Abstract
Dette papir rapporterer en mikrofluid anordning fremstillet af polydimethylsiloxan (PDMS) med en integreret polycarbonat (PC) tyndfilm at studere cellemigrering under kombinationer af kemiske og ilt gradienter. Både kemiske og ilt gradienter kan i høj grad påvirke celle migration in vivo; men på grund af tekniske begrænsninger, der er udført meget lidt forskning for at undersøge deres virkninger in vitro. Indretningen er udviklet i denne forskning drager fordel af en række serpentine-formede kanaler til at generere de ønskede kemiske gradienter og udnytter et rumligt begrænset kemisk reaktion fremgangsmåde til oxygen gradient generation. Retningerne af kemiske og ilt gradienter er vinkelrette på hinanden for at muliggøre enkel migration resultat fortolkning. For effektivt at generere ilt gradienter med minimalt kemikalieforbrug, er den integrerede PC tyndfilm anvendes som en gasdiffusionsspærre. Den udviklede mikrofluidapparatkan aktiveres af sprøjtepumper og anbringes i en konventionel celle inkubator under celle migrationseksperimenter at muliggøre opsætning forenkling og optimerede celledyrkningsbetingelser. I celle eksperimenter, brugte vi enheden til at studere vandringer adenocarcinomic menneskelige alveolære basale epitelceller, A549, under kombinationer af chemokin (stromacelle--afledt faktor, SDF-1α) og ilt gradienter. De eksperimentelle resultater viser, at indretningen stabilt kan generere vinkelrette kemokin og ilt gradienter og er kompatibel med cellerne. Resultaterne af migration undersøgelse viser, at ilt gradienter kan spille en væsentlig rolle i at vejlede celle migration, og cellulære adfærd under kombinationer af gradienter kan ikke forudsiges fra dem under enkelte stigninger. Enheden giver et stærkt og praktisk værktøj for forskerne at studere samspillet mellem kemiske og ilt gradienter i cellekultur, som kan fremme bedre undersøgelser celle migration i mere in vivo-lignende microenvisempel.
Introduction
Den rumlige fordeling af opløselige faktorer og oxygenspænding kan regulere en række vigtige cellulære funktioner in vivo 1, 2, 3, 4. For bedre at undersøge deres virkning på celler, der er en in vitro cellekultur platform i stand til stabilt at frembringe kemiske og ilt gradienter stærkt ønsket. Forskellige opløselige faktorer spiller afgørende roller i biologiske aktiviteter og påvirke cellulære adfærd. For nylig, på grund af udviklingen af mikrofluide teknikker, en række mikrofluide anordninger i stand til stabilt genererer kemiske gradienter er blevet udviklet til at studere cellemigrering 5. Endvidere har flere undersøgelser afslørede også nødvendigheden af oxygenspænding til in vitro-cellekulturer 6, 7, 8. Imidlertid,kontrol af ilt spænding til celledyrkning er hovedsageligt afhængig direkte kemisk tillæg for oxygenindfangende eller celle inkubatorer med tryk gasflasker. Direkte kemisk tilsætning ændrer celledyrkningsmediet og påvirker de cellulære responser. Oxygen kontrol inkubatorer kræver særlig inkubator design, præcis gasstrømningsstyringsenhed, og et stort volumen af nitrogengas for at opnå hypoxi betingelser. Desuden er det umuligt at styre den rumlige fordeling af ilt ved hjælp af denne opsætning, som forsinker cellulære adfærd studiet under forskellige ilt spændinger og stigninger. For at overvinde disse begrænsninger, har en række mikrofluidenheder blevet udviklet til at generere ilt gradienter for celledyrkningsapplikationer 9. Men de fleste af dem betjenes med gasser under tryk, som kan forårsage fordampning og boble generation problemer. Derfor er de ofte kræver sofistikerede instrumentering og er muligvis ikke pålidelige til langvarig cellekultur studies.
For at overvinde de udfordringer og yderligere undersøge samspillet mellem kemiske og ilt gradienter for celle migration, vi udviklet en mikrofluid cellekultur enhed lavet af polydimethylsiloxan (PDMS) med en integreret polycarbonat (PC) tyndfilm 10. Indretningen består af to mikrofluide kanal lag adskilt af en PDMS membran. Det øverste lag er en PDMS-PC lag for oxygen gradient generation; det nederste lag er fremstillet af PDMS til kemisk gradient generering og cellekultur. Enheden kan samtidig generere vinkelret kemiske og ilt gradienter uden at bruge gasflasker og avancerede systemer gennemstrømning. I enheden, PDMS giver stor optisk transparens, gas gennemtrængelighed, og biologisk forenelighed for cellekultur og billedbehandling. Den integrerede PC film fungerer som en gas diffusion barriere for effektiv ilt spænding kontrol. I mikrofluid kanal, anvendte vi en serie af serpentine-formet kanals at generere kemiske gradienter. Designet er blevet bredt udnyttet til at generere kemiske gradienter i mikrofluidenheder til forskellige applikationer på grund af dens pålidelighed og nem forsøgsopstilling. Desuden kan kemisk gradient profiler de designes ved at variere kanal geometrier forhånd med numerisk simulering. For ilt gradient generation, tog vi fordel af rumligt begrænset kemiske reaktion metode, der tidligere blev udviklet i vores laboratorium 10, 11, 12. Ilten kan indfanges af de udpegede områder uden kvælstof udrensning. Til praktisk brug i biologiske laboratorier, hele forsøgsopstillingen er kompatibel med konventionelle celle kultur væksthuse. Ved at integrere disse metoder, kan vi samtidig generere stabile kemiske og ilt gradienter uden bulk gasflasker og sofistikeret instrumentering for at studere celle migration.
Protocol
1. Fremstilling af den mikrofluidapparatet
BEMÆRK: Hele mikrofluidanordning er fremstillet ved hjælp af den bløde litografi replika støbeproces 13.
- Fremstilling af forme til PDMS lag i mikrofluidapparat
- Design af mikrofluide kanal mønstre ved hjælp af kommercielt tilgængelige illustration eller tegning software. Indsend filen til et selskab for høj opløsning gennemsigtighed fotomaske udskrivning 14.
- Rene silicium wafers med acetone (≥99.5%), isopropylalkohol (IPA; ≥99.9%) og pufret oxid etch (BOE; 6: 1 NH4 F.HF). Skyl med deioniseret (DI) vand og dehydrere wafer med en nitrogen pistol.
- Spin coat omtrentlige 20 g negativ tone fotoresist, SU-8 2050 på waferne ved 500 rpm i 15 sekunder og derefter 2.000 rpm i 30 sek.
BEMÆRK: spin-coating betingelse bør give SU-8 2050 fotomodstå lag med en tykkelse på ca. 75 um på wafers efter optisk litografi. - Blød bage waferne på en 65 ° C varmeplade i 3 minutter og derefter ved 95 ° C i 9 min. Efter den bløde bage, udsætte vafler ved hjælp af en maske aligner med de designede gennemsigtighed masker under UV-lys; den samlede eksponering energi bør være omkring 300 mJ / cm2. Efter eksponering bage (PEB) waferne ved 65 ° C i 2 minutter og derefter ved 95 ° C i 7 min.
- Efter PEB, fordybe vaflerne i SU-8 udvikler med stærk agitation eller i ultralydsbad (37 kHz og 180 W effektiv ultralyd magt) i 7 min. Skyl wafer med acetone og IPA til fjernelse af resterende SU-8.
- Placer skiven og 100 pi silan (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) i en 6 cm diameter petriskål i en ekssikkator forbundet med en membran vakuumpumpe til wafer overfladen silanisering for at forhindre uønsket binding. Tænd pumpen i 15 min, slukke denOg forsegle ekssikkator med et vakuum i 30 minutter.
- Tag silaniserede vafler ud af ekssikkator og tape dem til 15 cm diameter petriskåle til følgende bløde litografi proces:
- Fabrikation og samling af PDMS lag
- Fremstilling af PDMS pre-polymer
- Bland PDMS monomer (base) og hærdningsmidlet ved et 10: 1 forhold (volumen / volumen). Afgasses blandingen i ekssikkator setup for 60 min.
- Fremstillingen af PC-embedded toplag
- Overfør 2 g PDMS pre-polymer på formen med de øverste lag fluide Kanalmønstre at gøre et tyndt lag af PDMS. Placer formen i ekssikkator opsætningen til afgasse PDMS i 60 min.
- Placer støbeformen natten over i en 60 ° C ovn i PDMS hærdning. Sørg for, at formen er på en vandret plan.
- Afkøle formen til stuetemperatur. Hæld yderligere 13 g PDMS pre-polymer på formen og afgasses PDMS i the ekssikkator setup for 60 min.
- Langsomt indlejre en 1 mm tyk PC film i den friske PDMS lag som en gas diffusion barriere; bortvise eventuelle bobler, hvis nødvendigt.
- Sæt formen natten over i 60 ° C ovn, og sørg for, at det er på et vandret plan.
- Køl ned hærdede PDMS til stuetemperatur. Skær enhed med en skalpel til et område på ca. 5,5 x 5 cm 2, som kan dække alle kanal mønstre, og skrælle PDMS plade fra formen.
- Punch huller til ind- og udløb ved hjælp af en 2 mm diameter biopsi punch. Opbevar fabrikerede top PDMS-PC lag væk fra omgivende støv til senere montering.
- Fabrikation af bunden PDMS lag
- Hæld 11 g af PDMS pre-polymer på formen i det nederste lag. Placer støbeformen i ekssikkator for at afgasse PDMS i 60 minutter. Hold formen natten over i en 60 ° C varm ovn for at hærde PDMS. Sørg for, at den ligger på et vandret plan.
- Køl ned the PDMS til stuetemperatur. Skær enheden til et areal på ca. 5,5 x 5 cm 2, som kan dække alle kanal mønstre, og flå det af formen. Opbevar fabrikerede bunden PDMS lag væk fra omgivende støv til senere montering.
- Fremstilling af PDMS-membran
- Spin coat omtrentlige 4 g PDMS pre-polymer på en silaniseret blank wafer ved 100 rpm i 90 sek og derefter 3.000 rpm i 4 sek. Bage spin-coated wafer i en 60 ° C ovn natten over.
- Samling af indretningen
- Placer fabrikerede PDMS-PC toplag og waferen med spin-coated PDMS membran i en O 2 plasma overfladebehandling maskine med limfladerne opad. Behandl PDMS overflader med 90 W af O 2 plasma til 40 sek.
- Binde det øverste lag på PDMS membranen lige efter O 2 plasma overfladebehandling. Placer en vægt (ca. 600 g) på toppen af de bundne lag og læg dem i et60 ° C ovn natten over til fremme binding.
- Afkøle de bundne lag til stuetemperatur og skæres membranen bundet til det øverste lag med en skalpel til et område på ca. 5,5 x 5 cm 2, som kan dække alle Kanalmønstre. Skrælle bundet struktur fra silicium wafer og punch huller på indløb og udløb af kemiske gradient kanal ved hjælp af en 2 mm diameter biopsi punch.
- Placer membran-bundne toplag og fabrikerede PDMS nederste lag i O 2 plasma overfladebehandling maskine, med limfladerne opad, for at aktivere PDMS overflader ved hjælp af plasmaet ved 90 W i 40 sek.
- Fastgør den øverste og nederste lag sammen til binding umiddelbart efter overfladebehandlingen. Placer en vægt (ca. 600 g) på toppen af hele bundet enhed og sætte det i en 60 ° C ovn natten over.
- Tage hele fremstillede anordning ud af ovnen og køles ned til stuetemperatur.
- Fremstilling af PDMS pre-polymer
2. Mikrofluid cellemigrationsassay
BEMÆRK: I dette papir, bruger vi en almindeligt anvendt cellelinie, adenocarcinomic menneske alveolær basal epitelcelle (A549), og et kemokin, stromal celleafledt faktor (SDF-1α), som eksempler. For forskere, der arbejder på andre celler og kemokiner, bedes du justere de eksperimentelle processer i overensstemmelse hermed.
- Dag 0: Cellepræparation
- Kultur bestanden af A549-celler i komplet vækstmedium indeholdende DMEM F12 L-glutamin substitut, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (v / v) Antimicrob-antimykotisk opløsning. Sub-kultur ved dissociation med 0,25% trypsin-EDTA.
- Forbered cellesuspensioner for eksperimenterne ved centrifugering dissocierede celler ved 140 xg i 3 min ved stuetemperatur. For de mikrofluide eksperimenter enheden, tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer og frø mindst 1 x 10 6 celler i en T75 kolbe med 10 ml kompletvækstmedium.
BEMÆRK: Alle cellekultur processer udføres i en inkubator med en 37 ° C og 5% CO2-atmosfære.
- Dag 1: forberedelse Device
- Placer enheden i O 2 plasma maskine og behandle det med O 2 plasma ved 90 W for 40 sekunder at gøre mikrofluid kanal overflader hydrofile.
- Umiddelbart efter overfladebehandlingen, installere to 14 g stump nåle ved direkte indsættelse af nålene i huller i 2 mm diameter udstanset i PDMS lag ved de kemiske gradient kanal indløb. Sørg for, at nåle ikke blokerer de mikrofluide kanaler. Tegn 0,8 ml Hedeselskabet 2 O anvendelse af en 1 ml sprøjte med en stump 14 G nål. Sprøjt Hedeselskabet 2 O i den kemiske gradient kanal fra den, før vandet strømmer ud fra begge nåle på indgangene.
- Forbered 1 ml 50 ug / ml fibronectin opløsning ved fortynding fibronectin lager med Dulbecco & #39; s phosphatpufret saltvand (DPBS).
- Tilføre fibronectin opløsningen fra udløbet af den kemiske gradient kanal under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en stump 14 G nål, indtil opløsningen strømmer ud fra begge nåle på indløbene.
- Inkubér hele anordningen natten over i en konventionel cellekultur inkubator.
- Dag 2: Cell såning og mikroskopi billedbehandling
- cellepodning
- Aspirer mediet fra cellerne, der var dyrket siden dag 0 og vaske cellerne med 5 ml DPBS 2 gange. Aspireres DPBS, tilsættes 2 ml trypsin-EDTA og inkuberes cellerne i inkubatoren i 5 min for at frigøre cellerne fra kolben overflade.
- Vent, indtil cellerne er fritliggende og suspenderes i opløsningen, og der tilsættes 8 ml serum-frit medium (DMEM F12 + 1% (vol / vol) Antimicrob-antimykotisk opløsning) til kolben. Overfør al væsken i et 15 ml konisk rør og centrifugeres den ved 140 xg i 5 minutter under stuetemperatur. Aspirer supernatanten efter centrifugering og tilsætte en passende mængde af det serumfrie medium at foretage den endelige celledensitet 1 x 10 6 celler / ml. Tag mikrofluidapparat fremstillet på dag 1. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer eller en anden automatisk instrument celletælling.
- Injicer serum-frit medium fra udløbet af den kemiske gradient kanal under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en stump 14 G nål, indtil mediet strømmer ud fra begge nåle på indløbene. Injicer 200 pi af cellesuspensionen fra udløbet af den kemiske gradient kanal.
- Observere celledyrkningskamret i indretningen under et mikroskop for at bekræfte, at cellerne er blevet introduceret til den mikrofluid kanal. Placer enheden i et fugtigt beholder (fx en plastboks med Hedeselskabet 2 O indvendigt) og holde det i en cellekultur inkubator i 5 timer for at fremme vedhæftningen af cellerne på enhedens overflade.
- Fremstilling af reagenser til kemisk gradient generation
- Forbered kemikaliet (SDF-1α) i den ønskede koncentration (100 ng / ml) i serum-frit medium. Tegn serum-frit medium med og uden kemisk i to separate 3 ml sprøjter forbundet til høj renhed slange. Oprettet sprøjterne på en sprøjtepumpe med en strømningshastighed på 1 ul / min til senere brug.
- Fremstilling af reagenser til oxygen gradient generation
- Gør 15 ml 1 M NaOH-opløsning og 15 ml 200 mg / ml pyrogallol opløsning. Tegn NaOH og pyrogallol løsninger i to separate 15 ml sprøjter forbundet med høj renhed PTFE-slange og høj renhed slanger, henholdsvis. Oprettet sprøjterne på en sprøjtepumpe med strømningshastighed på 5 ul / min til senere brug.
- setup mikrofluidapparat
- Efter 5 timers inkubation tage hele enheden ud og læg den på en 15 cm diameter petriskål. Fastgør enheden i petriskålen hjælp klæbende kit. OverførPetriskål til en live cell imaging mikroskop i en inkubator.
- Tilslut slangen fra sprøjterne til den kemiske gradient generation til indløb af den kemiske gradient kanal. Tilslut udløbet til rør, der fører til et reservoir affald. Tænd for sprøjtepumpen med sprøjterne til kemisk gradient generation.
- Tilslut høj renhed slangen fra sprøjterne indeholdende NaOH og pyrogallol til indløbene af ilt gradient kanal. Tilslut slangen til stikkontakten for at indsamle affaldet. Tænd for sprøjtepumpen med sprøjterne for oxygen gradient generation.
- Tilsæt ca. 15 ml Hedeselskabet 2 O til petriskålen at holde enheden fugtes. Opsætning live cell imaging mikroskop for tid-bortfaldet billedoptagelse, og tage et billede hver 15 min.
- cellepodning
- Dag 3: indsamling og analyse af data
- Overfør de erobrede billedfiler til en computer. Analyser billederne ved hjælp af en open source billede enANALYSE software, ImageJ, med en open source plugin til manuel sporing (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) og en gratis Kemotaksi Tool software (http://ibidi.com/xtproducts / da / Software-og-Image-analyse / manuel-Image-analyse / Kemotaksis-og-Migration-Tool) 15, 16.
3. Karakterisering af gradienterne
BEMÆRK: De kemiske og ilt gradienter kan karakteriseres før eller efter den celle eksperimenter.
- Numerisk simulering af den kemiske gradient
- Vurdere laminar flow natur mikrofluidik hjælp beregningsmæssige fluide dynamik (CFD) simulering.
- Eksperimentel karakterisering af ilt gradient
- Forbered et oxygen-sensitive fluorescerende farvestof, tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (III) chlorid-hexahydrat, opløsning i vand ved en koncentration på 5mg / ml.
- Tegn oxygen-sensitive farvestof opløsning i to separate 3 ml sprøjter forbundet til høj renhed slange. Oprette sprøjterne på en sprøjtepumpe med strømningshastighed på 1 ul / min (identiske med de strømningshastigheder, der anvendes til den kemiske gradient generation).
- Tilslut slangen fra sprøjterne til indløbene for den kemiske gradient kanal. Tilslut udløbet til rør, der fører til et reservoir affald. Tænd for sprøjtepumpen med sprøjterne til kemisk gradient generation.
- Mål fluorescensintensiteten ved anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop med excitationslyset passere gennem en 470 ± 20 nm optisk filter. Saml emissionen lys gennem et 515 nm lang-pass emission filter ved hjælp af en cool CCD-kamera.
- Tilslut høj renhed slangen fra sprøjterne indeholdende NaOH og pyrogallol til indløbene af ilt gradient kanal. Tilslut slangen til stikkontakten for at indsamle affaldet. Tænd for sprøjtepumpen med sprøjterne for oxygengradient generation.
- Saml fluorescens billeder af oxygen-følsomme farvestof strømmer i celledyrkningskamret.
- Stop flow for ilt gradient generation og afbryd alle slangen til ilt generation kanal. Tilslut høj renhed slangen fra gasflaskerne til udløbet af den ilt gradient kanal.
- Saml fluorescens billeder af oxygen-følsomme farvestof strømmer i celledyrkningskamret når strømmende luft, ren nitrogen, og ren ilt ind i rørledningen forbundet til oxygen gradient kanal.
- Vurdere ilt gradienter ved at analysere fluorescens billeder ved hjælp af Stern-Volmer ligningen ifølge Referencer 10 og 11.
Representative Results
Fremstillet PDMS-PC hybrid mikrofluid cellekultur-enhed. Fig. 1 viser et foto og en illustration af mikrofluidapparatet. Det nederste lag indeholder fire niveauer af slangeformede-formede kanaler til at generere løsninger fra reagenser indført fra to adskilte indløb med seks forskellige blandingsforhold. Teoretisk de seks forskellige blandingsforhold er 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, og 0: 1 (venstre: højre) mellem de to løsninger, der indføres fra indløbene. De kemiske gradienter konstrueret ved seks forskellige blandings--forholdet løsninger kan genereres i celledyrkningskamret, placeret nedstrøms. De øverste og nederste lag er adskilt af en PDMS membran. I toplaget, er reagenserne til oxygenindfangende kemiske reaktion indføres i mikrofluid kanal fra to separate indløb. Reagenserne blandes med hinanden til reaktionen umiddelbart før flyder oven på celledyrkningskamret tilskyllepumpetab ilt fra bunden kanal, uden direkte kemisk kontakt. Den indlejrede PC film, med en mindre gas diffusionskoefficient sammenlignet med PDMS, virker som en diffusionsbarriere, der gør oxygenfjernende mere effektiv. Oxygen diffunderer gradvist tilbage til celledyrkningskamret gennem PDMS i nedstrøms området for at danne et oxygen gradient langs strømningsretningen. Da oxygenopfangende kemiske reaktion rumligt er begrænset, er kun lokale oxygenspændinger påvirket. Som et resultat heraf kan anordningen anvendes i en konventionel celle inkubator uden at ændre dets globale oxygenspænding. I migrationseksperimenterne podes celler inde i celledyrkningskamret til observation. Vækstmediet og kemiske reagenser introduceres til enheden ved hjælp af sprøjtepumper med præcist styrede flow.
Karakterisering af kemiske og ilt gradienter frembragt inde i enheden. Grundet than laminar flow natur mikrofluidik, flow adfærd kan forudsiges ved hjælp af beregningsmæssige fluide dynamik (CFD) simulering. I dette papir, vi bygget en 3D-model og udført simuleringen med en kommercielt tilgængelig multifysik modellering software. Fig. 2 (a) viser en sammenligning mellem eksperimentelt karakteriseret fluorescein koncentrationsprofiler tværs over bredden af celledyrkningskamret baseret på målinger fluorescens intensitet og numeriske simulering resultater. Aftalen mellem de eksperimentelle og simulation resultater tyder på, at CFD-modellen godt kan vurdere de kemiske gradienter genereret inde i enheden. Fig. 2 (b) plotter den simulerede SDF-1α gradient frembragt i celledyrkningskamret. Fig. 3 viser ilt gradient karakterisering resultater ved at strømme oxygen-sensitive fluorescens farvestof inde i celledyrkningskamret før cellen eksperimenter. Resultatet indikerer, at en ilt gradient, der spænder fra ca. 1 til 16%, kan fastslås ved hjælp af den førnævnte protokol.
Celle migrationsresultater. Som en demonstration, udførte vi A549 cellemigration undersøgelser under 4 kombinationer af chemokin (SDF-1a) og ilt gradienter: (1) ingen kemokin og ingen ilt gradienter som en kontrol, (2) med en chemokin gradient og uden et oxygen-gradient, (3) med en ilt gradient og uden et kemokin gradient, og (4) med både chemokin og ilt gradienter. Fig. 4 viser foto af hele forsøgsopstillingen. Forsøgene blev alle udført i en konventionel cellekultur inkubator med hele opsætningen (herunder mikrofluidenheder, sprøjtepumper og levende celler mikroskoper) anbragt inde i det. Resultaterne af cellemigration er vist i fig. Fem. Fig. 5 (a) viser de billeder, der er indsamlet under forsøgene under anvendelse af levende celler anaLyzer, og fig. 5 (b) og (c), plotter celle migration baner og gennemsnitlige bevægelser under de fire kombinationer analyseret af ImageJ software med plugins. Resultaterne viser, at den gennemsnitlige cellemigrering afstand i kontrollen nærmer sig nul, hvilket tyder tilfældig bevægelse af cellerne i eksperimentet. I modsætning, med kun kemokinet gradient, den gennemsnitlige bevægelse af cellerne er mod venstre, hvor SDF-1α koncentrationen er højere. Resultaterne tyder SDF-1α kemotaksi adfærd A549-celler, som tidligere er blevet rapporteret. I eksperimentet med kun ilt gradienter, den gennemsnitlige bevægelse af cellerne er opad, hvor oxygenspændingen er lavere. Mere interessant, i forsøget med vinkelrette kemokin og ilt gradienter, den gennemsnitlige bevægelse af cellerne er opad og uden nogen indlysende bevægelse i vandret retning (chemokin gradient retning).
Figur 1: Fremstillet PDMS-PC mikrofluid cellekultur enhed. (A) Den eksperimentelle foto af den færdige enhed i stand til pålideligt at generere vinkelrette kemiske og ilt gradienter for celle migration undersøgelser. kemisk gradient kanal er fyldt med blå og gule farvestoffer til levnedsmidler at demonstrere gradient generation inden i celledyrkningskamret. Den ilt gradient kanal er fyldt med rødt mad farvestof. Skalaen bar er 1 cm. (B) Den skematiske af mikrofluidapparatet. Det øverste lag er fremstillet under anvendelse af PDMS med en integreret PC lag som en gas diffusionsbarriere for effektiv oxygen gradient kontrol inde i celledyrkningskamret. (C) Master forme til fremstilling af de øverste og nederste lag. Klik her for atse en større version af dette tal.
Figur 2: Kemisk gradient inde i mikrofluid cellekultur enhed. (A) Numerisk simuleret og eksperimentelt kendetegnet fluorescein koncentrationsgradient inde i celledyrkningskamret over bredden af cellekulturkammerets (Y-retning). Ligheden mellem de simulerede og eksperimentelt målte gradienter indikerer, at simuleringen godt kan forudsige kemiske gradient. Figuren indsatte viser den tredimensionale (3D) model konstrueret til simulering. (B) Numerisk simulering resultat af SDF-1α kemokin-gradient tværs over bredden af celledyrkningskamret for celle migrationsundersøgelser. Klik her for at se enstørre version af denne figur.
Figur 3: Oxygen gradient inde i mikrofluid cellekultur enhed. Eksperimentelt målte ilt gradienter i celledyrkningskamret langs strømningsretningen. Gradienterne blev estimeret ved anvendelse af oxygen-sensitive fluorescerende farvestof og billedanalyse. Gradienterne, fra venstre mod højre af kammeret, er karakteriseret, og resultaterne viser konsistente gradientprofiler i bredden af kammeret.
Figur 4: Billeder af forsøgsopstillingen. Hele opsætningen, herunder mikrofluidenheder, sprøjtepumper og en live cell imaging mikroskop, er placeret inde i en konventionel cellekultur inkubator til optimeretcelledyrkningsforhold under forsøgene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Cell migration undersøgelsens resultater under vinkelrette SDF-1a og ilt gradienter. (A) Billeder optaget før og efter 12 timers cellemigrering undersøgelse. De celle migration stier kan analyseres fra tilfangetagne tid-bortfaldet billeder med levende celler mikroskop. (B) De celle migration stier og den analyserede gennemsnitlige bevægelse migration fra det optagne billeder under 4 forskellige gradient kombinationer: ingen gradient, kun chemokin gradient, kun ilt gradient, og begge chemokin og ilt gradienter. Billederne blev fanget hver 15 min. Skalaen bar er 250 um. (C) Plots af de gennemsnitlige celle migration afstande i den vinkelrette (ilt gradient) og horisontal (chemokin gradient) retninger under fire forskellige gradient kombinationer. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD, opnået fra tre uafhængige forsøg sæt, og 10 celler blev analyseret ved hvert forsøg. De statistiske signifikant forskellige (uparret t-test, p <0,01) resultater er betegnet med forskellige bogstaver (a og b). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De mest kritiske skridt til at fremstille PDMS mikrofluidanordning med en integreret PC tynd film er: (1) at udstøde alle boblerne, når du sætter pc'en film i PDMS pre-polymer, mens opdigte PDMS-PC øverste lag og (2) at sikre alle PDMS hærdningsprocesser udføres på en godt nivelleret vandret plan. For celle migration eksperimenter, de mest kritiske trin er: (1) at fjerne boblerne i mikrovæskeanordning, slanger, og sprøjtepumper løbet forsøgene; (2) at sikre, at mikrofluidapparat placeres på et godt nivelleret vandret plan under levende celler til observation cellen migration; og (3) at holde enheden fugtet ved at tilføje Hedeselskabet 2 O til petriskålen under forsøgene og at sikre, at vandet ikke er tørret ud.
For at kunne fremstille PDMS-PC hybrid mikrovæskeanordning uden delaminering, er det afgørende at fjerne alle bobler under PC film indsættelse. PC Filmen kan indføres langsomt fra en vinkel (omkring 15 til 30 grader væk fra PDMS præpolymer overflade) for at forhindre boblerne generation under indføringen af pc'en film i PDMS pre-polymer. Om nødvendigt kan hele PDMS pre-polymer med den integrerede PC film placeres i ekssikkator forbundet til vakuumpumpen i 10 min for at uddrive de fangne bobler. Hvis pc'en filmen flyder op efter vakuum proces, kan en pipettespids anvendes til at trykke på PC film ned på det hærdede PDMS lag. Gentag vakuum og tryk processer om nødvendigt.
For cellen eksperimenter, manglende luftbobler er kritisk for mikrofluid cellekultur. Sørg for, at der ikke indføres luftbobler i hele mikrofluid setup (herunder sprøjtepumper, slanger, og mikrofluid enhed), når du foretager tilslutninger. Hvis der skabes luftbobler inden mikrofluid setup følge af faldet af gas opløselighed under den forhøjede temperatur af experiments inde i inkubatoren, kan alle de eksperimentelle komponenter (herunder sprøjter og slanger) og reagenser (herunder vækstmediet, pyrogallol, og NaOH) anbringes i inkubatoren forhånd (mindst 20 minutter før brug) for at minimere variationen af temperaturen . Sprøjtepumper ofte frembringe varme fra driften af motorerne i pumperne. Det er normalt acceptabelt at operere sprøjtepumper inde væksthuse; imidlertid gør kontrollere inkubatoren temperatur under forsøgene. Hvis temperaturen hæver under forsøgene, skal udføres yderligere afkøling procedurer. Adskillige mulige kølemetoder kan anvendes, såsom at placere en boks på is i rugemaskine reducere antallet af sprøjtepumper placeret inde i inkubatoren, eller under anvendelse af en inkubator med en kraft kølesystem.
Den PDMS-PC mikrofluid cellekultur enhed i dette dokument er i stand til pålideligt at generere vinkelrette kemiske og ilt gradienter for celle migration undersøgelser. Begrænsningen af den udviklede indretning er, at de frembragte oxygen gradientprofiler afhænger af balancen mellem oxygen flux, drevet af kemisk reaktion scavenging, og oxygen diffusion fra den omgivende atmosfære, gennem anordningen, og i mediet. Som et resultat, ilt gradientprofiler kan ikke vilkårligt styres inde i enheden. Sammenlignet med eksisterende mikrofluide cellekultur platforme, indretningen i dette dokument er den første der kan udføre studier af cellekulturer under kombinationer af kemiske og ilt gradienter. Hele indretningen kan fremstilles ved hjælp af konventionelle bløde litografi replika støbeproces, uden trættende justering og dyre instrumenter. De gradienter kan numerisk simuleres og eksperimentelt karakteriseret at give mere fysiologiske microenvironment-lignende betingelser for in vitro celle studier. Ved at anvende et rumligt begrænset kemisk reaktion metode med en PC film som en gas diffusion barriere, kan ilt gradient genereres uden brug af tryk gasflasker og avancerede gas flow styreenheder. Derudover opsætning kræver kun små mængder af kemikalier (mindre end 10 ml pr dag) for at opretholde ilt gradienter. Da oxygenspændingen kontrol er begrænset lokalt omkring mikrofluid kanal, og ikke forstyrrer koncentrationen omgivende oxygen kan hele opsætningen anbringes inde i en konventionel cellekultur inkubator uden yderligere temperatur, fugtighed og CO 2 Instrumentering. Som et resultat heraf udviklede enhed har stort potentiale til at blive anvendt i praksis i biologiske laboratorier.
På grund af tekniske begrænsninger, har cellulære adfærd under ilt spændinger sjældent blevet undersøgt i den eksisterende litteratur. Ved hjælp af indretningen i dette dokument, kan cellekultur under oxygen gradienter udføres på en let måde, der i høj grad fremmer celle undersøgelser under oxygen gradienter. Furthermore kan en lignende princip operation anvendes til at generere andre fysiologisk relevante gasformige gradienter, såsom carbondioxid og nitrogenoxid, til in vitro studier af cellekulturer 17. Disse funktioner viser, at PDMS-PC mikrofluidanordning viser stort potentiale for forskellige cellekultur applikationer, herunder narkotika testning og celleproliferation og migration analyser, for at gå videre i vitro cellekultur studier.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
| 10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
| 150 mm Petri dish | Dogger Science | DP-43151 | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
| 3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
| 4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
| Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
| AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
| Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
| Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
| Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
| Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
| Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
| COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
| D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
| Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
| DMEM/F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
| Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
| Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
| JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
| Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
| NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
| Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
| Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
| Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
| Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
| Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
| Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
| Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
| SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
| SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
| Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
| Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
| T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
| Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
| Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |
References
- Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J.
- Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
- Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
- Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
- Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
- McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
- Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
- Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
- Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
- Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
- Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).
