Summary
浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。
Abstract
マクロファージは、免疫系の本来の腕に由来する専門的な食細胞である。定常状態では、成人組織において固着したマクロファージが感染および組織損傷の最前線のセンチネルとして働く。他の免疫細胞は、骨髄に位置する造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）から連続的に再生されるが、常在性マクロファージとして知られている系譜は、骨髄HSPCからの入力なしに組織内で自己維持されることが示されている。この系統は、脳におけるミクログリア、肝臓におけるクッパー細胞、および表皮におけるランゲルハンス細胞によって例示される。腸および結腸層固有層は、HSPC非依存性常在マクロファージを欠いている唯一の成人組織である。最近の研究では、常在マクロファージが、胎児造血幹細胞（HSC）とは異なる前駆細胞からの胚性卵黄造血に由来することが確認されている。卵黄嚢の確定的な造血、e赤血球系前駆細胞（EMP）は、赤血球系細胞および骨髄系細胞、特に常在性マクロファージを生じる。 EMPは、E8.5とE10.5の発達の間の卵黄嚢内でのみ産生され、循環が連結すると早期に胎児肝臓に移動し、少なくともE16.5まで拡大して分化する。彼らの子孫は赤血球、マクロファージ、好中球および肥満細胞を含むが、EMP由来マクロファージのみが成人期まで組織内に存続する。 EMP出現の一時的性質およびHSC世代との時間的重複は、これらの前駆体の分析を困難にする。我々は、フローサイトメトリーによってインビボで EMPおよびEMP由来細胞を特徴付けるために、マクロファージサイトカイン受容体Csf1rプロモーターの発現に基づくタモキシフェン誘導性運命マッピングプロトコールを確立した。
Introduction
発達中の骨髄系子孫が成人期にとどまる造血前駆細胞のいくつかの連続するが重複する波が存在する。まず、単能性「プリミティブ」前駆体は、E7.5、E8.25間のマウス卵黄嚢1,2に出現し、任意の単球の中間ことなく、胚性マクロファージを生じます。原始前駆細胞に由来するマクロファージが、小膠細胞として成人の脳に存続するかどうかは、活発な研究の対象である。第二に、E8.5の卵黄嚢にErythro-Myeloid Precursors（EMPs）が生じ、血流に入り、胚を定着させる。 EMPはRUNX1依存性内皮への造血転移3、4における卵黄嚢造血内皮から出てきます。 EMPは卵黄嚢内のマクロファージに分化することができるが、それらはまた、胚の日（E）9 5から胎児肝をコロニー化し、赤血球、巨核球、マクロファージ、単球顆粒球および肥満細胞に分化する6 。 EMP由来のマクロファージは、発達および成人組織において増殖能力を示す。非常に少ないが、その分化経路7、8について知られているようEMP-由来のマクロファージが分化の単球の段階をバイパスするかどうかはまだ議論の余地があります。最後に、造血幹細胞（HSC）は、大動脈 - 生殖腺 - 中胚葉領域から適切な胚内のE10.5に出現し、胎児の肝臓に移動する。長期再増殖能を有するHSCは、E11（42体節ペア段階）の後にのみ検出される9 。そこでは、最終的な造血が出生後の生活の間、血液細胞産生の優勢な部位になる骨髄に移行し始めるまで、それらは拡大してE12.5と区別される10 。
spこれらの胚性造血前駆細胞の波の特定の寄与を区別する能力をこれまで妨げていた。 EMPおよびHSCの両方がRunx1依存的に産生され、転写因子Mybおよび増殖因子受容体Csf1r（コロニー刺激因子1受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体としても知られる）を発現するが、EMPは、 インビトロおよびインビボのリンパ電位の欠如、それらの長期再増殖能の欠如および系譜マーカーSca-1 11の表面発現の欠如により、HSCが減少した。遺伝的運命マッピングモデルは、細胞特異的かつ時間特異的な方法で胚性前駆細胞を標的とすることができるため、マクロファージの個体発生を特徴づけるために必要とされる。ここでは、2つの系統を区別するために実験所で使用されている運命マッピングプロトコールを提示するほとんどの成人組織に見出されるマクロファージ：HSC由来の浸潤マクロファージおよびHSC非依存性の常在マクロファージ。
組織常在性マクロファージはCSF1R 12サイトカイン受容体を発現するMybの非依存性前駆細胞に遡ると3つの相補性運命マッピング戦略6を用いて、E8.5-E10.5で胚中に存在しているされています。胎児HSCを標識せずに卵黄嚢造血を研究するために、改良されたCreリコンビナーゼおよび2つのマウスエストロゲン受容体（Mer-iCre-Mer）のタモキシフェン誘導性融合タンパク質を発現するトランスジェニック株Csf1r MeriCreMerを使用するCsf1rプロモーター。したがって、Creリコンビナーゼは、限られた時間枠の間にCsf1r発現細胞において活性である。 lox-STOP-loxカセット（ Rosa26 LSL-eYFP ）の下流に蛍光タンパク質を含むレポーター株と一緒に使用すると、誘導の時点で存在する細胞の遺伝的標識化だけでなく、それらの子孫の遺伝的標識化も含む。卵黄嚢単能性「原始」前駆細胞または胎児性HSCを標識せずに、活性形態のタモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン（OH-TAM）、EMPおよびマクロファージを標識したE8.5での投与。これにより、我々は、胚発達中のEMPおよびその子孫の免疫表現型を特徴付けるとともに、卵黄嚢由来マクロファージの成体マクロファージプールへの寄与を評価した。原始前駆細胞由来のマクロファージもまた、このアプローチを用いて標識されているかどうか、およびそれらが成体マクロファージプールに寄与できるかどうかを特徴付けるために、さらなる研究が必要である。
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Protocol
動物手順は、Institut Pasteur（CETEA）の認可された機関による動物介護および使用委員会に従って実施された。
CSF1R MeriCreMer ローザ LSL-YFP胚における子宮内パルス標識で 1
- 4-ヒドロキシタモキシフェンのストック溶液（OH-TAM、50mg / mL）を調製する。
- 煙霧の下で、OH-TAMの25mgバイアルを開き、250μLのエタノール（100％）を加える。
- OH-TAM溶液を先端が切り取られた2mLのマイクロ遠心管に移し、最大速度で10分間ボルテックスする。
- ソニケーター浴中で30分間超音波処理する。
- 50mg / mLのストック溶液を得るために、ヒュームドゥの下で250μLのPEG-35ヒマシ油を添加する。
注：PEG-35ヒマシ油は、疎水性分子を結合し、それらを水性溶媒に可溶化する両親媒性特性を有する溶媒である。 - ボルテックスで約5分間超音波処理浴中で最高速度で30分間超音波処理する。
- アリコートマイクロ遠心チューブあたり90μL（4.5mg）（注射1アリコート）。
- 前述の13のように、4℃で1週間または-20℃で長期間保存してください。
- プロゲステロン（10mg / mL）の原液を調製し、
- 100mgのエタノール250μLを25mgのプロゲステロンに加えて、煙霧の下で10mg /100μLの懸濁液を調製する。やさしくボルテックス。
- ボンベの下に10mg / mlのプロゲステロン溶液を作るために2250μLのオートクレーブされたヒマワリ油を加える。
- 最高速度で約5分間ボルテックスし、4℃で保存します。解決策は保存されたときに明確であることに注意してください。
- タモキシフェン投与
注：胚形成は、胚プラグ形成日を胚の日（E）0.5とみなして推定した。組換えは、E8.5での単回注射によって誘導される妊娠したCsf1r MeriCreMer女性 12 。タモキシフェン投与後の中絶率を低下させるために、プロゲステロン1gあたり37.5μgのOH-TAMを補給する。午後1時に注入する（午前中に観察される膣栓用）。- 注射の朝、10分間（または完全に再懸濁するまで）OH-TAM溶液のアリコートを超音波処理する。
- 煙霧の下で360μLのNaCl 0.9％を加えて10mg / mLのOH-TAM溶液を得、完全に渦流する。溶液が透明になり、完全に再懸濁するまで超音波処理する（少なくとも30分）。
- プロゲステロンを室温まで予熱する。
- 450μLのOH-TAMと225μLのプロゲステロンをマイクロ遠心チューブに混合する。ボルテックス。
- 少なくとも10分間超音波処理し、25G針を有する1mLシリンジに負荷する。
- 動物施設では、妊娠している女性を体重測定する（ Csf1r MeriCreMerメスは近親交配FVB遺伝的背景にあり、典型的な体重は25および33g）。
- 計算した体積をゆっくりとマウスに注入して腹腔内注射を行う。針を抜いた後、穿刺傷を静かに押し、腹部をマッサージしてOH-TAMを分配する。
注：OH-TAM注射用量は75mg / kgであり、プロゲステロン用量は37.5mg / kgである。 表1は、妊娠した雌に注入する量を示す 。
| マウスの体重（g） | ミックスから注入する総量（μL） |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 | </ tr>
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
表1：4-OH-タモキシフェン（OH-TAM）の注射容量。プロゲステロン1gあたり37.5μgを補充したOH-TAM（体重1g当たり75μg）のE8.5での単回注射に必要な容量。
2.卵黄サック（YS）および胎児肝（FL）の解剖
注：長期培養に使用される場合を除いて、胚を操作する場合、厳密な無菌技術は必要ありません。それにもかかわらず、作業領域は清潔で、吸収紙の下に箔で覆われていなければならない。
- 氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および消化混合物（1mg / mLコラゲナーゼD、100U / mLデオキシリボヌクレアーゼI（DNase I）および3％ウシ胎児血清を含有するPBS）を調製する。
- 妊娠した女性を屠殺する所要の妊娠日（ 例えば、胚段階E10.5）での大脳の脱臼。
- 性器のちょうどの皮膚にピンチをはさみ、はさみで正中線に小さな切り口を作ってください。毛皮を使わずに体の壁を完全に露出させるために、肌を頭の方に引き寄せます。腹部の筋肉を切って内臓を露出させ、腸を押して2つの子宮角を露出させる。
- 中型の鈍い鉗子で、卵巣に付着した脂肪パッドをつかみ、静かに子宮を引きます。子宮角の子宮頸部レベルで切断し、ホーンを腹腔から持ち上げます。脂肪パッドを外して子宮角を完全に解放し、両側の卵巣から角を切る。
- 10ミリリットルのペトリ皿に氷冷PBSにホーンを入れてください。急速に一方の端（子宮頸部の端）に子宮筋層をつかみ、筋層と脱落膜組織の間に細かいハサミをスライドさせて、周囲の脱落膜組織で胚を解放する。
注：筋肉は急速に収縮する傾向があります抽出のために、このステップはできるだけ速くなければなりません。 - Reichertの膜と胎盤を切断するために1組の細かい鉗子を使用してください。
- ゆっくりと卵黄嚢を取り出し、消化混合物0.5mLを含む24ウェル組織培養プレートに入れる。
注：この段階で、胚の血液を収集することができます。- 臍および卵管を切断した直後に、胚を10mMの氷冷エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む12ウェル組織培養プレートに移す。鮮明なはさみを使って胚を断頭し、できるだけ組織を細かくすることを制限しようとする。氷上で10〜15分間インキュベートし、血液を含むEDTAを収集する。
- 胚周囲の羊膜を除去する。
- ステージ<E11.5の場合、より良い胚のステージングおよびより良い時間分解能（各体節ペアは約1時間30分以内に発生する）のために体節ペアの数を数えます。
- 胚の頭を切る鉗子や細かいはさみ。 0.5 mLの消化混合物を含む24ウェルプレートにヘッドを移す。
注：後期の神経外胚葉および脳を、フローサイトメトリー分析のためにさらに解剖する。注意深く周囲の血管叢を取り除く。 - 後肢の上の胚を切断し、前肢を除去する。
- 肝臓を隔離するには、細かい鉗子のペアを使用して胸郭を開きます。心臓に前方にピンチし、体から器官を解放するために2番目の鉗子を使用しながら静かに引っ張りなさい。
- 心臓と腸から胎児の肝臓を慎重に分離します。胎児の肝臓を、0.5mLの消化混合物を含む24ウェルプレートに移す。解剖顕微鏡下で転送を注意深く監視する。
- ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（PCR）によって遺伝子型決定のために尾部（または他の胚部分）を収集する。
注：フローサイトメトリーを用いた類似の分析のために、他の組織および器官をE10.5胚から採取することができる。ブラッドヘッドスキー大動脈 - 生殖腺 - 中腎症領域（AGM）、心臓および神経外胚葉をE10.5で収集することができる。後の段階で、肺、腎臓、脾臓および膵臓も採取することができる。異なる発達段階でのAGMの解剖の詳細な説明は、以前に記載されている14 。
フローサイトメトリー用の胚組織の処理
- 37℃で30分間、消化混合物中に置かれた器官をインキュベートする。
- FACSバッファー（0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mM PBS中の2mM EDTA）6mlで満たした6ウェル組織培養プレートに入れた100μmのストレーナーに組織および酵素溶液を移す。 2mLシリンジの黒いゴム製のピストンを静かにつぶして機械的に解離させ、単一細胞懸濁液を得る。
注：これ以降、すべてのステップは4℃で実施する必要があります。 - パスツールピペットで細胞懸濁液を収集し、15mLチューブに移す。
- Spi4℃で320×gで7分間インキュベートした。上清を吸引により捨てる。
- ペレットを60μLのFcブロッキングバッファー（FACSバッファーで1/50に希釈したCD16 / CD32ブロッキング抗体）に再懸濁する。
- 丸底96マルチウエルプレートに1ウェル当たり50μLの単一細胞懸濁液を移す。氷上で少なくとも15分間インキュベートする。
注：少量のサンプルを取り扱う場合は、5 mLポリスチレンFACSチューブで染色を行うこともできます。 - 残りの10μLを5mLポリスチレンFACSチューブに移し、各組織からサンプルのプールを得る。このプールはコントロール（ すなわち、染色されていないサンプルおよび各蛍光色素の蛍光マイナス1（FMO）コントロール）として機能します。各蛍光マイナス1（FMO）コントロール（蛍光色素1つにつき1つ）あたり50μLのプールを96マルチウェルプレートに移す。
注：各FMOコントロールには、抗体パネルのすべての蛍光色素結合抗体が含まれていますが、それは測定されている。 FMOは、ゲート境界を識別し、マルチカラーパネルのスペクトル重なりを制御するために使用されます。異なる組織間のバックグラウンドおよび自己蛍光の変動に正確に対処するためには、各組織のサンプルプールからこれらの対照を調製することが重要である。 YFP発現のための適切なコントロールは、Cre遺伝子欠損胚由来の試料であり、これはPCR遺伝子型決定によって確認される。
- 丸底96マルチウエルプレートに1ウェル当たり50μLの単一細胞懸濁液を移す。氷上で少なくとも15分間インキュベートする。
表面抗原染色
- 抗体混合物をFACS緩衝液中で調製する（表2）。 1サンプルにつき50μLの抗体混合物を調製する。
- 次の蛍光色素結合抗体を使用してください：抗CD45.2（クローン104）;抗CD11b（クローンM1 / 70）;抗F4 / 80（クローンBM8）。抗AA4.1（クローンAA4.1）;抗Kit（クローン2B8）;および抗Ter119（クローンTer119）。
- FACSバッファー中のFMOコントロール用に6つの抗体ミックスを調製する。コントロールサンプルあたり50μLの抗体ミックスを調製する。
NOTE：抗体混合物中の抗体希釈液は、材料表に示された最終濃度より2倍濃縮されています。 6つの蛍光色素結合抗体を有するパネルについては、6つのFMOコントロールが準備される。 表2は、1つのチューブに対する抗体混合物およびFMO対照の組成を示す 。
| 抗体の体積（μL）（最終体積50μL） | ||||||||
| 抗体 | クローン | 抗体混合物 | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | FMOキット | FMO Ter119 |
| 抗CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 抗CD11b | M1 / 70 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 抗F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| 抗AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| アンチキット | 2B8 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| 抗Ter119 | Ter119 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| FACSバッファー | 45.5 | 46.5 | 46 | 46.5 | 46.5 | 46 | 46 | |
表2：染色に使用する抗体の量とFluorescent-1（FMO）のコントロール。最終容量50μLに必要な抗体の容量（μL）。
- 抗体混合物50μLを96-マルチウェルプレート中の試料に加える（染色中の最終体積は100μLである）。ゆっくりと2回上下にピペットし、氷上で30分間インキュベートする。
- 96-マルチウェルプレートを4分間320xgで7分間スピンし、上清を捨てる。 200μLのFACS緩衝液に再懸濁する。
- 150μLのFACSバッファーで2回洗浄操作（ステップ4.3）を2回繰り返します。
- サンプルおよびコントロール（FMOおよび未染色プールサンプル）を、70μmのストレーナーを通して5mlのポリスチレンチューブに濾過する。取得まで氷上に保管してください。
フローサイトメトリーによるEMPおよびYS由来マクロファージの同定
注：このプロトコールは、4レーザーフローサイトメーターイク405nmの紫色レーザー、488nmの青色レーザー、562nmの黄色レーザー、および638nmの赤色レーザーを使用しています。
- 製造元の指示に従って結合した各抗体の補償ビーズを調製する。レーザー強度を最適化するために、染色されていないサンプルと補正ビーズを使用してください。
- ゲート境界を特定するには、各抗体のFMO（Fluorescence-Minus One）コントロールを使用します。
- 死細胞を排除するために、採取の1分前に1μLのDAPI（1mg / ml）をチューブ（200μLの染色された細胞懸濁液を含む）に加える。強いDAPI信号と前方散乱パラメータ（FSC）を使用して、死んだ細胞や残骸を排除します。
注：フローサイトメーターのソフトウェアを使用して、取得中にゲートを描きます。補償マトリクスおよび分析は、市販の他のソフトウェアを用いてサンプルを取得した後に行うことができる。 - 合計イベントから生細胞および二重識別を行うために、前方散乱および側方散乱（FSC対SSC）を用いる。
- まず、赤血球（Ter119 + ）を除外し、前駆細胞（Kit + ）と造血細胞（CD45 + Kit neg ）を同定するために、娘細胞ゲノムを樹立するためにログスケール軸に蛍光ドットプロットを作成する（ 図1参照）。
- 蛍光ヒストグラムを作成して、YS（ 図2 ）、胎児肝臓（ 図3 ）および脳（ 図4 ）における異なる同定された集団間のYFPの標識効率を定量化する。
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Representative Results
遺伝的運命のマッピングは、Rosa26-LSL-eYFPレポーターを保有するオスと交尾したCsf1r-Mer-iCre-MerメスへのOH-TAMのE8.5での投与によって達成された。 OH-TAMの存在下では、停止カセットの切除は、 Csf1rを発現する細胞においてYFPの永続的発現を導く 。我々は、E10.5の胚から2つの造血組織：卵黄嚢および胎児肝臓および非造血組織、神経外胚葉を集めた。単一細胞懸濁液は、酵素的および機械的解離によって得られ、サンプルは、蛍光結合抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって分析した。死細胞および二重線を排除した後、単一細胞懸濁液を分析した（ 図1 ）。すべてのゲートは、Fluorescence Minus One（FMO）コントロールを使用して定義した。分析の明瞭性を向上させるために、赤血球排除（Ter119 +細胞）も実施することが推奨される（ 図1B + CD45 neg ;キット+ CD45 低およびキットネガ CD45 + （ 図1 ）。 AA4.1の発現に基づいて、前駆細胞をさらに分析した（ 図2-4 ）。実際、AA4.1はコロニー形成アッセイで実証されているように、卵黄嚢の赤血球系前駆細胞内の前駆母集団の濃縮を可能にする表面マーカーである15 。目的の集団が同定されたら、ヒストグラムを用いて各集団のYFP標識効率を定量化した。卵黄嚢Kit +前駆細胞の中で、CD45 neg （ 図2A ）およびCD45 low （ 図2B ）の両方の細胞集団はAA4.1 + YFP +細胞を含む。しかし、AA4.1 + YFP <肝臓および脳中の+細胞は、Kit + CD45 低前駆細胞集団においてのみ見出される（ 図3Bおよび4B ）。脳は造血の活性部位ではないので、この組織に見られる前駆細胞は循環前駆細胞に相当する可能性がある。これはまた、卵黄嚢から胎児の肝臓および末梢組織に移動するときの前駆成熟過程を示唆している。キット+前駆細胞は、CD45の発現とは無関係にAA4.1を最初に発現するが、循環に達する頃までに胎児の肝臓に至るまでに、すべてのAA4.1 + YFP +前駆細胞は検出可能なレベルの細胞表面CD45を発現する。 F4 / 80 bright CD11b +と定義されるマクロファージは、Kit neg CD45 +ゲートに見いだされた（ 図2-4 ）。 E10.5卵黄嚢、肝臓および脳におけるマクロファージは効率的に標識された（F4 / 80の明るい CD11b +細胞の60〜80％がYFP +である ）b唯一のE8.5での単一OH-TAM投与（ 図2C 、 3Cおよび4C ）。
リッター間の標識効率を比較するために、組換え効率のための内部対照が使用されることを推奨する。 OH-TAM を子宮内に注入したときのリターとマウス株との間の発達タイミングの変動により、実験間でレポーターの発現レベルの変動が観察され得る。したがって、E8.5からE11.5の胚への胚の準備は、体節対数計算によって行うことが推奨される。このプロトコールでは、我々は、異なる実験および株間のCre組換えの効率を比較するための参照として、脳梗塞マクロファージ（ミクログリア）における標識効率を使用することを提案する（ 図4C ）。他の常在性マクロファージも使用できるが、ミクログリアは、卵黄嚢由来マクロファージとして記載される最初の細胞であったE10.5における組織常在性マクロファージの最も豊富な集団を代表するものであり、したがって、ミクログリアにおけるYFP標識は、各実験における運命マッピング効率を評価し、異なるリターからのデータを比較するために使用することができる。
図1：前駆細胞（Kit + CD45 negおよびKit + CD45 low ）および分化した造血細胞（Kit neg CD45 + ）を同定するゲーティング戦略。 （ A ）生細胞およびシングレットの識別は、DAPI染色およびフォワードおよびサイドスキャッター（FSC / SSC）パラメーターを用いて行われる。 （ B ）赤血球排除（Ter119 neg ）に続いて、目的の細胞の3つの集団を、KitおよびCD45：Kit + CD45 negの細胞表面発現に基づいて同定する。キット+ CD45 低 ネガティブ CD45 +細胞を含む。 （ C ）OH- TAMが注入され、その子孫が、Cre-リコンビナーゼ陰性胚（後でポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、PCRによって確認される）と比較してYFPを発現するCre-リコンビナーゼ陽性胚において同定される場合に存在するCsf1r発現細胞。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：E10.5 Csf1r MerlCreMer Rosa26からの卵黄嚢における標識効率E8.5でOH-TAMで胚発生したLSL-eYFP 。 （ A ）キット+ CD45 陰性細胞は、生きた卵黄嚢細胞（青色ゲート、左パネル）上のキットおよびCD45発現に基づいてゲートされる。 Kit + CD45 陰性細胞上のAA4.1およびKit発現。ブルーeゲートはAA4.1 + Kit + CD45 neg細胞を囲む（中央パネル）。 AA4.1 +のCreネガティブコントロール（黒色）とのCre陽性サンプル（緑色）でキット+ CD45 NEG細胞 （右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、YFPシグナル（x軸）について陽性である細胞の割合（y軸）を表す。 （ B ）キット+ CD45 低細胞は、キットおよびCD45発現（ブルーゲート、左パネル）に基づいてゲートされる。 Kit + CD45 low細胞でのAA4.1およびKit発現。青いゲートは、AA4.1 +キット+ CD45 低細胞（中パネル）として定義されるように、EMPを封入する。 Cre陰性対照（黒）およびCre陽性試料（緑）におけるAA4.1 + Kit + CD45 低細胞（右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、YFPシグナル（x軸）について陽性である細胞の割合（y軸）を表す。 （ C ）造血細胞は、Kit neg CD45
図3：E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26からの肝臓での標識効率E8.5でOH-TAMで胚発生したLSL-eYFP 。 （ A ）キット+ CD45 陰性細胞は、キットおよびCD45に基づいてゲートされる生存肝細胞（青色ゲート、左パネル）での発現。 Kit + CD45 陰性細胞上のAA4.1およびKit発現。ブルーゲートは、AA4.1 + Kit + CD45 neg細胞を囲む（中央パネル）。 AA4.1 +のCreネガティブコントロール（黒色）とのCre陽性サンプル（緑色）でキット+ CD45 NEG細胞 （右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、YFPシグナル（x軸）について陽性である細胞の割合（y軸）を表す。 （ B ）キット+ CD45 低細胞は、キットおよびCD45発現（ブルーゲート、左パネル）に基づいてゲートされる。 Kit + CD45 low細胞でのAA4.1およびKit発現。青いゲートは、AA4.1 +キット+ CD45 低細胞（中パネル）として定義されるように、EMPを封入する。 Cre陰性対照（黒）およびCre陽性試料（緑）におけるAA4.1 + Kit + CD45 低細胞（右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、細胞（Y軸）はYFPシグナル（x軸）陽性である。 （ C ）造血細胞はKit neg CD45 +と定義され、青色でゲートされている（左パネル）。 Kit ネガティブ CD45 +細胞上のF4 / 80およびCD11b発現。マクロファージは、F4 / 80 bright CD11b +細胞（中央パネル）と定義される。 Cre陰性対照（黒色）およびCre陽性試料（緑色）におけるF4 / 80の明るい CD11b +マクロファージ（右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、YFPシグナル（x軸）について陽性である細胞の割合（y軸）を表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP胚からの脳における標識効率E8.5でOH-TAMを用いた。 （ A ）キット+ CD45 陰性細胞は、生きた脳細胞（青色のゲート、左パネル）上のキットおよびCD45発現に基づいてゲートされる。 Kit + CD45 陰性細胞上のAA4.1およびKit発現。ブルーゲートは、AA4.1 + Kit + CD45 neg細胞を囲む（中央パネル）。 AA4.1 +のCreネガティブコントロール（黒色）とのCre陽性サンプル（緑色）でキット+ CD45 NEG細胞 （右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、YFPシグナル（x軸）について陽性である細胞の割合（y軸）を表す。 （ B ）キット+ CD45 低細胞は、キットおよびCD45発現（ブルーゲート、左パネル）に基づいてゲートされる。 Kit + CD45 low細胞でのAA4.1およびKit発現。青いゲートは、AA4.1 +キット+ CD45 低細胞（中パネル）として定義されるように、EMPを封入する。 AA4.1 + Kit + CD45 lowにおけるYFP標識の比較C ）造血細胞はKit neg CD45 +と定義され、青色でゲートされている（左パネル）。 Kit ネガティブ CD45 +細胞上のF4 / 80およびCD11b発現。マクロファージは、F4 / 80 bright CD11b +細胞（中央パネル）と定義される。 Cre陰性対照（黒色）およびCre陽性試料（緑色）におけるF4 / 80の明るい CD11b +マクロファージ（右パネル）におけるYFP標識の比較。ヒストグラムは、YFPシグナル（x軸）について陽性である細胞の割合（y軸）を表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
造血前駆細胞の異なる波は、時間的枠内で部分的に重複するため、免疫細胞に対する発達造血の各波の寄与を分析することは、技術的に非常に困難です。
タモキシフェン誘導性Creシステムは、時間的に誘導性の様式で特定の細胞にタグを付け、 エクスビボまたはインビトロの培養または移植を必要とせずに、胚または成体で系統分析を行う機会を提供する。タモキシフェン誘導性Cre株では、細菌性Creリコンビナーゼとヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（CRE-ER）の突然変異型との間、または改善された単一点突然変異体Creと2つのマウスエストロゲン受容体の間に融合遺伝子が作製される（Mer-iCre-Mer）。 Creのエストロゲン受容体との融合は、Hsp90によるCreの細胞質の隔離をもたらし、それによって核のCre媒介組換えを防止する。タモキシフェン（TAM）はthによって代謝されるe-肝臓を4-ヒドロキシタモキシフェン（OH-TAM）、エストロゲン受容体に対する結合親和性の高い活性代謝物に変換する。融合CreへのOH-TAM結合は、Hsp90との相互作用の破壊をもたらし、核へのその転位およびCre媒介組換えの開始を可能にする。 子宮内のTAMまたはOH-TAMの妊娠女性への注射は、発生中の胚における組換えを活性化することが示されている。妊娠中のタモキシフェン投与は中絶につながり、その結果、寝たきりの大きさを減少させるが、妊娠中期後に送達される場合には出生を防止し、帝王切開による授乳が必要となる。妊娠中にタモキシフェンの効果を相殺するために、我々は、胚の生存率を向上させ、中絶17のリスクを軽減するために、プロゲステロンの半分の用量でOH-TAMの管理を補完します。
TAMまたはOH-TAMを妊娠した女性に送達するためにいくつかの経路を用いることができる。現在経口ガバまたは腹腔内（i.p.）注射をタモキシフェンに使用する。 OH-TAMは、妊娠したダムの肝臓によって代謝される必要がないので、すぐに利用できるという利点がある。しかしながら、タモキシフェンはトウモロコシ油に非常に溶解しやすいが、OH-TAMは、同じ技術を用いて調製することが非常に困難であり、エマルジョンになる。これは、子宮内の脈拍標識にOH-TAMを使用する際の限定的なステップであった。我々は、タモキシフェンの溶解が最も重要なステップの1つであるため、OH-TAMを可溶化する両親媒性特性を有する溶媒であるPEG-35ヒマシ油を使用する、JF Nicolas 13のグループによって開発されたOH-TAMの調製のためのプロトコールを適合させたその手順でこれは、OH-TAMの再現可能かつ最適な調製を可能にし、タモキシフェン調製の時間をかなり短縮する。さらに、異なる誘導性Cre株を使用する場合に注入するOH-TAMの濃度を適合させることが必要である。生存能力のある色素（DAPI）およびサイズ（FSC）は、それぞれ、死細胞および細胞破片を除去するために重要である。死細胞および破片は、紫色、青色および赤色レーザ検出器の大部分において高度に自己蛍光性であり、フローサイトメトリー分析を妨げる可能性がある。さらに、フローサイトメーターで分析する前に染色後に細胞を固定することは推奨しません。固定は、細胞形態の変化をもたらし、したがって、前方散乱および側方散乱（FSC対SSC）に基づく困難なサイズ弁別をもたらす。さらに、PFAによるサンプルの固定は、YFP蛍光強度の有意な損失をもたらす。
このプロトコルの主な制限は、その集団がその機能性および分化能について試験されていないことである。これを克服するために、コロニー形成アッセイを行うために蛍光活性化セルソーター（FACS）を用いて同様のプロトコールに従って細胞を選別することができる。この場合、滅菌条件下で胎児ウシ血清（FBS）をBSAの代わりにFACSバッファに保存することを強く推奨します。この技術で達成される低標識効率およびその結果、胚組織あたりの関心のあるYFP +細胞の数が少ないことは、EMP表現型の研究における主要な課題である。このプロトコルは、4レーザーフローサイトメーターを使用しています。 3つのレーザーを有するフローサイトメーターも使用することができるが、色素間の増大したスペクトル重なりを考慮に入れて抗体パネルを適合させることが重要である。さらに、抗体の滴定は、抗体パネルを変更するときに適切な濃度を見つけることが必要であり、抗体の滴定および新しい抗体パネルの検証を、組織あたりのすべての胚をプールしたパイロット実験で行うことを推奨する。組織あたりの細胞を分析した。
発生生物学の分野は、Cre / Lox法によって革命を起こしました。Cre / Lox法は、細胞をその場で永続的に標識することを可能にします。このアプローチは、特異的プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼの発現を介して、組織特異的、細胞特異的、組織特異的または細胞タイプ特異的である。本発明者らは、マクロファージおよびその前駆細胞の重要な分裂促進因子および成長因子受容体であるCsf1r（Colony Stimulating Factor 1 Receptor）のプロモーターの制御下で、Creリコンビナーゼの発現を研究することを選択したJ. Pollardの18 。他の公表された戦略と比較したCsf1r発現に基づく運命マッピング戦略の利点は、胎児HSCを標識することなく卵黄嚢由来細胞（EMPおよびマクロファージ）の標識を可能にすることである12 。 CX3CR1 CreERT2株はまた、ラベルのHSC 19せずに卵黄嚢細胞を標識することができます、しかし、それだけでラベルマクロファージおよびマクロファージの前駆体が、それはEMP前駆細胞1ラベルを付けていないことができます。 Cx3cr1 CreERT2株は、 Csf1rと同じ警告を有する
この方法は、近い将来、EMP分化経路を研究するために重要であり得る。 EMPはE8.5からE10.5 4までの卵黄嚢内皮から出現するが、この方法はE8.5-E9.5の間に出現する一部の前駆細胞のみを標識することを可能にする。したがって、この方法の限界は、EMPのわずかな部分のみが標識されているため、cについてのfloxed対立遺伝子を用いた古典的な機能喪失研究における分析を困難にすることである遺伝子を同定する。あるいは、疎な標識は、クローンレポーターを用いてインビボでのEMP分化のクローン研究において利点となり得る 。それにもかかわらず、floxed構築物の組換え効率はゲノム遺伝子座（floxed対立遺伝子）またはRosa26レポーター構築物に依存するので、標識効率は使用される各floxedレポーターまたはfloxed対立遺伝子について特徴づける必要がある。実際、異なるRosa26レポーター系統が異なるプロモーターで利用可能であり、 Rosa26 tdTomatoおよびRosa26 mTmG系統はRosa26 LSL-eYFP系統よりも高い組換え効率を有することが報告されている。このプロトコールで使用したレポーターマウス系統はRosa26 LSL-eYFP系統であり、結果セクションに記載された前駆体成熟の動的過程に関する情報を提供することはできない。成熟プロセスの問題は、 Rosa26mTmGのような異なるレポーター株を用いて部分的に対処することができる。そのような株では、細胞は、組換え事象から経過した時間に基づいて求めた。 Rosa26 mTmG株の全細胞は膜結合tdTomato蛍光タンパク質を発現し、Cre組換えはtdTomatoカセットを切断し、膜結合GFPの発現を可能にする。 tdTomatoは長い半減期を有するので、まだtdTomatoを含むが、GFPを発現するようになった（組換えの直後）細胞はtdTomato + GFP low / intであり、tdTomatoを発現しないtdTomato neg GFP +細胞と区別することができ、より高いレベルのGFPを発現する（組換え後に）。
上述のように、OH-TAM調製物は、実験間で同様の用量のOH-TAMを一貫して送達し、タモキシフェン副作用を低減するための重要なステップである。プロゲステロン同時投与は、妊娠に対するタモキシフェンの有害な影響を制限するためにも有用である。このプロトコールの別の重要な要素は、単一細胞懸濁液の生存能力であるnは異なる胚組織から得られる。我々は通常、フローサイトメトリー解析のために> 90％の生存細胞を取得します。これを達成するためには、すべてのステップを迅速に実行し、組織収集後にすべてのサンプルを氷上に維持することが重要です。ゲート境界を特定し、マルチカラーパネルのスペクトルオーバーラップを制御するために、染色されていないサンプル、シングルステイン、蛍光マイナス1（FMO）コントロールなどの適切なコントロールが必要です。抗体の変化は、抗体滴定およびスペクトル重複の点で確認する必要がある。最後に、Rosa26レポーター株の選択は、調査されている科学的問題に適応させる必要があります。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
著者たちはFrederic Geissmann教授とChristian Schulz教授に洞察力のある議論に感謝します。博士ハナ・ガーナー博士は原稿を批評的に読むために、Xavier Montagutelli博士とJean Jaubert博士と、動物飼育支援のためのInstitut Pasteur動物施設の職員、 Amgen ScholarのPascal DardenneとVytaute Boreikaiteは、技術的な支援をしています。 EGP研究所での研究は、パスツール研究所、CNRS、Cercle FSER（FRM、Institut PasteurおよびREVIVEコンソーシアムからの出発パッケージです.LIはREVIVEコンソーシアムのPhDフェローシップの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
