Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
De constructieve biologie en de synthetische biologie benadering van het creëren van kunstmatig leven hebben betrekking op de bottom-up assemblage van biologische of niet-biologische materialen. Dergelijke benaderingen hebben veel aandacht gekregen in het onderzoek op de grens tussen levende en niet-levende materie en zijn gebruikt om kunstmatige cellen te bouwen in de afgelopen twee decennia. In het bijzonder, Giant Vesicles (GVS) vaak gebruikt als kunstmatige celmembranen. In dit artikel beschrijven we de voorbereiding van de GVS inkapselen zeer verpakt microbolletjes als een model van cellen met zeer gecondenseerde biomoleculen. De GVS werden bereid door middel van een eenvoudige water-in-olie-emulsie centrifugatiemethode. Specifiek werd een homogenisator gebruikt om een waterige oplossing die het materiaal in te kapselen en een olie die opgelost fosfolipiden emulgeren en de verkregen emulsie werd voorzichtig op het oppervlak van een waterige oplossing gelaagd. Het gelaagde systeem werd vervolgens gecentrifugeerd to het genereren van het GVS. Deze krachtige methode werd gebruikt om materialen van kleine moleculen tot microbolletjes kapselen.
De constructieve, of synthetische biologie aanpak is een fascinerende weg voor het verkennen van de grens tussen levende en niet-levende materie. Omdat de cel het minimum vereist apparaat voor het leven zoals we dat nog verscheidene onderzoekers hebben geprobeerd om kunstmatige cellen uit eenvoudige, goed begrepen chemische construct zodat verschijnselen die bij zo'n kunstmatige cellen worden onderzocht, met als uiteindelijk doel het ophelderen de oorsprong van het leven en het bestuderen van de basisfuncties van levende cellen 1, 2, 3. Vooral blaasjes 4, waarbij bolvormige microcompartments van amfifiele moleculen zijn en kunnen biologische moleculen zoals eiwitten 5, 6 en DNA 7, 8, 9 kapselen,lass = "xref"> 10, zijn vaak gebruikt als model van biologische membranen.
Vesicles kunnen worden gekwalificeerd als kleine (gedefinieerd als een diameter van <100 nm), groot (diameter <1 urn) of grote (diameter> 1 pm). Giant blaasjes (GVS) zijn uitgebreid bestudeerd, omdat ze zijn vergelijkbaar met levende cellen in grootte, vorm en structuur. Door de grootte van GVS kunnen morfologische veranderingen in GV membranen gemakkelijk worden waargenomen in real time onder een optische microscoop.
Verschillende werkwijzen voor het bereiden GvS gemeld 11, inclusief de werkwijze hydratatie 12, 13, de vries-dooi methode 14, de werkwijze electroformation 15, 16, en de werkwijze fluïdeapparaat 17, 18. Echter, inkapselen eiwitten en andere Macromolecules in GVS bij hoge concentraties door middel van deze methoden is moeilijk. In het bijzonder is het uiterst moeilijk om biologisch materiaal in voldoende hoeveelheid (20-30 vol%) inkapselen de drukke omgeving in de cellen 19, 20 nabootsen. Vormen GVS direct, Weitz en medewerkers werd een water-in-olie (w / o) emulsie centrifugatiemethode 21, 22. Deze werkwijze heeft vijf belangrijke kenmerken. Ten eerste omdat GVS bereid volgens deze werkwijze hebben een lage lamellarity 23, 24, het membraan zo dun dat ze gemakkelijk kunnen worden vervormd. GV membraan deformatie geïnduceerd door FtsZ (een bacteriële celdeling eiwit), tubuline, en andere macromoleculen is onderzocht 25, 26, 27, 28, en we waarnamen polyhe dron-achtige vervorming van GV membranen geïnduceerd door inkapseling van microsferen 29, 30. Ten tweede kan membraaneiwitten in de vesiculaire membraan door deze werkwijze ingevoegd zij het met moeite 31. Bijvoorbeeld, de Yomo groep gebruikt deze methode om de in vitro synthese en porievormende activiteit van het membraaneiwit α-hemolysine 32 bestuderen. Ten derde is het mogelijk om asymmetrische GVS waarbij de lipide bestanddelen van de binnenste en buitenste blaadjes zijn verschillende 22 genereren. Bijvoorbeeld Whittenton et al. gegenereerde asymmetrische GVS met kationische lipiden in het binnenste leaflet negatief geladen polynucleotiden kapselen en neutrale lipiden op de buitenste laag van toxiciteit en niet-specifieke cellulaire opname 33 verminderen. Ten vierde kan de concentratie en de volumefractie van stoffen in het GVS relatief hoogs = "xref"> 28, 34. Ten vijfde kunnen meerdere soorten materiaal worden ingekapseld 35. Bijvoorbeeld Nishimura et al. ingekapseld een in vitro transcriptie-translatie systeem in GVS en gebruikt het systeem om groen fluorescerend eiwit (GFP) kenbaar te maken binnen het GVS 36. Deze vijf eigenschappen maken w / o-emulsie centrifugeren een onmisbare methode voor het genereren van cel nabootsen GVS.
In eerder werk GVS gegenereerd door centrifugatie werden verzameld door middel van een injectiespuit met een lange 16 G roestvrijstalen naald met een aantal van de uiteindelijke waterige oplossing 22. In de handen van onervaren technici, kan dit inningsmethode gemakkelijk leiden tot verontreiniging van de GV enkele van de olie. In deze studie hebben we de w / o-emulsie centrifugatieprotocol ontwikkeld door Yomo groep 23, 37,waarbij neergeslagen GVS worden verzameld door een gat in de bodem van de centrifugebuis waarin ze bereid geopend. We bereidden GVS inkapselen 1,0 gm microsferen, die in omvang intracellulaire organellen. Het gebruik van microsferen liet ons toe om de concentratie te schatten door het berekenen van het volume fractie. Oprichting van een methode voor de bereiding van GVS in welke materialen dicht zijn verpakt is een belangrijke stap voor het creëren van kunstmatige cellen. Om het nut van onze protocol van verschillende soorten binnenkant materialen bevestigen hebben we aangetoond dat GFP en een kleine wateroplosbaar fluorescent molecuul (uranine) kan worden vastgelegd in het GVS.
Het soortelijk gewicht van de binnenste waterige dispersiemedium en de buitenste waterige oplossing moet zorgvuldig worden gekozen. Voor de w / o-emulsie te precipiteren in de buitenste waterige oplossing tijdens het centrifugeren, moet de dichtheid van de binnenste waterige dispersiemedium groter dan die van de buitenste waterige oplossing. We hebben geprobeerd om GVS behulp binnenste en buitenste oplossingen zonder suiker bereiden, maar we geen GvS verkregen onder deze omstandigheden, omdat de binnenste waterige oplossing niet voldoende massa om de interferentie tussen de twee fasen oversteken hadden. Als er een grote osmotisch drukverschil tussen de twee oplossingen, GvS die neerslaan in de buitenste waterige oplossing kan krimpen of scheuren. Daarom moet de osmotische druk binnen en buiten de GVS gelijk zijn. Hiervoor gebruikten we sucrose als een opgeloste stof in de binnenste waterige dispersie en glucose als opgeloste stof in de buitenste waterige oplossing; beide suikers waren bij dezelfde concentratie. zowel zoutss = "xref"> 22 en suiker 23, 35, 38 zijn gebruikt voor dergelijke doeleinden, maar suiker wordt gewoonlijk toegepast omdat het minder toxisch en beter oplosbaar dan zout. Als echter te veel suiker wordt toegevoegd, de GVS in contact kan komen met de bodem van het dekglas en bezwijken komen. Er zijn verscheidene strategieën voor dit vermijden. Een strategie is het soortelijk gewicht tussen de binnenste en buitenste waterige oplossingen voor de GVS neerslaan onder milde omstandigheden verminderen; in het bijzonder kan de bovenstaande vloeistof van de dispersie neergeslagen GV worden uitgewisseld met een oplossing die identiek is aan de binnenste waterige oplossing de mogelijkheid van vesiculaire scheuren verminderen door hechting aan het dekglas als gevolg van het drijfvermogen. Een andere strategie is om beide dekglazen vooraf te bekleden met een dunne lipide film 29.
Een goede voorbereiding en incubatie van de emulsie wordenbelangrijk. We gebruikten vloeibare paraffine om de olie te bereiden. Minerale olie 26, 31, dodecaan 21, 33 en squalaan 33, 39 worden ook vaak gebruikt als oplosmiddel olie. Omdat deze materialen verschillen in dichtheid, viscositeit en oppervlaktespanning, verschillende aantallen blaasjes vormen, zelfs wanneer dezelfde centrifugeeromstandigheden gebruikt 33. Om de vesicles met de beoogde eigenschappen te verkrijgen, is het noodzakelijk om de soortelijke gewichten en viscositeiten van de binnenste en buitenste waterige oplossingen en de centrifugale acceleration.For bereiding van de oliefase te optimaliseren, moet incubatie plaatsvinden bij hoge temperatuur en in een droge milieu zoals een incubator of een dehydrator. In deze studie hebben we de vloeibare paraffine tot 80 ° C verwarmd om de lipide molecules.In toevoeging volledig op te lossen, moet de emulsiealleen bereid als nodig en moet onmiddellijk gecentrifugeerd omdat het onstabiel net nadat het is bereid en de w / o druppels gemakkelijk samensmelten met elkaar. De emulsie kan in grote hoeveelheden worden bereid door sonificatie, vortexen of tikken. Het gebruik van een homogenisator zorgt voor een snelle bereiding van grote hoeveelheden emulsie en gemakkelijker emulgeren in olie met een hoge viscositeit. Het is ook belangrijk dat de emulsie lagen op de buitenste waterige oplossing voorzichtig en snel en vervolgens gekoeld bij 4 ° C. De tijd tussen emulgering en centrifugeren verkorten, kan de olie-buitenste waterige oplosmiddelsysteem worden voorgekoeld alvorens de emulsie is gelaagd op, en het gehele systeem kan dan worden gecentrifugeerd immediately.If de witte troebeling sneller of langzamer dan normaal, de mechanische homogenisator moet grondig worden gespoeld om schoonmaakmiddelen te verwijderen. Bovendien, voor emulgeren, de olie oplossing, binnenste waterige oplossing en emulgator moet r zijneturned tot kamertemperatuur.
Juiste centrifugaalversnelling is ook belangrijk. Door centrifugeren bij 18.000 x g, konden we GVS bereiden met een inwendige materiaal ingekapseld in een hoge concentratie. Wanneer het inkapselen van verschillende materialen vereist, is het beter om de centrifugale versnelling verminderen. Zo werd een actine montagesysteem inkapselen zeven verbindingen bereikt door centrifugatie bij minder dan 350 g x 35. In gevallen waarin centrifugeren ongewenst is, kan GVS worden verkregen door de suikerconcentratie of door precipiteren van het emulsie onder invloed van zijn eigen gewicht 38, 40, 41.
De hierin gerapporteerde methode heeft twee belangrijke beperkingen. Een daarvan is dat oliemoleculen (paraffine, in dit geval) kan worden opgelost in het GV membraan, zoals door de Weit is opgemerktZ-groep 21. Wanneer insertie van een membraaneiwit in de GV membraan gewenst is, moet het effect van gelijktijdig bestaande olie- moleculen op het eiwit beschouwd. De andere beperking is de variatie van volumefractie. In deze studie hebben we schattingen zijn de fracties van microsferen in het GVS varieerde 4-30 vol%; de volumegehalten niet identiek aan de volumefractie van de binnenste waterige oplossing gebruikt voor GV bereiding. Hoewel we konden microsferen in het GVS kapselen in een volumefractie hoog genoeg voor microscopie observatie, is deze methode niet geschikt voor de bereiding van GVS met een gelijkmatige verdeling volumefractie. Vermeld is dat de verdeling van microsferen volumedelen verandert tijdens het centrifugeren 34.
De w / o-emulsie centrifugatiemethode wordt gewoonlijk gebruikt voor de vorming van GVS met ingekapselde materialen. Echter slechts weinig rapporten beschreven de preparatie van GVS inkapselen microschaal materialen 34, 42. Onlangs hebben moleculaire robots die een ingekapselde DNA-apparaat of een moleculair systeem zo ontworpen 43, 44. GVS met compartimenten zijn de eerste keuze voor dit soort toepassingen; Daarom kunnen technieken, zoals de onze, die kunnen worden gebruikt voor het inkapselen van magnetische microsferen en microsferen met verschillende oppervlakte functionalisering verwachting bruikbaar 44 zijn.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Tomoko Yamaguchi voor het tekenen van de schematische afbeelding in figuur 1. Deze studie werd ondersteund door de Okazaki ORION Project van de Okazaki Institute for Integrative Bioscience van theNational Institutes of Natuurwetenschappen (NINS); door de Astrobiologie Center Project (geen AB281010.) van NINS; door een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas (Dynamische bestellen van biomoleculaire systemen voor de creatie van geïntegreerde functies) van de Japan Society voor de Bevordering van de Wetenschap (JSPS) (geen 25.102.008.); door een Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (KK, geen 15K17850.) uit JSPS; andby een Grant-in-Steun voor onderzoek Activity Start-Up (naar YN, nr. 15H06653) uit JSPS. Extra steun werd verleend door een subsidie van de Noguchi Institute, een subsidie van de Kao Stichting voor de Kunsten en Wetenschappen, en een subsidie van de Kurita Water en Milieu Foundation.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |