Bruke Syntetisk biologi Ingeniør levende celler som grensesnitt med Programmerbare Materials
Summary
Dette notatet presenterer en rekke protokoller for å utvikle konstruerte celler og funksjon overflater som muliggjør syntetisk konstruert E. coli å kontrollere og manipulere programmerbare materialoverflater.
Abstract
Vi har utviklet en abiotiske-biotiske grensesnitt som gjør det mulig modifiserte cellene for å kontrollere materialegenskapene til en funksjonalisert overflate. Dette systemet er fremstilt ved å lage to moduler: et syntetisk konstruert stamme av E. coli-celler og en funksjonalisert materiale grensesnitt. Innenfor denne artikkelen, vi detalj en protokoll for genetisk ingeniør utvalgte atferd innenfor en stamme av E. coli ved hjelp av molekylære kloning strategier. En gang utviklet, denne stammen produserer høye nivåer av biotin når de utsettes for en kjemisk inducer. I tillegg har vi detaljerte protokoller for å skape to forskjellige funksjonaliserte overflater, som hver er i stand til å svare på celle-syntetiserte biotin. Til sammen presenterer vi en metode for å lage en link, abiotiske-biotiske system som gjør det mulig konstruert celler for å kontrollere materiell sammensetning og montering på nonliving underlag.
Introduction
Her rapporterer vi fremgangsmåten for å utvikle en programmerbar substrat er i stand til å reagere på et kjemisk signal fra en manipulert cellelinje. 1 Vi gjør dette ved å opprette en biotin-streptavidin grensesnitt som svarer til biotin produsert av syntetisk konstruert Escherichia coli (E. coli) celler. Tidligere har programmerbare overflater er konstruert for en rekke bruksområder fra toksin påvisning 2 og point-of-care diagnose tre til forsvar og sikkerhet. 4 Selv om programmerbare overflater kan være anvendelige som sensorer og aktuatorer, kan de gjøres "smartere" av endowing dem med evne til å tilpasse seg ulike miljøutfordringer. I motsetning til dette, selv enkle mikroorganismer, slik som E. coli, har iboende tilpasningsevne og er i stand til å reagere på utfordringer med sofistikerte og ofte uventede løsninger. Denne tilpasningsevne har aktivert E.coli-populasjoner, kontrollert av sine komplekse genet nettverk, kostnadseffektivt søke ressurser, fem skape verdiøkende produkter, 6 og til og med makt mikro-skala robotikk. 7 Ved å koble den adaptive fordelene av levende celler ved bruk av programmerbare flater, kan vi skape en smart substrat er i stand til å reagere på forskjellige miljøforhold.
Syntetisk biologi har gitt forskerne nye evner å programmere oppførselen til levende organismer. Ved å konstruere celler til å inneholde nye gennettverk, kan forskerne designe celler som viser en rekke programmerte atferd. 8, 9 Beyond grunnforskning, kan disse atferd brukes for applikasjoner som styrer material montering og biologisk produsere verdiøkende produkter. 10 Heri, vi detalj hvordan vi brukte verktøyene i syntetisk biologi til eningeniør en E. coli stamme som syntetiserer biotin ved induksjon. Denne stamme ble utviklet ved hjelp av restriksjonsenzymkloningsfremgangsmåter for å sette sammen et plasmid, pKE1-lacl-bioB. Dette plasmid, når transformert inn i E. coli-stamme K-12 MG1655, begaver celler med evnen til å uttrykke høye nivåer av bioB, et essensielt enzym for biotin syntese. Når transformerte celler ble indusert med isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) og er forsynt med en biotin-forløper, desthiobiotin (DTB), ble forhøyede nivåer av biotin fremstilles.
Biotin 's binding interaksjon med streptavidin er en av de sterkeste ikke-kovalente bindinger som finnes i naturen. Som sådan, er biotin-streptavidin samhandling både godt karakterisert og høyt ansatt i bioteknologi. 11 Innenfor dette manuskriptet, presenterer vi to strategier anvender biotin-streptavidin samspillet til å oppfatte og gjenkjenne celle-produsert biotin med en funksjon overflate. Vireferere til disse kontrasterende flater som "indirekte" og "direkte" kontrollordninger. I den indirekte kontrollsystemet, konkurrerer celle-produsert biotin med biotin som har blitt konjugert og immobilisert på en polystyren-overflate for streptavidin bindingsseter. I tillegg er streptavidin konjugert med pepperrot peroksidase (HRP). HRP modifiserer 3, 3 ', 5, 5'-tetrametylbenzidin (TMB), for å frembringe et optisk signal, 12 som kan bli overvåket ved å kvantifisere den spektrale absorbans (dvs. optisk tetthet) ved 450 nm (OD 450). Således tillater den indirekte kontroll ordningen forskere for å måle celle-produsert biotin ved å måle dempning av OD 450 signalet.
Den direkte kontrollsystem utnytter den streptavidin-biotin hendelse ved å immobilisere streptavidin direkte til en materialoverflate og tillate celle-produsert biotin og biotinylert HRP-streptavidin til å konkurrere om bindingsseter. Igjen,relative nivåer av celle-produsert biotin blir overvåket ved å måle en OD 450 signal.
Tatt sammen, de modifiserte cellene og funksjonaliserte overflater tillate oss å kontrollere egenskapene til en programmerbar overflate ved å indusere nettverk i levende celler. Med andre ord, har vi laget et system som utnytter tilpasning av levende organismer og pålitelighet og spesifikasjon av et konstruert materiale grensesnitt ved å knytte disse systemene sammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert en ny strategi for grensesnitt utviklet levende celler med en funksjonmaterialoverflaten. Dette ble oppnådd ved å utvikle en cellelinje som er i stand til å syntetisere forhøyede nivåer av biotin når de induseres med IPTG. De forhøyede nivåer av biotin kan deretter anvendes for å modifisere den funksjonaliserte overflate. Protokollene detaljert hvordan å konstruere E. coli cellelinje og hvordan å lage to forskjellige funksjon overflater.
Kritiske trinn i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke for støtten fra prisen FA9550-13-1-0108 fra Air Force Office of Scientific Research i USA. Forfatterne tillegg erkjenner støtte fra prisen N00014-15-1-2502 fra Office of Naval Research i USA, finansiering fra Institutt for Kritisk Technology and Applied Science ved Virginia Polytechnic Institute og State University, og fra National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, award nummer 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
