 현미경 이미지를 획득 (그림 3A, 3B) 및 마이크로와 (그림 3C -3 F). 이전 보고서 (23), (37)과 일치, 낮은 lamellarity와 GVS는 우리의 프로토콜에 의해 형성되었다. 빨간 fluores을 방출 텍사스 레드 DHPE와 결합 지질그 소포 형성 직접 박막의 시각화에 의해 확인 될 수 있도록 cence가 사용되었다. 우리 얻어진 160 GVS 중 55 미세 캡슐화, 105 34 %의 캡슐화의 비율을 제공 비어 있었다.
우리는 다음의 방법에 의하여 미소 GVS에서의 체적 분율 (φ, 부피 %)을 결정 하였다. 각 GV가 수백 마이크로 스피어에 수십 포함되어 있기 때문에 광학 현미경으로 모든 미소를 계산하는 것은 도전이다. 따라서, 수동 형광 현미경으로 계수 하였다 형광 미소 소량과 비 형광 1.0 ㎛의 미립자를 혼합 하였다. 미세 캡슐의 총 수 (N)는 (20)가 수동으로 계산 형광 미립자의 개수 (N)를 곱하여 계산 하였다 (: 비 형광 형광 미소 행의 5의 V / V] 비 일본어 95 기준). 의 값(66); 다음 V는 미소 구체의 부피이고, V는 각각 GV의 볼륨 수 NV 100 / V로 추정되었다. n은 N의 추정 계산 오류가 발생한다 참고 및 φ를 계산할 때이 오류가 고려되어야한다. φ의 값은 20 N으로 직접 계산 N, 추정, 차례로 이는 φ 확률 초래했다 정확하게 진정한 가치는 50 % <입니다 나타냅니다. 사실, N 20 N의 주위에 어느 정도 변동, 그래서 우리는 내가 N의 오류이고, (N I를 ±) 20로 고려해야합니다. 우리는 N의 확률 난 포아송 분포에 기초하여 얻어진 50 % 이상이 될 수 있음을 위해 ± I 추정. 우리는 다시 우리가 20를 계산 (N I를 ±)과의 값을 할 수있는, 내가 예상(66); 즉, 10 및 15 μm의 (표 1)의 직경 GVS에 대한 오류를 계산에 포함. 이 절차에 따라,도 3c에 도시 GV의 미립자의 체적 분율은 11 ± 3 부피 %로 추정되었다. 계산 된 체적 분율의 정밀도 10-30 %였다.
우리의 결과는 우리가 성공적으로 높은 부피 분율에 GVS 1 μm의 마이크로 캡슐을 나타냅니다. 우리는 같은 외부 수용액과 같은 프로토콜 (도 4)를 이용하여도 100 몰 % DOPC GVS에 다른 물질을 캡슐화 할 수 있었다. 즉, 0.1 ㎛의 미립자를 함유 GVS 0.1 M 트리스 -HCl 1.0 ㎛의 미립자를 함유 GVS 대해 기재된 프로토콜을 통해 (PH 7.5), 0.15 M 수 크로스, 0.5 부피 % 형광 마이크로 스피어 (함유하는 트리스 완충 용액으로부터 제조 된 그림 4a). 프로토콜 설명 abov에 따라즉, GFP (0.1 M 트리스 -HCl [pH가 7.5, 0.15 M 슈 크로스, 100 μg의 / ㎖의 GFP;도 4b)를 포함 DOPC GVS 및 uranine 함유 GVS (0.1 M 트리스 -HCl [pH가 7.5, 0.15 M 슈 크로스, 30 μM uranine;도 4c)도 준비 하였다.
| 엔 | 엔 | φ (10 μm의 직경) | φ (15 μm의 직경) |
| 삼 | 60 ± 20 | 6.0 ± 2.0 | 1.8 ± 0.6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8.0 ± 2.0 | 2.4 ± 0.6 |
| (5) | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3.0 ± 0.6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3.6 ± 1.2 |
| (10) | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0.9 |
| (20) | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| (30) | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| 본문에 설명 된 바와 같이 에러는 측정 하였다; n은 수동으로 계산 미소의 수; 캡슐화 된 마이크로 스피어의 N은 = 총 수입니다. | |||
표 1 : 마이크로 스피어 (A)의 번호 및 볼륨 분획 (φ, 부피 %). 본문에 설명 된 바와 같이 에러는 측정 하였다; n은 수동으로 계산 미소의 수; 캡슐화 된 마이크로 스피어의 N은 = 총 수입니다.
그림 1 : 흐름 장 예술과 / W O 에멀젼 원심 분리 방법의 개략도. (가) DOPC 텍사스 레드 DHPE로 구성된 오일 솔루션 : 액체 파라핀에 (100 0.3 몰비). (b) 트리스 - 염산 완충액 크로스 및 미립자로 구성된 내부 수성 분산액. (c) 트리스 - 염산 완충액에서 글루코스로 이루어진 외측 수성 용액. (d) 석유 액 1ml 및 내측 수성 분산액을 300 μL의 혼합물. 균질화 (10,000 rpm으로 2 분)와 (E) 유화. (f) 상기 w / O 에멀젼. 외측 수용액 1 ㎖에 에멀젼의 300 μL의 (g) 레이어링. (시간) 석출 GVS 직후 원심 분리. (ⅰ) W / O 에멀젼을 원심 분리 방법의 원리의 개략도. 검은 색 화살표는 원심 가속도의 방향을 나타냅니다..JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마이크로 튜브의 피어싱. (a)에 석출 GVS 단지 (또한도 1 시간에 도시) 원심 분리 후. 붉은 타원 석출 GV 분산액의 액 적을 나타낸다. 압정으로 마이크로 튜브의 (b)에 피어싱. GVS 함유 펠렛 압정으로 아래쪽에 마이크로 튜브를 관통하여 구멍으로부터 액적들을 수집하여 수득 하였다. 외측 수용액으로 희석 한 분산 체 (노란 화살표) 침전 GVS의 (c) 방울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : GVS의 현미경 사진. 미소없이 GV의 (a) 차동 간섭 콘트라스트 현미경 이미지. GV의 직경은 약 10 ㎛,. 스케일 바는 10 μm의 =. 미소없이 GV의 (b) 형광 현미경 이미지. 빨간색 형광 텍사스 레드 DHPE에 의해 방출되었다. 미립자를 함유하는 GV의 (c) 차등 간섭 콘트라스트 현미경 이미지. GV 내부 1.0 μm의 미소 (YG 카르복시산 미립자)의 (d) 형광 현미경 이미지. 카운트 형광 마이크로 스피어 (N)의 수는 우리는 포아송 분포에 기초하여 상기 오차 (I = 2) 약 6이었다. 그 다음 우리는 ((N I를 ±) N = 20) 내부 미소의 총 수를 추정 120 ± 40이었다. 이것은 것으로 계산되었다GV는 V는 미소 구체의 부피이고, V는 GVS 부피 약 11 ± 3 부피 %의 체적 분율 (φ = 수 NV 100 / V)에서 1.0 ㎛의 미립자를 함유 하였다. GV 막 (E) 형광 현미경 이미지. 빨간색 형광 텍사스 레드 DHPE에 의해 방출되었다. (바) 패널 D와 E의 이미지의 이미지를 병합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 다른 캡슐화 된 재료와 GVS의 미분 간섭 대비 및 형광 현미경 이미지. 미분 간섭 대비 현미경 (위)과 형광 현미경 (아래)의 이미지(a) 0.1 ㎛의 미립자, (B) GFP, 및 (c)를 함유 uranine GVS. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
내부 수계 분산매 및 외측 수성 용액의 비중은 신중하게 선택되어야한다. 원 / O 에멀젼을 원심 분리시의 외측 수성 용액에 침전하기 위해서는 내부 수계 분산 매체의 비중 외측 수용액보다 커야한다. 우리는 설탕없이 내부 및 외부 솔루션을 사용하여 GVS을 준비하려고했으나 내부 수용액이 두 단계 사이의 간섭을 통과하기에 충분한 질량을 가지고 있지 않았기 때문에 우리는 이러한 조건에서 더 GVS을 얻을 수 없습니다. 축소하거나 파열 될 수도 외측 수용액에 침전 두 솔루션 GVS 사이에 큰 삼투압 차이가있는 경우. 따라서, 내부와 외부 GVS 삼투압은 같아야합니다. 이를 위해, 우리는 외측 수성 용액에 용질로서 내측 수성 분산액 및 글루코스 용질로서 자당을 사용하는; 모두 당 동일한 농도로 하였다. 두 소금SS = "외부 참조"> 설탕 22 23, 35, 38 등의 목적으로 사용되고 있지만, 덜 독성 염보다 용해성 때문에 당 보통 사용된다. 설탕을 너무 많이 첨가하면 그러나 GVS 커버 유리와 붕괴의 바닥과 접촉 할 수있다. 이를 피하기위한 몇 가지 전략이있다. 하나의 전략은 GVS 온화한 조건 하에서 침전되도록 내측 및 외측 수성 용액 사이의 비중 차이를 감소시키는 것이다; 구체적으로는, 침전 GV 분산액의 상등액 부력의 결과로서 덮개 유리를 접착하여 소포 파괴의 가능성을 줄이기 위해 내부 수용액 동일한 용액으로 교환 될 수있다. 또 다른 전략은 얇은 지질막 29 커버 유리를 모두 프리 코트한다.
에멀젼의 적절한 준비와 배양된다중대한. 우리는 오일 용액을 제조하는 액체 파라핀을 사용했다. 미네랄 오일 26, 31, 21 도데 칸, (33)과 스쿠알렌 (33), (39)는 종종 용매 오일로 사용된다. 이들 재료는 비중, 점도 및 표면 장력에 차이가 있으므로 동일한 원심 분리 조건 (33)을 사용하는 경우, 소포 상이한 개수도 형성한다. 타겟 특성 소포를 얻기 위해서는,이 비중 및 내외 수용액의 점도뿐만 아니라 오일상의 원심 acceleration.For 제제를 최적화하는 것이 필수적이며, 배양 높은 온도에서 건조 발생해야 환경 인큐베이터 또는 탈수기 등. 본 연구에서는 완전히 지질 molecules.In 첨가 용해 80 ° C로 유동 파라핀을 가열하여 에멀젼해야필요하고는 제조 직후 불안정하므로 즉시 원심 분리한다로만 제조 할 방울이 쉽게 서로 융합 / O w 에멀젼 초음파, 볼 텍싱 또는 탭하여 대량으로 제조 할 수있다. 다만, 호모 게 나이저를 사용하면 고점도 오일 에멀젼 다량의 신속한 제조 쉽게 유화 가능하다. 이 에멀젼은 부드럽게 신속하고 4 ℃에서 후 냉장 외부 수용액에 적층하는 것이 중요하다. 유화 원심 분리 사이의 시간을 단축하기 위해, 오일 외측 수용액 시스템은 에멀젼이 그 상에 적층하기 전에 예냉 할 수 있고, 백탁이 빠르거나 느린 평소보다 기계적 표시 immediately.If 전체 시스템은 원심 분리 될 수있다 균질는 철저하게 청소 세제를 제거하는 세척해야합니다. 또한, 유화 전, 오일 용액, 내측 수성 용액 및 유화제 R 있어야실온 eturned.
적절한 원심 가속도도 중요하다. 18,000 x g에서 원심 분리함으로써 고농도로 캡슐화 한 내장재로 GVS을 제조 할 수 있었다. 복수의 재료의 밀봉이 요구되는 때, 원심 가속도를 저감하는 것이 좋다. 예를 들어, 일곱 화합물을 캡슐화 액틴 조립 시스템은 350 미만의 X g에서 원심 분리 (35)로 이루어졌다. 원심 분리가 바람직 인 경우 GVS는 당 농도를 조정하거나 그 자체 매스 (38), (40), (41)의 영향 하에서 에멀젼을 침전에 의해 얻어 질 수있다.
여기에보고 된 방법은 두 가지 제한 사항이 있습니다. Weit 의해 지적 된 바와 같이 하나의 GV 막 가용화 할 수있다 (이 경우에는 파라핀)이 오일 분자 인Z 그룹 21. GV 막으로 세포막 단백질의 삽입이 요구되는 경우 단백질에 공존 오일 분자의 영향이 고려되어야한다. 다른 제한은 체적 분율의 변화이다. 본 연구에서는 GVS 미소 구의 부피 분획을 4-30 부피 %에서 원거리 추정; 부피 분획 GV 제제에 사용되는 내부 수용액의 부피비 동일하지 않았다. 우리는 현미경 관찰 충분히 높은 부피비에서 GVS에 미세 캡슐화 할 수 있었지만,이 방법은 균일 한 부피 분율 분포 GVS의 제조에 적합하지 않다. 이는 미세 체적 분율의 분포가 원심 34 중의 변경 것으로보고되었다.
원 / O 에멀젼을 원심 분리 방법은 일반적으로 캡슐화 된 물질을 함유 GVS의 형성에 사용된다. 그러나, 몇 가지 보고서는 페이지를 설명했다마이크로 재료 (34), (42)을 캡슐화 GVS의 배상. 최근에 캡슐화 된 DNA 장치 또는 분자 장치를 포함하는 분자 로봇 (44) (43)로 구성되어있다. 구획 GVS는 이러한 종류의 응용 프로그램에 대한 첫 번째 선택이다; 따라서, 다양한 표면 작용으로 자성 구체 및 미세 캡슐화에 사용될 수 등 우리 같은 기술은, 44 유용한 것으로 예상 될 수있다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 그림 1에 개략적 인 이미지를 그리기 위해 야마구치 토모코 감사합니다. 본 연구는 자연 과학의 theNational 연구소의 통합적인 생명의 오카자키 연구소의 오카자키 ORION 프로젝트 (NINS)에 의해 지원되었다; 우주 생물학 센터 프로젝트 NINS의 (. 더 AB281010)에 의해; (. 어떤 25102008) 혁신 분야의 과학 연구 (통합 기능의 창조를위한 생체 분자 시스템의 역학적 순서) 과학 진흥 일본 사회에서에 대한 보조금의 원조 (JSPS)에 의해; 젊은 과학자에 대한 보조금의 원조 (B)에 의해 (KK에, 15K17850 없음.) JSPS에서; andby 그랜트 -에 - 보조 연구 활동 스타트 업에 대한 (YN에, 아니. 15H06653) JSPS에서. 추가 지원은 노구치 연구소, 예술과 과학의 카오 재단 보조금, 그리고 쿠 리타 물과 환경 재단 보조금에서 교부금에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L.
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
