Abstract
Dit artikel meldt een microfluïdische inrichting bestaande uit polydimethylsiloxaan (PDMS) met een ingesloten polycarbonaat (PC) dunne film celmigratie onder combinaties van chemische en zuurstofgradiënten bestuderen. Zowel de chemische en zuurstof gradiënten kan grote invloed hebben celmigratie in vivo; echter, als gevolg van technische beperkingen, zeer weinig onderzoek is gedaan naar de effecten in vitro onderzoeken. De in deze onderzoeken apparaat maakt gebruik van een aantal serpentine-vormige kanalen aan de gewenste chemische gradiënten genereren en exploiteert een ruimtelijk beperkte chemische reactiewerkwijze voor zuurstofgradiënt genereren. De richtingen van de chemische en zuurstofgradiënten loodrecht op elkaar eenvoudige migratie resultaat interpretatie mogelijk. Om efficiënt genereren van de zuurstofgradiënten met minimale chemicaliënverbruik, wordt de ingebedde PC dunne film toegepast als een gas diffusiebarrière. De ontwikkelde microfluïdische apparaatkunnen worden bediend door spuitpompen en in een conventionele cel incubator bij celmigratie experimenten om voor opstart vereenvoudiging en geoptimaliseerde celkweekomstandigheden. In cel experimenten gebruikten we het apparaat migraties van adenocarcinomic humane alveolaire basale epitheelcellen, A549 bestuderen, onder combinaties van chemokine (stromale cellen afgeleide factor, SDF-1α) en zuurstofgradiënten. De experimentele resultaten tonen aan dat het apparaat stabiel kan genereren loodrecht chemokine en zuurstof verlopen en is compatibel met cellen. De migratie onderzoeksresultaten tonen aan dat zuurstofgradiënten een essentiële rol in de begeleiding celmigratie en cellulaire gedrag bij combinaties van gradiënten kan niet worden voorspeld uit die welke één gradiënten kunnen spelen. De inrichting een krachtig en praktisch hulpmiddel voor onderzoekers om interactie tussen chemische en zuurstofgradiënten in celkweek onderzoeken, die beter celmigratie onderzoeken bij meer vivo achtige microenvi kan bevorderengevingen.
Introduction
De ruimtelijke verdeling van oplosbare factoren en zuurstofspanning kan een aantal belangrijke cellulaire functies reguleren in vivo 1, 2, 3, 4. Om beter te onderzoeken het effect op cellen, wordt een in vitro celkweek platform staat stabiel genereren chemische en zuurstofgradiënten zeer gewenst. Verschillende oplosbare factoren spelen een belangrijke rol in de biologische activiteiten en invloed hebben op cellulaire gedrag. Onlangs, als gevolg van de vooruitgang van microfluïdische technieken verschillende microfluïdische inrichtingen die in staat stabiel genereren chemische gradiënten ontwikkeld celmigratie 5 bestuderen. Bovendien hebben verschillende studies bleek ook de noodzaak zuurstofspanning in vitro celculturen 6, 7, 8. Echter,de beheersing van de zuurstofspanning voor celkweek berust vooral op directe chemische toevoeging voor het wegvangen van zuurstof of cel incubators met gas onder druk cilinders. Directe chemische Bovendien verandert het celcultuurmedium en beïnvloeden het cellulaire reacties. Zuurstofregeling incubators vereisen speciale incubator ontwerp, nauwkeurige gasstroomregeling en een groot volume stikstofgas om hypoxie omstandigheden te bereiken. Bovendien onhaalbaar om de ruimtelijke verdeling van zuurstof Bij deze opstelling, waarbij de cellulaire gedragsstudie onder verschillende zuurstofspanningen en gradiënten vertraagt controleren. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben verschillende microfluïdische inrichtingen ontwikkeld om zuurstofgradiënten voor celcultuurtoepassingen 9 genereren. Echter, de meeste van hen worden door middel van gassen onder druk, die verdamping en vorming van belletjes problemen kunnen veroorzaken. Derhalve vereisen zij vaak ingewikkelde instrumentatie en kunnen niet betrouwbaar voor langdurige celkweek studie zijns.
Om de problemen te overwinnen en om de interacties tussen chemische en zuurstofgradiënten verdere studie voor celmigratie, ontwikkelden we een microfluïdische celkweekinrichting van polydimethylsiloxaan (PDMS) met een ingesloten polycarbonaat (PC) dunne film 10. De inrichting bestaat uit twee lagen bestaande microfluïde kanalen gescheiden door een PDMS membraan. De toplaag een PDMS-PC laag voor zuurstofgradiënt genereren; de onderste laag is gemaakt van PDMS chemische gradiënt productie en celkweek. Het apparaat kan gelijktijdig genereren loodrecht chemische en zuurstof verlopen zonder gebruik van gasflessen en geavanceerde flow control-systemen. In het apparaat, PDMS biedt een grote optische transparantie, gasdoorlaatbaarheid, en biologische compatibiliteit voor celcultuur en imaging. De embedded PC film dient als een gas diffusiebarrière voor een efficiënte zuurstofspanning controle. In de microfluïdische kanalen, hebben we een aantal serpentine-vormig kanaals chemische gradiënten genereren. Het ontwerp is in grote lijnen benut om chemische gradiënten in microfluïdische apparaten voor verschillende toepassingen genereren vanwege zijn betrouwbaarheid en eenvoudige experimentele opstelling. Verder kan de chemische gradiënt profielen worden gemaakt door het variëren van de zender geometrieën vooraf met numerieke simulatie. Voor zuurstofgradiënt generatie hebben we geprofiteerd van de ruimtelijk beperkte chemische reactiewerkwijze die eerder in ons laboratorium 10, 11, 12 ontwikkeld. De zuurstof kan worden gereinigd van de aangewezen gebieden zonder spoelen met stikstof. Voor praktisch gebruik in biologische laboratoria, de gehele experimentele opstelling is compatibel met conventionele celcultuur incubators. Door de integratie van deze methoden, kunnen we tegelijkertijd het genereren van stabiele chemische en zuurstof gradiënten zonder bulk gasflessen en geavanceerde instrumenten om celmigratie te studeren.
Protocol
1. Fabricage van microfluïdische apparaat
NB: De gehele microfluïdische apparaat wordt vervaardigd met behulp van de zachte lithografie replica gietproces 13.
- Vervaardiging van matrijzen voor de PDMS lagen in de microfluïdische inrichting
- Het ontwerp van de microfluïdische kanaal patronen met behulp van commercieel verkrijgbare illustratie of software te tekenen. Verzend het bestand naar een bedrijf voor hoge-resolutie transparantie photomask afdrukken 14.
- Schone silicium wafers met aceton (≥99.5%), isopropylalcohol (IPA; ≥99.9%), en gebufferde oxide ets (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). Spoelen met gedeïoniseerd (DI) water en dehydrateren de wafer met stikstof pistool.
- Spin jas bij benadering 20 g negatieve toon fotolak, SU-8 2050, op de wafers bij 500 rpm voor 15 sec en dan 2000 rpm voor 30 sec.
LET OP: De spin-coating voorwaarde moet SU-8 2050 foto opleverenresist lagen met een dikte van ongeveer 75 urn op de plakken na optische lithografie. - Zacht bakken de wafels op 65 ° C verwarmingsplaat gedurende 3 minuten en vervolgens bij 95 ° C gedurende 9 min. Na de zachte bakken, bloot de wafers met behulp van een masker aligner met de ontworpen transparantie maskers onder UV-licht; de totale energie blootstellingstijd bedraagt ongeveer 300 mJ / cm2. Bakken na belichting (PEB) de wafers bij 65 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens bij 95 ° C gedurende 7 min.
- Na de PEB, dompel de wafers in SU-8 developer met sterke agitatie of in een ultrasoon bad (37 kHz en 180 W effectieve ultrasoon vermogen) gedurende 7 min. Spoel de wafer met aceton en IPA om de resterende SU-8 te verwijderen.
- Plaats de wafer en 100 pl silaan (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) in een 6 cm diameter Petrischaal in een exsiccator verbonden met een diafragma vacuümpomp wafeloppervlak silaneren teneinde ongewenste hechting te voorkomen. Zet de pomp gedurende 15 minuten, zet hem dan uit, En sluit de exsiccator met een vacuüm gedurende 30 min.
- Neem de gesilaniseerde wafers uit de exsiccator en plak ze tot 15 cm diameter Petrischalen voor de volgende soft lithografie-proces:
- Fabricage en assemblage van PDMS lagen
- Bereiding van het prepolymeer PDMS
- Meng PDMS monomeer (base) en verharder in een 10: 1 verhouding (v / v). Ontgas het mengsel in de exsiccator setup voor 60 min.
- Fabricage van de PC-ingebedde toplaag
- Overdracht 2 g PDMS prepolymeer op het matrijsoppervlak de toplaag fluïde kanaalrasters een dun laagje PDMS maken. Plaats de vorm in de exsiccator setup ontgassen de PDMS gedurende 60 min.
- Leg de mal 's nachts in een 60 ° C oven gedurende PDMS uitharden. Zorg ervoor dat de mal is op een horizontaal vlak.
- Koel de mal tot kamertemperatuur. Kap een extra 13 g PDMS prepolymeer op de mal en ontgas de PDMS in The exsiccator opstelling voor 60 min.
- Langzaam insluiten een 1 mm dikke PC film in de frisse PDMS laag als een gas diffusiebarrière; verdrijven eventuele luchtbellen indien nodig.
- Zet de mal 's nachts in de 60 ° C oven, en zorg ervoor dat het op een horizontaal vlak.
- Afkoelen de uitgeharde PDMS op kamertemperatuur. Snijd het apparaat met een scalpel om een gebied van ongeveer 5,5 x 5 cm 2, waarin alle kanalen patronen kunnen dekken, en trek het PDMS plaat uit de mal.
- Punch gaten voor in- en uitlaten met behulp van een 2 mm diameter biopsie punch. Bewaar de gefabriceerde top PDMS-PC layer afstand van ambient stof voor latere montage.
- Fabricage van de onderste laag PDMS
- Giet 11 g PDMS prepolymeer op het matrijsoppervlak van de onderste laag. Plaats de vorm in de exsiccator tot Degas de PDMS gedurende 60 min. Houd de mal 's nachts in een 60 ° C oven voor op het PDMS te genezen. Zorg ervoor dat het ligt op een horizontaal vlak.
- Afkoelen the PDMS tot kamertemperatuur. Snijd het apparaat om een gebied van ongeveer 5,5 x 5 cm 2, die betrekking hebben op alle kanalen patronen en afschilferen van de mal. Bewaar de gefabriceerde onderste PDMS laag weg van ambient stof voor latere montage.
- Fabricage van de PDMS membraan
- Spin jas ongeveer 4 g PDMS pre-polymeer op een gesilaniseerd lege wafer bij 100 rpm gedurende 90 sec en dan 3.000 toeren per minuut gedurende 4 sec. Bak de spin beklede wafer in een 60 ° C oven gedurende de nacht.
- Montage van het apparaat
- Plaats de gefabriceerde PDMS-PC toplaag en de wafer met roterend bedekken PDMS membraan in een O2 plasma oppervlaktebehandeling machine met de hechtvlakken naar boven. Behandel de PDMS oppervlakken met 90 W van O 2 plasma voor 40 sec.
- Binden de toplaag op de PDMS membraan direct na de O 2 plasma oppervlaktebehandeling. Plaats een gewicht (ongeveer 600 g) boven op de gehechte lagen en ze in een60 ° C oven gedurende de nacht om binding te bevorderen.
- Afkoelen de gehechte lagen tot kamertemperatuur en snijd het membraan gehecht aan de toplaag met een scalpel om een gebied van ongeveer 5,5 x 5 cm 2, waarbij alle kanalen patronen kunnen dekken. Schil van de gebonden structuur van het silicium wafer en punch gaten aan de in- en uitgang van de chemische gradiënt kanaal met behulp van een 2 mm diameter biopsie punch.
- Plaats het membraan gebonden toplaag en de gefabriceerde PDMS onderste laag in het O2 plasma oppervlaktebehandeling machine, de hechtvlakken naar boven, naar de PDMS oppervlakken met plasma bij 90 W gedurende 40 seconden geactiveerd.
- Bevestig de bovenste en onderste lagen aan elkaar te hechten direct na de oppervlaktebehandeling. Plaats een gewicht (ongeveer 600 g) boven op het gehele gebonden apparaat en het in een 60 ° C oven gedurende de nacht.
- Neem het hele vervaardigd apparaat uit de oven en afkoelen tot kamertemperatuur.
- Bereiding van het prepolymeer PDMS
2. microfluïdische Cell Migratie Assay
OPMERKING: In dit artikel gebruiken we een veel gebruikte cellijn, adenocarcinomic mens alveolaire basale epitheelcellen (A549) en een chemokine, stromale cellen afgeleide factor (SDF-1α), als voorbeelden. Voor onderzoekers werken aan andere cellen en chemokines, neem dan pas de experimentele processen.
- Dag 0: Cel voorbereiding
- Cultuur de voorraad van A549 cellen in compleet groeimedium DMEM F12 L-glutamine substituut, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) Antimicrob-antimycotische oplossing. Subcultuur door dissociatie met 0,25% trypsine-EDTA.
- Bereid celsuspensies voor de experimenten door centrifugeren gedissocieerde cellen bij 140 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Voor de microfluïdische apparaat experimenten tellen van de cellen met een hemocytometer en zaden ten minste 1 x 10 6 cellen in een T75 kolf met 10 ml compleetgroeimedium.
Opmerking: Alle celkweek processen worden uitgevoerd in een incubator met 37 ° C en 5% CO2 atmosfeer.
- Dag 1: Apparaat voorbereiding
- Plaats het apparaat in de O2 plasma machine en behandelen met O2 plasma bij 90 W gedurende 40 seconden te maken de microfluïdische kanaal hydrofiele oppervlakken.
- Onmiddellijk na de oppervlaktebehandeling, installeert twee 14 G botte naalden door direct inbrengen van de naalden in de 2 mm diameter gaatjes in het PDMS laag op de chemische gradiënt kanaal inlaten. Zorg ervoor dat de naalden niet de microfluïdische kanalen blokkeren. Trek 0,8 ml van DDH 2 O met behulp van een 1 ml spuit met een stompe 14 G naald. Spuit de DDH 2 O in de chemische gradiënt kanaal uit het stopcontact tot het water stroomt uit beide naalden op de inlaten.
- Bereid 1 ml van 50 ug / ml fibronectine oplossing door verdunning met fibronectine stock Dulbecco & #39; s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS).
- Giet het fibronectine oplossing uit de uitlaat van de chemische gradiënt kanaal met een 1 ml spuit met een stompe 14 G naald totdat de oplossing stroomt uit beide naalden op de inlaten.
- Incubeer de gehele inrichting 's nachts in een conventionele celkweek incubator.
- Dag 2: Cel zaaien en microscopie imaging
- cell seeding
- Zuig het medium van de cellen die gekweekt waren sinds dag 0 en was de cellen met 5 ml DPBS 2 keer. Zuig het DPBS, voeg 2 ml trypsine-EDTA en incubeer de cellen in de incubator gedurende 5 minuten om de cellen los te maken van de kolf oppervlak.
- Wacht tot de cellen worden losgemaakt en gesuspendeerd in de oplossing en voeg 8 ml serumvrij medium (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimycotische oplossing) aan de kolf. Overdracht van al de vloeistof in een 15 ml conische buis en centrifugeer in bij 140 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant na centrifugeren en voeg een geschikte hoeveelheid van het serum-vrij medium om de uiteindelijke celdichtheid maakt 1 x 10 6 cellen / ml. Haal de microfluïdische apparaat voorbereid op dag 1. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een andere automatische cel tellen instrument.
- Injecteer serumvrij medium uit de uitlaat van de chemische gradiënt kanaal met een 1 ml spuit met een stompe 14 G naald totdat het medium stroomt uit beide naalden op de inlaten. Injecteer 200 ui van de celsuspensie uit de uitlaat van de chemische gradiënt kanaal.
- Neem de celkweekkamer in de inrichting onder een microscoop te bevestigen dat de cellen zijn ingevoerd om de microfluïdische kanaal. Plaats het apparaat in een vochtige houder (bijvoorbeeld een plastic doos met DDH 2 O binnen) en bewaar het in een celkweek incubator gedurende 5 uur om de hechting van de cellen te bevorderen op het oppervlak apparaat.
- Bereiding van Reagenten voor de chemische gradiënt generatie
- Bereid de chemische (SDF-1α) in de gewenste concentratie (100 ng / ml) in serumvrij medium. Teken de serumvrij medium met en zonder de chemische stof in twee afzonderlijke 3 ml spuiten verbonden hoogzuivere buizen. Stel de spuiten op een injectiespuit pomp met een stroomsnelheid van 1 pl / min voor later gebruik.
- Bereiding van de reagentia voor zuurstofgradiënt generatie
- Voeg 15 ml 1 M NaOH-oplossing en 15 ml van 200 mg / ml oplossing pyrogallol. Teken de NaOH en pyrogallol oplossingen in twee 15 ml spuiten verbonden hoogzuivere PTFE-buis en hoogzuiver buizen respectievelijk. Stel de spuiten op een injectiespuit pomp met debiet van 5 pl / min voor later gebruik.
- Microfluïdische setup apparaat
- Na 5 uur incubatie, neem het hele apparaat naar buiten en leg het op een 15 cm diameter petrischaal. Bevestig het apparaat in de petrischaal met behulp van lijm stopverf. Breng dePetrischaal naar een live-cell imaging microscoop in een couveuse.
- Sluit de slang van de spuiten voor de chemische gradiënt generatie op de inlaten van de chemische gradiënt kanaal. Sluit de uitlaat buis die leidt naar een afvalreservoir. Zet de spuit pomp met de spuiten voor chemische gradiënt generatie.
- Sluit de hoge zuiverheid slang van het spuiten met NaOH en pyrogallol aan de inlaten van de zuurstof gradiënt kanaal. Sluit de slang aan op de uitlaat om het afval te verzamelen. Zet de spuit pomp met de spuiten voor zuurstof gradiënt generatie.
- Voeg ongeveer 15 ml van DDH 2 O om de petrischaal om het apparaat gehydrateerd te houden. Stel de live-cell imaging microscoop voor tijd vervallen beeld vast te leggen, en neem een beeld om de 15 min.
- cell seeding
- Dag 3: Data verzameling en analyse
- Breng de opname bestanden naar een computer. Analyseren van de beelden met behulp van een open source-afbeelding van eenalysis software, ImageJ, met een open source plugin voor Manual Tracking (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) en een gratis Chemotaxis Tool (http://ibidi.com/xtproducts / nl / Software-en-Image-Analysis / Manual-Image-Analysis / Chemotaxis-and-Migration-Tool) 15, 16.
3. Karakterisering van de Verlopen
NB: De chemische en zuurstof gradiënten kunnen worden gekarakteriseerd voor of na de celexperimenten.
- Numerieke simulatie van de chemische gradiënt
- Schat de laminaire stroming aard van microfluidics middel van computationele fluidic dynamics (CFD) simulatie.
- Karakterisatie van de zuurstofgradiënt
- Bereid een zuurstofgevoelige fluorescente kleurstof, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (III) chloride hexahydraat oplossing in water bij een concentratie van 5mg / ml.
- Teken de zuurstofgevoelige kleurstof oplossing in twee afzonderlijke 3 ml spuiten verbonden hoogzuivere buizen. Stel de spuiten op een injectiepomp met stroomsnelheid van 1 pl / min (identiek aan de stroomsnelheden voor de chemische gradiënt generatie).
- Sluit de slang van de spuiten aan de inlaten van de chemische gradiënt kanaal. Sluit de uitlaat buis die leidt naar een afvalreservoir. Zet de spuit pomp met de spuiten voor chemische gradiënt generatie.
- Meet de fluorescentie-intensiteit met een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met excitatie licht door een 470 ± 20 nm optisch filter. Verzamel de emissie licht door een 515 nm lange-pass-emissie filter met behulp van een koele CCD-camera.
- Sluit de hoge zuiverheid slang van het spuiten met NaOH en pyrogallol aan de inlaten van de zuurstof gradiënt kanaal. Sluit de slang aan op de uitlaat om het afval te verzamelen. Schakel de spuitpomp met spuiten voor zuurstofgradiënt generatie.
- Verzamel de fluorescentie beelden van de zuurstofgevoelige kleurstof stroomt in de celkweek kamer.
- Stop de stroom aan zuurstof gradiënt generatie en koppel alle slangen om de zuurstof generatie kanaal. Verbinding hoge zuiverheid slang van de gasflessen met de uitlaat van de zuurstofgradiënt kanaal.
- Verzamel de fluorescentiebeelden van de zuurstofgevoelige kleurstof stroomt in de celkweekkamer als stromende lucht, zuivere stikstof, zuivere zuurstof en in de slang verbonden met de zuurstofgradiënt kanaal.
- Schat de zuurstof hellingen door het analyseren van de fluorescentie beelden met behulp van de Stern-Volmer vergelijking volgens Referenties 10 en 11.
Representative Results
Bewerkte PDMS-PC hybride microfluïdische celkweek apparaat. Fig. 1 toont een foto en een illustratie van het microfluïdische apparaat. De onderlaag bevat vier niveaus van serpentine-vormige kanalen oplossingen van reagentia ingevoerd uit twee gescheiden inlaten met zes verschillende mengverhoudingen genereren. Theoretisch de zes verschillende mengverhoudingen zijn 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4 en 0: 1 (links: rechts) tussen de twee oplossingen geïntroduceerd van het inlaten. De chemische gradiënten geconstrueerd door de zes verschillende meng- verhouding oplossingen kunnen worden gegenereerd in de celkweekkamer stroomafwaarts gelegen. De bovenste en onderste lagen zijn gescheiden door een PDMS membraan. In de toplaag zijn de reagentia voor het wegvangen van zuurstof chemische reactie ingebracht in de microfluïdische kanaal uit twee afzonderlijke inlaten. De reagentia worden gemengd met elkaar om de reactie onmiddellijk vóór stroomt bovenop de celkweekkamer naarvangen de zuurstof uit de bodem kanaal, zonder direct contact met chemicaliën. De ingebedde PC film, met een kleinere diffusiecoëfficiënt gas vergeleken met PDMS, werkt als een diffusie barrière die het wegvangen van zuurstof efficiënter maakt. Zuurstof diffundeert geleidelijk terug naar de celkweekkamer door PDMS in stroomafwaartse gebied een zuurstof- gradiënt langs de stroomrichting vormen. Aangezien het wegvangen van zuurstof chemische reactie ruimtelijk beperkt zijn enkel lokale zuurstofspanningen beïnvloed. Hierdoor kan de inrichting worden gebruikt in een gebruikelijke celincubator behoud van de wereldwijde zuurstofspanning. In de migratie experimenten worden cellen uitgezaaid in de celkweekkamer voor observatie. Het groeimedium en chemische reagentia worden ingevoerd om het apparaat gebruik van de spuit pompen met nauwkeurig gecontroleerde debieten.
Karakterisering van chemische en zuurstofgradiënten gegenereerd in het apparaat. Vanwege tHij aard van microfluidics laminaire stroming, stroom gedrag kan worden voorspeld met behulp van computational fluidic dynamics (CFD) simulatie. In deze paper, gebouwd we een 3D-model en de simulatie uitgevoerd met behulp van een commercieel verkrijgbare multiphysics modeling software. Fig. 2 (a) toont een vergelijking tussen experimenteel kenmerk fluoresceïne concentratieprofielen over de breedte van de celkweekkamer op basis van fluorescentie-intensiteit metingen en de numerieke simulatie resultaten. De overeenkomst tussen de experimentele en simulatie resultaten suggereert dat de CFD-model goed kunnen inschatten van de chemische gradiënten gegenereerd in het apparaat. Fig. 2 (b) plots de gesimuleerde SDF-1α gradient gegenereerd in de celkweek kamer. Fig. 3 toont de zuurstofgradiënt karakteriseringsresultaten door stromen van de zuurstofgevoelige kleurstof fluorescentie in de celkweekkamer voor de cel experimenten. Het resultaat geeft aan dat een zuurstof gradient, variërend van ongeveer 1 tot 16%, kan met behulp van het bovengenoemde protocol.
Celmigratie resultaten. Als demonstratie, voerden wij A549 celmigratie studies onder 4 combinaties van chemokine (SDF-1α) en zuurstofgradiënten: (1) geen chemokine en geen zuurstof verlopen als controle, (2) met een chemokine gradiënt en zonder zuurstofgradiënt, (3) met een zuurstof gradiënt en zonder chemokine helling, en (4) met beide chemokine en zuurstof hellingen. Fig. 4 toont de foto van de gehele experimentele opstelling. De experimenten werden allemaal uitgevoerd in een conventionele celkweek incubator met de volledige setup (met inbegrip van de microfluïdische apparaten, spuitpompen en live cell imaging microscopen) aan de binnenkant van het. De celmigratie resultaten worden in Fig. 5. Fig. 5 (a) toont de bij de experimenten met de live cell imaging ana verzamelde afbeeldingenLyzer, en Fig. 5 (b) en (c) plot de celmigratie trajecten en gemiddelde bewegingen onder de vier combinaties van de ImageJ software plugins geanalyseerd. De resultaten tonen aan dat de gemiddelde celmigratie afstand de controle nul nadert, waarin willekeurige beweging van de cellen in het experiment suggereert. Daarentegen, slechts de chemokine gradiënt, de gemiddelde beweging van cellen naar links, waarbij de SDF-1α concentratie hoger. De resultaten suggereren de SDF-1α chemotaxis gedrag van A549-cellen, die eerder is gerapporteerd. In het experiment met alleen zuurstof verlopen, de gemiddelde beweging van de cellen omhoog, waarbij de zuurstofspanning lager. Interessanter, in het experiment met loodrechte chemokine en zuurstof verlopen, de gemiddelde beweging van de cellen boven en zonder duidelijke beweging in de horizontale richting (richting chemokine gradiënt).
Figuur 1: Vervaardigd PDMS-PC microfluïdische celkweek apparaat. (A) De experimentele foto van de gefabriceerde apparaat dat daarbij genereren loodrecht chemische en zuurstofgradiënten voor celmigratie studies. De chemische gradiënt kanaal is gevuld met blauwe en gele kleurstoffen voor levensmiddelen om het verloop generatie te tonen in de cel cultuur kamer. De zuurstof gradiënt kanaal is gevuld met rode voedsel kleurstof. De schaal bar is 1 cm. (B) Het schema van het microfluïdische apparaat. De toplaag wordt vervaardigd met behulp van PDMS met een ingebedde PC laag als een diffusiebarrière gas efficiënt zuurstof gradiëntregeling in de celkweekkamer. (C) De master matrijzen voor de vervaardiging van de bovenste en onderste lagen. Klik hier ombekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Chemische gradiënt binnen de microfluïdische celkweek apparaat. (A) numeriek gesimuleerd en experimenteel kenmerk fluoresceïne concentratiegradiënt in de celkweekkamer over de breedte van de celkweekkamer (Y-richting). De gelijkenis tussen de gesimuleerde en experimenteel gemeten hellingen aan dat de simulatie goed kan voorspellen de chemische gradiënt. De figuur inzet toont de driedimensionale (3D) model gebouwd voor de simulatie. (B) Numerieke simulatie resultaat van de SDF-1α chemokine gradiënt over de breedte van de celkweekkamer voor celmigratie studies. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Oxygen gradiënt binnen de microfluïdische celkweek apparaat. Experimenteel gemeten zuurstofgradiënten in de celkweekkamer langs de stroomrichting. De gradiënten werden geschat met behulp van de zuurstof-gevoelige fluorescentie kleurstof en beeldanalyse. De hellingen, van links naar rechts van de kamer, worden gekenmerkt, en de resultaten tonen consistente gradiënt profielen over de breedte van de kamer.
Figuur 4: Foto's van de experimentele opstelling. De gehele installatie, met inbegrip van microfluïdische apparaten, spuitpompen en een live-cell imaging microscoop, is geplaatst in een conventionele celkweek incubator voor optimalecelkweekomstandigheden tijdens de experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cel migratie studieresultaten onder loodrechte SDF-1α en zuurstof hellingen. (A) Opnamen die vóór en na de 12-h celmigratie studie. De cel migratie paden kunnen worden geanalyseerd vanuit de veroverde tijd vervallen beelden met behulp van de live-cell imaging microscoop. (B) De cel migratiepaden en de geanalyseerde gemiddelde migratie beweging van de opgenomen beelden tot 4 verschillende helling combinaties: geen verloop, alleen chemokine gradiënt, alleen zuurstof gradiënt, en beide chemokine en zuurstof hellingen. De beelden werden gevangen elke 15 min. De schaal bar is 250 pm. (C) Plots van de gemiddelde celmigratie afstanden in de loodrechte (zuurstof gradiënt) en horizontale (chemokine gradiënt) richtingen onder vier verschillende helling combinaties. De gegevens zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± SD, verkregen uit drie onafhankelijke scheikundedozen en 10 cellen werden geanalyseerd in elk experiment. De statistische significant verschillend (t-test ongepaarde Student, p <0,01) gevonden worden door verschillende letters (a en b) aangeduid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De meest kritische stappen bij de PDMS fabriceren microfluïdische apparaat met een ingebedde PC dunne film zijn: (1) verdrijven van alle bellen bij het plaatsen van de PC film in de PDMS prepolymeer terwijl fabriceren de PDMS-PC toplaag en (2) ervoor zorgen alle PDMS uitharden processen worden uitgevoerd op een goed genivelleerd horizontale vlak. Voor celmigratie experimenten, de meest kritische stappen zijn: (1) het elimineren van de belletjes binnen het microfluïdische apparaat, slangen en spuitpompen tijdens de experimenten; (2) ervoor te zorgen dat de microfluïdische apparaat wordt geplaatst op een goed genivelleerd horizontale vlak tijdens live-cell imaging voor de celmigratie waarneming; en (3) het bijhouden van het apparaat gehydrateerd door toevoeging van DDH 2 O om de petrischaal tijdens de experimenten en ervoor te zorgen dat het water niet is uitgedroogd.
Om de PDMS-PC hybride microfluïdische apparaat met succes vervaardigen zonder delaminatie, is het essentieel om alle luchtbellen te verwijderen gedurende de PC film inbrengen. De PC film kan langzaam worden ingevoegd vanuit een hoek (ongeveer 15 tot 30 graden van de PDMS prepolymeer oppervlak) om bellen genereren tijdens het inbrengen van de PC film in de PDMS prepolymeer voorkomen. Eventueel kan de gehele PDMS prepolymeer met ingebedde PC film in de exsiccator is aangesloten op de vacuümpomp 10 min naar het ingesloten luchtbellen te verdrijven geplaatst. Als de PC film zweeft na het vacuüm proces, kan een pipet tip worden gebruikt om op de PC film naar beneden op de uitgeharde PDMS laag. Herhaal het vacuüm en druk processen indien nodig.
Voor de celexperimenten, weinig luchtbellen essentieel is voor het microfluïdische celkweek. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingebracht in het hele microfluïdische setup (met inbegrip van spuit pompen, slangen, en de microfluïdische apparaat) bij het maken van verbindingen. Als luchtbellen gecreëerd binnen de microfluïdische setup te wijten aan de daling van de oplosbaarheid van gas onder de verhoogde temperatuur van de ervariments in de couveuse, alle experimentele componenten (waaronder de spuiten en leidingen) en reagentia (waaronder het groeimedium, pyrogallol en NaOH) worden in de incubator (minimaal 20 minuten vóór gebruik) die vooraf op de temperatuurvariatie minimaliseren . Spuitpompen vaak warmte van de werking van de motoren in de pomp. Het is meestal aanvaardbaar spuitpompen werken binnen incubators; echter wel controleren de incubator temperatuur tijdens de experimenten. Indien tijdens de experimenten de temperatuur verhoogt, moet extra koeling procedures worden uitgevoerd. Verschillende mogelijke koelmethoden kan worden toegepast, zoals het plaatsen van een doos ijs in de incubator, waardoor het aantal spuitpompen geplaatst in de incubator, hetzij met een incubator met een kracht koelsysteem.
De PDMS-PC microfluïdische celkweek apparaat ontwikkeld in dit document is in staat om op betrouwbare wijze te genereren loodrecht chemische en zuurstof gradiënten for celmigratie studies. De beperking van de ontwikkelde inrichting is dat de gegenereerde zuurstofgradiënt profielen afhangen van het evenwicht tussen zuurstofflux, aangedreven door chemische reactie wegvangen en zuurstof diffusie vanuit de omgevingsatmosfeer, door de inrichting, en in het medium. Hierdoor de zuurstofgradiënt profielen kan niet willekeurig worden gecontroleerd in het apparaat. Vergeleken met bestaande microfluïdische celkweek platforms, de in deze studie ontwikkelde apparaat is de eerste staat is om celcultuuronderzoeken onder combinaties van chemische en zuurstofgradiënten. De gehele inrichting kan worden vervaardigd met de conventionele zachte lithografie replica vormproces zonder vervelende uitlijning en dure instrumentatie. De gradiënten kunnen numeriek worden gesimuleerd en experimenteel kenmerk meer fysiologisch micro-achtige omstandigheden in vitro cel studies. Via een ruimtelijk beperkte chemische reactiewerkwijze met een PC film als gas diffusion barrière, kan de zuurstof gradiënt worden gegenereerd zonder het gebruik van onder druk gasflessen en verfijnde gas flow control units. Bovendien is de installatie vereist slechts kleine hoeveelheden chemicaliën (minder dan 10 ml per dag) aan de zuurstofgradiënten handhaven. Aangezien de zuurstofspanning control lokaal beperkt rond de microfluïdische kanaal, en is de omgevingstemperatuur zuurstofconcentratie niet storen, kan de hele opstelling in een conventionele celkweek incubator geplaatst zonder extra temperatuur, vochtigheid en CO 2 regelinstrumenten. Dientengevolge ontwikkelde apparaat heeft een groot potentieel praktisch gebruik in biologische laboratoria.
Als gevolg van technische beperkingen, hebben cellulaire gedrag onder zuurstof spanningen zelden onderzocht in de bestaande literatuur. Met de hulp van het apparaat die in dit document, kan celkweek onder zuurstof gradiënten worden uitgevoerd op een gemakkelijke manier die cel studies sterk bevordert onder zuurstof hellingen. Furthermore, kan een soortgelijke operatie principe worden toegepast op andere fysiologisch relevante gassen gradiënten, zoals kooldioxide en stikstofoxide genereren in vitro celkweek studies 17. Deze mogelijkheden tonen aan dat de PDMS-PC microfluïdische apparaat toont een groot potentieel voor diverse celkweek toepassingen, waaronder het testen van geneesmiddelen en celproliferatie en migratie assays, om door te gaan in vitro celkweek studies.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
| 10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
| 150 mm Petri dish | Dogger Science | DP-43151 | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
| 3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
| 4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
| Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
| AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
| Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
| Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
| Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
| Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
| Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
| COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
| D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
| Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
| DMEM/F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
| Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
| Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
| JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
| Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
| NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
| Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
| Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
| Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
| Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
| Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
| Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
| Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
| SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
| SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
| Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
| Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
| T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
| Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
| Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |
References
- Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J.
- Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
- Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
- Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
- Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
- McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
- Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
- Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
- Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
- Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
- Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).
