Polydimethylsiloxane-polykarbonat microfluidic Enheter for celle migrasjon Studies Under Perpendicular Kjemisk og Oksygen Graderinger

Abstract

Denne artikkelen rapporterer en microfluidic enhet laget av polydimethylsiloxane (PDMS) med en innebygd polykarbonat (PC) tynn film for å studere cellemigrasjon etter kombinasjoner av kjemiske og oksygen gradienter. Både kjemiske og oksygen gradienter kan i stor grad påvirke celle migrasjon in vivo; men på grunn av tekniske begrensninger, meget lite forskning har vært utført for å undersøke deres effekter in vitro. Anordningen er utviklet i denne forskningen utnyttet en serie av serpentin-formede kanaler for å generere de ønskede kjemiske gradienter og utnytter et romlig begrenset kjemisk reaksjon metode for oksygen gradient generasjon. Retningene av de kjemiske og oksygen gradienter er vinkelrett på hverandre for å muliggjøre enkel migrering resultat tolkning. For effektivt å generere oksygen gradienter med minimal kjemikalieforbruk, blir den innebygde PC tynn film anvendes som en gass diffusjonssperre. Den utviklede microfluidic enhetkan aktiveres ved sprøytepumper og plassert i en konvensjonell celleinkubator i løpet av cellemigreringsforsøk for å muliggjøre oppsett forenkling og celledyrkningsbetingelser optimalisert. I celleforsøk, vi brukte apparatet for å studere vandringer adenocarcinomic menneskelige alveolære basal epitelceller, A549, etter kombinasjoner av chemokin (stromal celle-avledet faktor, SDF-1α) og oksygen gradienter. De eksperimentelle resultater viser at apparatet kan stabilt generere perpendikulære kjemokin og oksygen gradienter og er kompatibel med celler. De migrasjon Resultatene fra denne undersøkelsen tyder på at oksygen gradienter kan spille en viktig rolle i å veilede celle migrasjon, og cellulær oppførsel etter kombinasjoner av gradienter kan ikke forutsies fra de under enkle stigninger. Enheten gir en kraftig og praktisk verktøy for forskere å studere samspillet mellom kjemiske og oksygen gradienter i cellekultur, som kan fremme bedre celle migrasjon studier i flere in vivo-lignende microenviser.

Introduction

Den romlige fordeling av løselige faktorer og oksygen spenning kan regulere en rekke viktige cellulære funksjoner in vivo ^{en, to, tre, fire.} For bedre å undersøke deres effekt på cellene, er en in vitro cellekultur plattformen er i stand til stabilt å generere kjemiske og oksygen gradienter svært ønsket. Forskjellige løselige faktorer spiller sentrale roller i biologiske aktiviteter og påvirke celle atferd. Nylig, på grunn av utvikling av microfluidic teknikker, et antall microfluidic enheter i stand til stabilt å generere kjemiske gradienter har blitt utviklet for å studere cellemigrering ^5. Videre har flere studier avslørte også nødvendigheten av oksygen spenning for in vitro cellekulturer ^{6, 7, 8.} Derimot,kontroll av oksygenspenning for cellekultur bygger hovedsakelig på direkte kjemisk tilsetning for oksygenfangende eller celle inkubatorer med trykkgassflasker. Direkte kjemisk tillegg endrer cellekulturmedium og påvirker cellulære responser. Oksygen kontroll inkubatorer krever spesiell inkubator utforming, nøyaktig gass flytkontroll, og et stort volum av nitrogengass for å oppnå hypoksi forhold. Dessuten er det umulig å styre den romlige fordelingen av oksygen ved hjelp av denne konfigurasjonen, noe som forsinker den cellulære oppførselen studien under forskjellige oksygen spenninger og gradienter. For å overvinne disse begrensningene, har en rekke microfluidic enheter blitt utviklet for å generere oksygen gradienter for cellekultur applikasjoner ^9. Men de fleste av dem betjenes med trykkgasser, noe som kan føre til fordampning og boble generasjons problemer. Derfor har de ofte krever avansert instrumentering og kan ikke være egnet for langsiktig cellekultur studies.

For å overvinne utfordringene og for å studere samspillet mellom kjemiske og oksygen gradienter for cellemigrasjon, har vi utviklet en microfluidic cellekultur enhet laget av polydimethylsiloxane (PDMS) med en innebygd polykarbonat (PC) tynn film ^10. Anordningen er sammensatt av to microfluidic kanal lag som er adskilt av en PDMS membran. Det øverste laget er en PDMS-PC laget for oksygen gradient generasjon; det nederste laget er laget av PDMS for kjemisk gradient generering og cellekultur. Enheten kan samtidig generere vinkelrette kjemiske og oksygen gradienter uten bruk av gassflasker og sofistikerte flyt kontrollsystemer. I enheten, gir PDMS god optisk gjennomsiktighet, gass permeabilitet, og biologisk kompatibilitet for cellekultur og bildebehandling. Den innebygde PC Filmen fungerer som en gass diffusjonssperre for effektiv oksygen spenning kontroll. I mikrofluidkanalen, anvendte vi en serie av serpentin-formet kanals å generere kjemiske gradienter. Designen har vært bredt utnyttes til å generere kjemiske gradienter i microfluidic enheter for ulike programmer på grunn av sin pålitelighet og enkel eksperimentelle oppsettet. Videre kan kjemisk gradient profilene utformes ved å variere kanal geometrier på forhånd med numerisk simulering. For oksygen gradient generasjon, vi tok fordel av romlig begrenset kjemisk reaksjon metode som tidligere ble utviklet i vår lab ^{10, 11, 12.} Oksygenet kan scavenged fra de utpekte områdene uten nitrogen sletting. For praktisk bruk i biologiske laboratorier, er hele eksperimentelle oppsettet kompatibel med konvensjonelle cellekultur inkubatorer. Ved å integrere disse metodene, kan vi samtidig skape stabile kjemiske og oksygen gradienter uten bulk gassflasker og avanserte instrumenter for å studere celle migrasjon.

Protocol

1. Fabrikasjon av microfluidic Device

MERK: Hele microfluidic enheten er fabrikkert ved hjelp av myke litografi kopi molding prosess ^13.

1. Fabrikasjon av muggsopp for PDMS lag i microfluidic enhet
   1. Designe microfluidic kanal mønstre ved hjelp av kommersielt tilgjengelig illustrasjon eller tegning programvare. Send filen til et selskap for høy oppløsning åpenhet fotomasken utskrift ^14.
   2. Rene silisiumskiver med aceton (≥99.5%), isopropylalkohol (IPA; ≥99.9%) og bufret oksyd etse (BOE, 6: 1 _NH4 F.HF). Skyll med avionisert (DI) vann og tørke wafer med nitrogen pistol.
   3. Spin belegge omtrentlig 20 g av negativ fotoresist tone, SU-8 2050, på skivene ved 500 rpm i 15 sekunder og deretter 2000 opm i 30 sek.
      MERK: spin belegg tilstanden skal gi SU-8 2050 bildermotstå lag med en tykkelse på omtrent 75 um på waferne etter optisk litografi.
   4. Myk bake skivene på en 65 ° C varmeplate i 3 minutter og deretter ved 95 ° C i 9 min. Etter den myke bake, utsett wafere ved hjelp av en maske aligner med de utformede åpenhet masker under UV-lys; den totale eksponeringen energi bør være ca 300 mJ / cm ^2. Post-eksponering bake (PEB) waferne ved 65 ° C i 2 minutter og deretter ved 95 ° C i 7 min.
   5. Etter PEB, senk wafere i SU-8 utvikler med sterk uro eller i et ultralydbad (37 kHz og 180 W effektive ultralyd strøm) for 7 min. Skyll wafer med aceton og IPA for å fjerne den gjenværende SU-8.
   6. Plasser skiven og 100 ul av silan (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) inn i en 6 cm diameter petriskål i en desikator forbundet med en membranvakuumpumpe for skivens overflate silanisering for å forhindre uønsket binding. Slå på pumpen i 15 minutter, slå den avOg forsegl eksikator med et vakuum i 30 min.
   7. Ta silanerte wafere ut av tørkeapparat og tape dem til 15 cm diameter petriskåler for følgende myk litografi prosess:
2. Fabrikasjon og sammenstilling av PDMS lag
   1. Fremstilling av PDMS pre-polymeren
      1. Bland PDMS monomer (base) og herdemidlet ved et 10: 1 forhold (v / v). Avgasse blandingen i eksikator oppsettet i 60 min.
   2. Fabrikasjon av PC-embedded topplag
      1. Overføring 2 g av PDMS pre-polymer på formen med de øverste lag fluidkanalmønster for å lage et tynt lag av PDMS. Sett formen i eksikator oppsett for å avgasse PDMS i 60 min.
      2. Plasser formen over natten i en 60 ° C ovn i PDMS herding. Pass på at formen er på et horisontalt plan.
      3. Kjøl ned i formen til værelsetemperatur. Hell ytterligere 13 g av PDMS pre-polymer på formen og avgasse PDMS i the eksikator oppsett for 60 min.
      4. Sakte bygge inn en 1 mm tykk film PC i frisk PDMS lag som en gass diffusjonssperre; utvise noen bobler hvis nødvendig.
      5. Sett formen over natten i 60 ° C ovn, og sørg for at det er på et horisontalt plan.
      6. Kjøl ned herdet PDMS til romtemperatur. Skjær enheten med en skalpell til et område på ca 5,5 x 5 cm ^2, som kan dekke alle kanal mønstre, og skrelle av PDMS skive fra formen.
      7. Punch hull for innløp og utløp ved hjelp av en 2 mm diameter biopsi punch. Oppbevar fabrikkert toppen PDMS-PC lag borte fra ambient støv for senere montering.
   3. Fabrikasjon av bunnlaget PDMS
      1. Hell 11 g av PDMS pre-polymer på formen for bunnlaget. Sett formen i tørkekammer for avgasse PDMS i 60 min. Hold formen over natten i en 60 ° C ovn å kurere PDMS. Pass på at den ligger på et horisontalt plan.
      2. Kjøl ned the PDMS til romtemperatur. Kutt enheten til et område på ca 5,5 x 5 cm ^2, som kan dekke alle kanal mønstre, og skrelle den ut av formen. Oppbevar fabrikkert bunnen PDMS lag fra ambient støv for senere montering.
   4. Fabrikasjon av PDMS membranen
      1. Spin belegge tilnærmet 4 g av PDMS pre-polymer på en silanisert blank skive ved 100 rpm i 90 sekunder og deretter 3000 rpm i 4 sek. Bake spinn-belagt skive i en 60 ° C ovn over natten.
   5. Montering av enheten
      1. Sett fabrikkert PDMS-PC øverste laget og wafer med spin-belagt PDMS membran i en O ₂ plasma overflatebehandling maskin med bindeflatene vendt opp. Behandle PDMS flater med 90 W av O ₂ plasma i 40 sekunder.
      2. Binde topplaget på PDMS membranen rett etter O _to plasma overflatebehandling. Plasser en vekt (ca. 600 g) på toppen av limt lag og legg dem i en60 ° C ovn over natten for å fremme binding.
      3. Kjøle ned de sammenføyde lag til romtemperatur og kuttes membranen bundet til det øverste laget med en skalpell til et område på ca 5,5 x 5 cm ^2, som kan dekke alle kanalmønstre. Skrelle av bundet struktur fra silikonplaten og slå hull på innløp og utløp av kjemiske gradient kanal med en 2 mm diameter biopsi punch.
      4. Plasser den membranbundne øverste laget og den fabrikkerte PDMS bunnlaget i O _to plasma overflatebehandling maskin, med bindeflater vendt oppover, for å aktivere PDMS overflatene ved hjelp av plasma ved 90 V i 40 sekunder.
      5. Knytte de øvre og nedre lagene sammen for liming umiddelbart etter overflatebehandlingen. Plasser en vekt (ca. 600 g) på toppen av hele limt enheten og legg den i en 60 ° C ovn over natten.
      6. Ta hele anordningen fremstilt ut fra ovnen og kjøles det ned til romtemperatur.

2. microfluidic celle migrasjon analysen

MERK: I denne artikkelen bruker vi en vanlig cellelinje, adenocarcinomic menneskelige alveolar basal epitelceller (A549), og en chemokin, stromal celle avledet faktor (SDF-1α), som eksempler. For forskere som arbeider med andre celler og chemokiner, må de justerbare eksperimentelle prosesser tilsvarende.

1. Dag 0: Celle forberedelse
   1. Culture lager av A549-celler i fullstendig vekstmedium inneholdende DMEM-F12 L-glutamin erstatning, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), og 1% (v / v) Antimicrob-antimykotisk oppløsning. Sub-kultur ved dissosiasjon med 0,25% trypsin-EDTA.
   2. Fremstille cellesuspensjoner for forsøkene ved sentrifugering dissosierte cellene ved 140 x g i 3 minutter ved romtemperatur. For microfluidic enhets forsøkene telle cellene ved bruk av et hemocytometer og frø på minst 1 x 10 ⁶ celler i en T75-kolbe med 10 ml av fullstendigvekstmedium.
      MERK: Alle celledyrkningsprosesser utføres i en inkubator med en 37 ° C og _5% CO2 atmosfære.
2. Dag 1: Enhets forberedelse
   1. Plasser enheten i O ₂ plasma maskin og behandle det med O ₂ plasma på 90 W i 40 sekunder for å gjengi mikrofluidkanalen overflater hydrofil.
   2. Umiddelbart etter overflatebehandling, installere to 14 G butte nåler ved direkte sette inn nåler inn i hullene diameter 2 mm stanset inn i PDMS lag på kjemisk gradient kanal viker. Pass på at nålene ikke blokkere microfluidic kanaler. Tegn 0,8 ml DDH ₂ O anvendelse av en 1 ml sprøyte med en stump 14 G-nål. Injiser DDH ₂ O i den kjemiske gradient kanal fra den før vannet renner ut fra begge nåler på inntakene.
   3. Fremstille 1 ml 50 ug / ml fibronektin oppløsning ved fortynning fibronektin lager med Dulbecco & #39; s fosfatbuffret saltoppløsning (DPBS).
   4. Sette mot fibronektin løsning fra utløpet av den kjemiske gradient kanal anvendelse av en 1 ml sprøyte med en stump 14 G-nål inntil oppløsningen strømmer ut fra begge nålene ved innløpene.
   5. Inkuber hele innretningen over natten i et konvensjonelt celledyrkingsinkubator.
3. Dag 2: Celle seeding og mikroskopi bildebehandling
   1. Cell seeding
      1. Aspirere mediet fra cellene som ble dyrket fra dag 0 og vaske cellene med 5 ml DPBS 2 ganger. Aspirer DPBS, tilsett 2 ml trypsin-EDTA, og inkubere cellene i inkubator i 5 minutter for å løsne cellene fra kolbe overflaten.
      2. Vent inntil cellene er frittliggende og suspendert i løsningen og tilsett 8 ml serumfritt medium (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimykotisk oppløsning) til kolben. Overfør all væsken inn i et 15 ml konisk rør og sentrifuge det ved 140 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten etter sentrifugering og tilsette en passende mengde av serumfritt medium for å gjøre den endelige celletettheten 1 x 10 ⁶ celler / ml. Ta ut microfluidic enhet forberedt på dag 1. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller annen automatisk celletelling instrument.
      3. Injisere serumfritt medium fra utløpet av den kjemiske gradient kanal anvendelse av en 1 ml sprøyte med en stump 14 G-nål til mediet strømmer ut fra begge nålene ved innløpene. Injisere 200 ul cellesuspensjon fra utløpet av den kjemiske gradient kanalen.
      4. Observer cellekultur kammer i enheten under et mikroskop for å bekrefte at cellene har blitt introdusert til microfluidic kanal. Plasser enheten i en fuktig beholder (for eksempel en plastboks med DDH ₂ O inne) og oppbevar den på et cellekulturinkubator i 5 timer for å fremme adhesjon av cellene på overflaten enheten.
   2. Utarbeidelse av Reagentene for kjemisk gradient generasjon
      1. Fremstille den kjemiske (SDF-1α) ved den ønskede konsentrasjon (100 ng / ml) i serumfritt medium. Tegn serumfritt medium med og uten den kjemiske inn i to separate 3 ml sprøyter som er koblet til høy renhet slange. Sett opp sprøytene på en sprøytepumpe med en strømningshastighet på 1 mL / minutt for senere bruk.
   3. Utarbeidelse av reagenser for oksygen gradient generasjon
      1. Lage 15 ml 1 M NaOH-løsning og 15 ml 200 mg / ml oppløsning pyrogallol. Tegn NaOH og pyrogallol løsninger i to separate 15 ml sprøyter som er koblet til høy renhet PTFE rør og høy renhet rør, henholdsvis. Sett opp sprøytene på en sprøytepumpe med strømningshastighet på 5 ul / min for senere bruk.
   4. Microfluidic konfigurere enheten
      1. Etter fem timers inkubasjon ta hele enheten ut og legg den på en 15 cm diameter petriskål. Fest enheten i petriskål ved hjelp av lim kitt. OverførPetriskål til en levende celle bildebehandling mikroskop i en inkubator.
      2. Koble slangen fra sprøytene til kjemisk gradient generasjon til inntakene av kjemiske gradient kanal. Koble utløpet til røret som fører til en avfallsreservoaret. Slå på sprøytepumpe med sprøytene for kjemisk gradient generasjon.
      3. Koble høy renhet røret fra sprøytene inneholdende NaOH og pyrogallol til innløpene av oksygen gradient kanalen. Koble slangen til uttaket for å samle avfallet. Slå på sprøytepumpe med sprøytene for oksygen gradient generasjon.
      4. Tilsett ca 15 ml DDH ₂ O til petriskål for å holde enheten fuktig. Sett opp levende celle bildebehandling mikroskop for tidsbortfalt bildetaking, og ta et bilde hvert 15 min.
4. Dag 3: Datainnsamling og analyse
   1. Overfør bildefiler til en datamaskin. Analyser bilder ved hjelp av åpen kildekode bilde enalysis programvare, ImageJ, med en åpen kildekode plugin for manuell tracking (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) og gratis Chemotaxis Tool programvare (http://ibidi.com/xtproducts / no / Programvare-og-bilde-analyse / manuell-bilde-analyse / Chemotaxis-og-Migration-Tool) ^{15, 16.}

3. Karakterisering av Graderinger

Merk: De kjemiske og oksygen gradienter kan være preget før eller etter celleforsøk.

1. Numerisk simulering av den kjemiske gradient
   1. Anslå laminær natur MicroFluidics bruker beregningsfluiddynamikk (CFD) simulering.
2. Eksperimentell karakterisering av oksygen gradient
   1. Fremstille en oksygensensitive fluorescerende fargestoff, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (III) klorid-heksahydrat, oppløsning i vann ved en konsentrasjon på 5mg / ml.
   2. Tegn oksygenfølsomme fargeløsning i to separate 3 ml sprøyter som er koblet til høy renhet slange. Sett opp sprøytene på en sprøytepumpe med strømningshastighet på 1 mL / min (identisk med de strømningshastigheter som benyttes for den kjemiske gradient generasjon).
   3. Koble slangen fra sprøytene til inntakene av kjemiske gradient kanal. Koble utløpet til røret som fører til en avfallsreservoaret. Slå på sprøytepumpe med sprøytene for kjemisk gradient generasjon.
   4. Måle fluorescensintensiteten ved hjelp av et invertert mikroskop med fluorescens eksitasjon lys som passerer gjennom en 470 ± 20 nm optisk filter. Samle emisjons lys gjennom en 515 nm lang-pass utslipp filter ved hjelp av en kule CCD-kamera.
   5. Koble høy renhet røret fra sprøytene inneholdende NaOH og pyrogallol til innløpene av oksygen gradient kanalen. Koble slangen til uttaket for å samle avfallet. Slå på sprøytepumpe med sprøytene for oksygengradient generasjon.
   6. Samle fluorescens bilder av oksygenfølsomme fargestoff som strømmer i cellekulturkammer.
   7. Stopp strømmen for oksygen gradient generasjon og koble fra alle slangen til oksygen generasjon kanal. Koble høy renhet slangen fra gassflaskene til utløpet av oksygen gradient kanalen.
   8. Samle fluorescens bilder av oksygenfølsomme fargestoff som strømmer i cellekulturkammer ved strømmende luft, rent nitrogen, og rent oksygen inn i produksjonsrøret som er koblet til oksygen gradient kanalen.
   9. Estimere oksygen gradienter ved å analysere fluorescens bilder ved hjelp av Stern-Volmer ligning i henhold til referanser 10 og 11.

Representative Results

Fabrikkert PDMS-PC hybrid mikrofluidcellekultur enhet. Fig. 1 viser et bilde og en illustrasjon av microfluidic enheten. Den nederste laget inneholder fire nivåer av serpentin-formet kanaler for å generere løsninger fra reagenser innført fra to adskilte innganger med seks ulike blandingsforhold. Teoretisk de seks ulike blandingsforhold er 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, og 0: 1 (venstre: høyre) mellom de to oppløsningene innføres fra innløpene. De kjemiske gradienter konstruert av de seks forskjellige blandeforhold løsninger kan genereres i cellekulturkammer, som befinner seg nedstrøms. Topp- og bunnlagene er adskilt av en PDMS membran. I det øverste laget, blir reagensene for den oksygenfangende kjemisk reaksjon innført i mikrofluidkanalen fra to separate innløp. Reagensene blandes med hverandre for reaksjonen umiddelbart før flyter på toppen av cellekulturen kammeret for åabsorbere den oksygen fra den nedre profilen, uten direkte kjemisk kontakt. Den innebygde PC-film, med en mindre gass diffusjonskoeffisient i forhold til PDMS, virker som en diffusjonsbarriere som gjør at oksygenfjerningen mer effektiv. Oksygen diffunderer gradvis tilbake til cellekulturen kammeret gjennom de PDMS i nedstrømsområdet for å danne en oksygen gradient langs strømningsretningen. Siden oksygenfangende kjemiske reaksjon er romlig begrenset, blir bare lokale oksygen spenninger påvirket. Som et resultat kan anordningen anvendes i en konvensjonell celle-inkubator uten å forandre sin globale oksygentensjon. I migrerings eksperimentene ble cellene sådd ut på innsiden av cellekulturen kammer for observasjon. Vekstmedium og kjemiske reagenser blir introdusert til enheten ved hjelp av sprøytepumper med nøyaktig kontrollerte strømningsrater.

Karakterisering av kjemiske og oksygen gradienter generert inne i enheten. På grunn av than laminær natur MicroFluidics, flyt atferd kan forutsies ved hjelp av beregningsfluiddynamikk (CFD) simulering. I denne artikkelen har vi konstruert en 3D-modell og utført simulering ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig Multiphysics modellering programvare. Fig. 2 (a) viser en sammenligning mellom eksperimentelt karakterisert fluorescein-konsentrasjonsprofiler over bredden av cellekulturen kammeret basert på fluorescens-intensitetsmålinger og numeriske resultater simuleringen. Avtalen mellom de eksperimentelle og simuleringsresultatene tyder på at CFD modellen kan vel anslå kjemiske gradienter som genereres inne i enheten. Fig. 2 (b) plotter den simulerte SDF-1α gradient dannes i celledyrkingskammeret. Fig. 3 viser oksygen gradient karakterisering resultater ved strømmende oksygenfølsomme fluorescens fargestoff inne i cellekulturen kammeret før celleforsøk. Resultatet viser at en oksygen gradient, som strekker seg fra omtrent 1 til 16%, kan etableres ved hjelp av den ovennevnte protokoll.

Cell migrasjon resultater. Som en demonstrasjon, utførte vi A549-cellemigrering studier under 4 kombinasjoner av kjemokin (SDF-1a) og oksygen gradienter: (1) ingen kjemokin og ingen oksygen-gradienter som en kontroll, (2) med en kjemokin-gradient og uten et oksygen gradient, (3) med en oksygen gradient og uten en kjemokin-gradient, og (4) med begge kjemokin og oksygen gradienter. Fig. 4 viser bilde av hele forsøksoppsettet. Forsøkene ble alle utført i en vanlig cellekultur inkubator med hele oppsettet (inkludert microfluidic enheter, sprøytepumper og levende celle bildebehandling mikroskoper) plassert inni den. De cellemigrering Resultatene er vist i fig. 5. Fig. 5 (a) viser bildene som samles under forsøkene ved hjelp av levende celle bildebehandling analyzer, og fig. 5 (b) og (c) plotter celle migrasjon baner og gjennomsnittlig bevegelser under fire kombinasjoner analysert ved ImageJ programvare med plugins. Resultatene viser at den gjennomsnittlige cellemigrering avstand i styre nærmer seg null, noe som antyder tilfeldig bevegelse av cellene i eksperimentet. I kontrast, med bare kjemokinet gradient, er den gjennomsnittlige bevegelse av cellene mot venstre, hvor den SDF-1α konsentrasjonen er høyere. Resultatene tyder på SDF-1α kjemotaksi oppførselen til A549 celler, som tidligere er blitt rapportert. I forsøket med bare oksygen gradienter, er den gjennomsnittlige bevegelse av cellene oppover, hvor oksygenspenningen er lavere. Mer interessant, i forsøket med vinkelrette kjemokin og oksygen gradienter, er den gjennomsnittlige bevegelse av cellene er oppover og uten noen åpenbar bevegelse i den horisontale retningen (kjemokin gradient retning).

Figur 1: Fabrikkert PDMS-PC microfluidic cellekultur enhet. (A) Den eksperimentelle bilde fremstille anordningen er i stand til på en pålitelig måte å generere perpendikulære kjemiske og oksygen gradienter for celleoverføringsstudier. Den kjemiske gradient kanal er fylt med blå og gule matvarefargestoffer for å demonstrere gradienten generering inne i cellekultur kammeret. Oksygenet gradient kanal er fylt med mat rødt fargestoff. Målestokken er 1 cm. (B) skjematisk av mikrofluidanordningen. Det øverste laget er fabrikkert ved hjelp av PDMS med en innebygd PC lag som gass diffusjonssperre for effektiv oksygen gradient kontroll inne i cellekultur kammeret. (C) stamstøpeformer for fremstilling av de øverste og nederste lag. Klikk her for åse en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Kjemisk gradient inne i mikrofluidcellekulturenheten. (A) Numerisk simulert og eksperimentelt karakterisert fluorescein konsentrasjonsgradient inne i cellekulturkammer over bredden av cellekulturen kammer (Y-retningen). Likheten mellom de simulerte og eksperimentelt målte gradienter viser at simulering kan godt forutsi kjemisk gradient. Figuren innfelt viser den tre-dimensjonale (3D) modell konstruert for simuleringen. (B) Numerisk simulering resultat av SDF-1α kjemokin gradient over bredden av cellekulturen kammeret for cellemigrerings studier. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.

Figur 3: Oksygen gradient inne i mikrofluidcellekulturenhet. Eksperimentelt målte oksygen gradienter inne i cellekultur kammeret langs strømningsretningen. De gradienter ble estimert ved bruk av oksygenfølsomme fluorescens fargestoff og bildeanalyse. Gradientene, fra venstre til høyre i kammeret, er karakterisert, og resultatene viser konsistente gradient profiler på tvers av bredden av kammeret.

Figur 4: Bilder av eksperimentelle oppsettet. Hele oppsettet, inkludert microfluidic enheter, sprøytepumper og en levende celle bildebehandling mikroskop, er plassert inne i en konvensjonell cellekultur inkubator for optimalisertbetingelser cellekultur under forsøkene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Cell migrasjon studie resultater under vinkelrette SDF-1a og oksygen gradienter. (A) Bilder som er tatt før og etter 12-timers cellemigrering studien. De celle migrasjonsveier kan analyseres fra de fangede tidsbortfalt bilder ved hjelp av levende celle bildebehandling mikroskop. (B) De celle migrasjonsveier og analysert gjennomsnittlig migrasjon bevegelse fra de bildene under 4 forskjellige graderings kombinasjoner: ingen gradient, bare chemokine gradient, bare oksygen gradient, og begge chemokin og oksygen graderinger. Bildene ble tatt hver 15 min. Målestokken er 250 mikrometer. (C) Plott av gjennomsnittlig celle migrasjon avstander i vinkelrett (oksygen gradient) og horisontal (chemokin gradient) retninger under fire forskjellige graderings kombinasjoner. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, erholdt fra tre uavhengige forsøkssett, og 10 celler ble analysert i hvert forsøk. De statistiske signifikant forskjellige (uparet t-test, p <0,01) Resultatene er betegnet med forskjellige bokstaver (A og B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De mest kritiske trinn for å fremstille PDMS microfluidic enhet med en innebygd PC tynn film er: (1) å utvise alle boblene når du setter PC-filmen inn i PDMS pre-polymer mens fabrikasjon PDMS-PC øverste laget og (2) å sørge alle PDMS herdeprosessene blir utført på en godt utjevnet horisontalplanet. For cellemigreringsforsøk, de mest kritiske trinn er: (1) eliminering av boblene inne i mikrofluidanordningen, rør, og sprøytepumper i løpet av forsøkene; (2) å sikre at mikrofluid anordningen er plassert på en godt utjevnet horisontalplanet i løpet av levende celle avbildning for den cellemigrering observasjon; og (3) å holde enheten fuktes ved å legge DDH ₂ O til petriskål under forsøkene, og å sørge for at vannet ikke er tørket ut.

For å kunne fremstille PDMS-PC-hybrid mikrofluid anordningen uten delaminering, er det viktig å fjerne alle bobler under PC film innsetting. PC Filmen kan langsomt satt inn fra en vinkel (ca 15 til 30 grader bort fra PDMS pre-polymer overflate) for å hindre at bobler generasjon under innføringen av PC-filmen i de PDMS pre-polymer. Om nødvendig kan det hele PDMS pre-polymer med den innebygde PC filmen anbringes i eksikator koblet til vakuumpumpen for 10 min for å fordrive de fangede bobler. Hvis PC film flyter opp etter vakuumprosessen, kan en pipettespiss brukes til å trykke på PC-en film ned på det herdede lag PDMS. Gjenta vakuum og trykk prosesser om nødvendig.

For celleforsøk, er en mangel på luftbobler kritisk for den mikrofluidcellekultur. Pass på at ingen luftbobler er innført i hele microfluidic oppsett (inkludert sprøyte pumper, rør, og microfluidic enhet) når du kobler til. Hvis luftbobler blir opprettet i mikrofluid oppsett på grunn av reduksjon av løselighet gass under forhøyet temperatur i experiments inne i kuvøsen, kan alle de eksperimentelle komponentene (inkludert sprøyter og produksjonsrøret) og reagenser (inkludert vekstmediet, pyrogallol, og NaOH) plasseres i inkubatoren på forhånd (minst 20 min før bruk) for å minimalisere temperaturvariasjon . Sprøytepumper ofte generere varme ved driften av motorene i pumpene. Det er vanligvis akseptabelt å operere sprøytepumper inne inkubatorer; imidlertid, må sjekke inkubatoren temperatur under forsøkene. Hvis temperaturen løfter under forsøkene, videre kjøling prosedyrer må utføres. Flere mulige kjølemetoder kan anvendes, slik som å plassere en boks av is i kuvøsen, noe som reduserer antall sprøytepumper plassert inne i inkubator, eller ved hjelp av en inkubator med en kraft kjølesystem.

PDMS-PC microfluidic cellekultur enhet utviklet i denne artikkelen er i stand til på en pålitelig måte å generere vinkelrette kjemiske og oksygen gradienter for celle migrasjon studier. Begrensningen av den utviklede enheten er at den genererte oksygen gradient profiler avhengig av balansen mellom oksygen forandring, drevet av kjemisk reaksjon scavenging, og oksygen diffusjon fra ambient atmosfære, gjennom enheten, og inn i mediet. Som et resultat av de oksygen gradient profiler kan gis vilkårlig styrt inne i enheten. Sammenlignet med eksisterende microfluidic cellekultur-plattformer, idet anordningen er utviklet i dette papir er den første som er i stand til å utføre cellekulturstudier i henhold kombinasjoner av kjemiske og oksygen gradienter. Hele enheten kan fremstilles ved hjelp av konvensjonelle myklitografi replika støpeprosessen, uten tidkrevende justering og kostbar instrumentering. De gradienter kan numerisk simuleres og eksperimentelt preget for å gi mer fysiologiske mikrolignende forhold for in vitro cellestudier. Ved hjelp av et romlig begrenset kjemisk reaksjon metode med en PC-film som en gass-diffusion barriere, kan oksygen gradient genereres uten bruk av trykkgassflasker og sofistikerte gass strømningskontrollenhetene. I tillegg krever oppsett bare små mengder av kjemikalier (mindre enn 10 ml per dag) for å opprettholde oksygen gradienter. Siden oksygen spenningskontroll er begrenset lokalt rundt mikrofluidkanalen, og ikke forstyrrer den omgivende oksygenkonsentrasjonen, kan hele oppsettet være plassert inne i et konvensjonelt celledyrkingsinkubator uten ytterligere temperatur, fuktighet og _CO2 kontroll instrumentering. Som et resultat har vi utviklet anordningen stort potensiale for å bli praktisk talt anvendes i biologiske laboratorier.

På grunn av tekniske begrensninger, har mobilnettet atferd under oksygen spenninger sjelden blitt studert i eksisterende litteratur. Ved hjelp av anordningen er utviklet på dette papiret, kan cellekultur under oksygen gradienter utføres på en lettvint måte som i stor grad fremmer cellestudier under oksygen gradienter. furthermore, kan en tilsvarende operasjon prinsippet brukes til å generere andre fysiologisk relevante gassformige graderinger, slik som karbondioksyd og nitrogenoksid, for in vitro cellekulturstudier ^17. Disse funksjonene viser at PDMS-PC microfluidic Enheten viser stort potensial for ulike cellekultur programmer, inkludert drug testing og celleproliferasjon og migrasjon analyser, for å avansere i vitro cellekulturstudier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302104
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Smartgene	6011-000
10 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302151
15 ml Centrifuge Tube	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Falcon 352096
150 mm Petri dish	Dogger Science	DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	78560-45-9
3 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302118
4'' Silicon Dummy Wafer	Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan
Acetone	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	AH3102-000000-72EC
AG Double Expose Mask Aligner	M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan	AG500-4D-D-V-S-H
Antibiotic-Antimyotic solution	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 15240-062
Biopsy punch	Miltex, Plainsboro, NJ	33-31
Blunt needle	JensenGlobal, Santa Barbara, CA	Gauge 14
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Z359629	for cell counting
Buffered Oxide Etch	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	PH3101-000000-72EC
Cell Culture Incubator	Caron, Marietta, OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL, Burlington, MA	Ver. 4.3b	for numerical simulation of chemical gradients in the device
D-PBS	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 14190-144
Desicattor	A-VAC Industries, Anaheim, CA	35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10565-018
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10082
Fibronectin from Human Plasma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F2006
Inverted Fluorescence Microscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMIL LED
Isopropyl Alcohol (IPA)	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek, Seoul, Korea	DBJ01B
Mechanical Convention Oven	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan	1943-0150
Plasma tretment system	Nordson MARCH, Concord CA	PX-250	for oxygen plasma surface treatment
Polycarbonate (PC) film	Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan
Polydimehtylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI	SYLGARD 184
Pyrogallol	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	A13405
Removable Adhesive Putty	3M	860
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA
Spin Coater	ELS Technology, Hsinchu, Taiwan	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem, Westborough, MA	SU-8 2050
SU-8 Developer	MicroChem, Westborough, MA	Y020100
Surgical blade	Feather, Osaka, Japan	5005093	for PDMS cutting
Syringe Pump	Chemyx, Houston, TX	Fusion 400
T75 Cell Culture Flask	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Nunc 156367
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 25200
Tygon PTFE Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Tygon Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH	621