Summary
Medan infiltrerande makrofager kontinuerligt rekryteras till vuxna vävnader från cirkulerande prekursorer, fröer inhemska makrofager sin vävnad under utveckling, där de bibehålls utan ytterligare ingrepp från stamkroppar. Framfödarna för bosatta makrofager identifierades nyligen. Här presenterar vi metoder för den genetiska ödet kartläggning av de bosatta makrofagprogenitorerna.
Abstract
Makrofager är professionella fagocyter från immunitetens medfödda arm. I steady-state finns sessila makrofager i vuxna vävnader där de fungerar som frontlinjen för infektioner och vävnadsskador. Medan andra immunceller kontinuerligt förnyas från hematopoietiska stamceller och stamceller (HSPC) i benmärgen har en rad makrofager, kända som inhemska makrofager, visat sig vara självhäftande i vävnader utan inmatning från benmärgs HSPC. Denna härkomst exemplifieras av microglia i hjärnan, Kupffer celler i levern och Langerhans celler i epidermis bland andra. Tarm- och kolonlamina propria är de enda vuxna vävnaderna som saknar HSPC-oberoende bosatta makrofager. Nyligen undersökningar har identifierat att invånande makrofager härstammar från extra-embryonala äggula-hematopoiesis från föregångare som skiljer sig från fosterhematopoetiska stamceller (HSC). Bland äggula säck definitiva hematopoiesis, eRythromyeloida progenitorer (EMP) ger upphov till både erytroid och myeloidceller, i synnerhet bosatta makrofager. EMP genereras endast i äggula sac mellan E8.5 och E10.5 utvecklingsdagar och de migrerar till fostrets lever så tidigt som cirkulationen är ansluten, där de expanderar och differentierar till åtminstone E16.5. Deras avkomma inkluderar erytrocyter, makrofager, neutrofiler och mastceller, men endast EMP-härledda makrofager kvarstår fram till vuxenlivet i vävnader. Den övergående karaktären av EMP-framväxten och den tidsmässiga överlappningen med HSC-generationen gör analysen av dessa förfäder svår. Vi har etablerat ett tamoxifen-inducerbart ödebildningsprotokoll baserat på uttryck av makrofag-cytokinreceptor Csflr-promotorn för att karakterisera EMP och EMP-härledda celler in vivo genom flödescytometri.
Introduction
Det finns flera på varandra följande men överlappande vågor av hematopoetiska progenitorer under utveckling vars myeloid avkomma förblir i vuxenlivet. Först framträder unipotenta "primitiva" föregångare i muskelsäcken 1 , 2 mellan E7.5-E8.25 och ger upphov till embryonala makrofager utan någon monocytisk mellanprodukt. Huruvida makrofager som härrör från primitiva progenitorer kvarstår i den vuxna hjärnan, eftersom mikroglia fortfarande är ett ämne för aktiv utredning. För det andra uppstår Erythro-Myeloid Precursors (EMP) i äggula sac vid E8.5, gå in i blodomloppet och kolonisera embryot. EMP: er kommer från blommans sac-hemogena endotel i en Runxl-beroende endotel-till-hematopoietisk övergång 3 , 4 . Medan EMP kan differentiera till makrofager inom äggula sac, koloniserar de också fosterlever från embryonal dag (E) 9 5 och skiljer sig åtTia in i erytrocyter, megakaryocyter, makrofager, monocyter granulocyter och mastceller 6 . Makrofagerna som härrör från EMP uppvisar proliferativ kapacitet i utvecklings- och vuxna vävnader. Huruvida EMP-härledda makrofager förbi monocytsteget av differentiering är fortfarande kontroversiellt, eftersom väldigt lite är känt om deras differentieringsväg 7 , 8 . Slutligen framträder hematopoietiska stamceller (HSC) vid E10.5 inom det embryo som är korrekt från aorta-gonad-mesonephros-regionen och migrerar till fostrets lever. HSCs med långvarig repopulationskapacitet detekteras endast efter E11 (vid 42-somit-paret) 9 . Där utökar och skiljer de sig från E12.5 tills definitiv hematopoiesis börjar övergå till benmärgen, som blir den övervägande platsen för blodcellsproduktion under perioden efter det postnatala livet 10 .
SpAtiell och tidsmässig överlappning i framväxten, liksom gemensamma immunfenotypiska markörer har hittills hindrat vår förmåga att särskilja de specifika bidrag från dessa vågor av embryonala hematopoetiska progenitorer. Medan både EMP och HSC genereras på ett Runx1-beroende sätt och uttrycker transkriptionsfaktorn Myb och tillväxtfaktorreceptorn Csf1r (kolonistimulerande faktor 1-receptor, även känd som makrofagkolonistimulerande faktorreceptor) bland annat, kan EMPs särskiljas från HSCs genom deras brist på lymfoidpotential, både in vitro och in vivo , deras brist på långvarig repopulerande potential och brist på ytuttryck av linjemarkören Sca- 11 . Genetiska öde kartläggningsmodeller krävs för att karakterisera makrofag ontogeni eftersom de tillåter inriktning på embryonala progenitorer på ett cellspecifikt och tidsspecifik sätt. Här presenterar vi det öde-kartläggningsprotokoll som används i vårt laboratorium för att diskriminera mellan de två linjernaS av makrofager som finns i de flesta vuxna vävnader: HSC-härledda infiltrerande makrofager och HSC-oberoende bosatta makrofager.
Vävnads residenta makrofager har spårats tillbaka till Myb-oberoende prekursorceller som uttrycker cytokinreceptor Csf1r 12 och är närvarande i embryot vid E8.5-E10.5 med användning av tre komplementära öde-kartläggningsstrategier 6. För att studera äggula-hematopoiesis utan att märka fetala HSC, använder vi en transgen stam, Csf1r MeriCreMer , som uttrycker ett tamoxifen-inducerbart fusionsprotein av "förbättrat" Cre rekombinas och två musestrogenreceptorer (Mer-iCre-Mer) under kontroll av Csf1r-promotorn. Därför kommer Cre-rekombinaset att vara aktivt i Csfl- expressionsuttryck under ett begränsat tidsfönster. När det används med en reporterstam som innehåller ett fluorescerande protein nedströms en Lox-STOP-lox-kassett (Rosa26 LSL-eYFP ), leder det till permanentEnt genetiska märkning av cellerna närvarande vid tidpunkten för induktion men också av deras avkomma. Administrering vid E8.5 av aktiv form av tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), etiketter EMP och makrofager, utan märkning av äggula unipotenta "primitiva" progenitorer eller fetala HSCs. Därigenom har vi karakteriserat immunofenotypen av EMP och deras avkomma under embryonisk utveckling, samt bedömt bidraget från äggula-sack-härledda makrofager till de vuxna makrofagbassängerna. Ytterligare arbete krävs för att karakterisera huruvida primitiva stamceller som härrör från makroen också märks med hjälp av detta tillvägagångssätt och huruvida de kan bidra till vuxna makrofagbassänger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprocedurer utfördes i enlighet med det godkända institutet för djurhälsa och användning av Institut Pasteur (CETEA).
1. I Utero Pulse Märkning i Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryon
- Förbered stamlösningen av 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml).
- Under fumehood öppnar du 25 mg injektionsflaskan med OH-TAM och tillsätter 250 μL etanol (100%).
- Överför OH-TAM-lösningen till ett 2 ml mikrocentrifugrör med en stympad spets och virvel vid maximal hastighet i 10 minuter.
- Sonikera 30 minuter i ett ljudbad.
- Tillsätt 250 μL PEG-35-ricinolja under avfuktningen för att erhålla en 50 mg / ml stamlösning.
OBS: PEG-35 ricinolja är ett lösningsmedel med amfifila egenskaper som binder hydrofoba molekyler och solubiliserar dem i vattenhaltiga lösningsmedel. - Vortex i ca 5 minVid maximal hastighet och sonikera 30 min i ett ljudbad.
- Alikvot 90 μl (4,5 mg) per mikrocentrifugrör (1 alikvot per injektion).
- Förvaras vid 4 ° C i 1 vecka eller vid -20 ° C under lång tid som tidigare beskrivits 13 .
- Förbered stamlösningen av Progesteron (10 mg / ml)
- Tillsätt 250 μl 100% etanol till 25 mg progesteron för att framställa en suspension av 10 mg / 100 μl under fumehood. Vortex försiktigt.
- Lägg till 2250 μL autoklavad solrosolja för att göra 10 mg / ml progesteronlösning under huven.
- Vortex i ca 5 min vid maximal hastighet, alikvot och lagra vid 4 ° C. Observera att lösningen är klar vid lagring.
- Tamoxifen administrering
ANMÄRKNING: Embryonutveckling uppskattades med tanke på dagen för vaginalpluggbildning som Embryon dag (E) 0,5. Rekombination induceras genom enkel injektion vid E8.5Till gravida Csf1r MeriCreMer kvinnor 12 . Tillägg OH-TAM med 37,5 μg per g progesteron för att minska abortraten efter administrering av tamoxifen. Injicera klockan 1 pm (för vaginalpropp observerad på morgonen).- På morgonen av injektionen sonikera en alikvot av OH-TAM-lösningen under 10 minuter (eller tills den är helt återuppslamad).
- Tillsätt 360 μL NaCl 0,9% under fumehood för att erhålla en 10 mg / ml OH-TAM lösning och virvel grundligt. Sonikera tills lösningen är klar och fullständigt återuppslamad (minst 30 min).
- Förvärm progesteron till rumstemperatur.
- Blanda 450 μL OH-TAM och 225 μL progesteron i ett mikrocentrifugrör. Virvel.
- Sonikera minst 10 minuter och ladda på en 1 ml spruta med en 25G nål.
- I djuranläggningen väger den gravida kvinnan ( Csf1r MeriCreMer- kvinnorna är i en inavlad FVB-genetisk bakgrund och typiska väger betweEn 25 och 33 g).
- Utför en intraperitoneal injektion genom att långsamt injicera den beräknade volymen i musen. Efter att ha tagit nålen, tryck försiktigt på punkteringsåret och massera buken för att fördela OH-TAM.
OBS: OH-TAM-injektionsdosen är 75 mg / kg och Progesteron-dosen är 37,5 mg / kg. Tabell 1 ger volymen att injicera till gravida kvinnor.
| Mus vikt (g) | Total volym att injicera från blandningen (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 | </ Tr>
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tabell 1: Injiceringsvolym av 4-OH-tamoxifen (OH-TAM). Volym som krävs för en enda injektion vid E8.5 på 75 μg per g (kroppsvikt) av OH-TAM kompletterat med 37,5 μg per g progesteron.
2. Dissektion av äggula Sac (YS) och fetalt lever (FL)
OBSERVERA: Sterila sterila tekniker behövs inte vid manipulation av embryon, om inte de kommer att användas för långsiktig kultur. Arbetsområdet måste dock vara rent och täckt av folie under absorberande papper.
- Förbered iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och digestionsblandning (PBS innehållande 1 mg / ml kollagenas D, 100 U / ml deoxiribonukleas I (DNas I) och 3% fetalt bovint serum).
- Offra gravida kvinnor av cerVical dislokation vid önskad gestationsdag ( t.ex. embryonal stadium E10.5).
- Knippa huden strax över könsorganen och gör ett litet snitt vid mittlinjen med sax. Dra huden mot huvudet för att fullständigt avslöja kroppsväggen utan päls. Klipp bukmusklerna för att exponera de inre organen och tryck på tarmen för att exponera de två livmoderhornen.
- Med mellanslagna tunna tångar, ta tag i fettkudden fäst vid äggstocken och dra försiktigt livmodern. Klipp på livmoderhornets livmoderhals och lyft hornen från bukhålan. Ta bort fettkudden för att helt frigöra livmoderhornen och skär hornen från äggstocken på varje sida.
- Sätt hornen i iskall PBS i en 10 mm petriskål. Snabbt greppa livmodern muskelskikt i en extremitet (cervical end) och glida fina sax mellan muskelskiktet och den decidual vävnaden för att släppa embryon med den omgivande decidualvävnaden.
ANMÄRKNING: Muskulatur tenderar att snabbt avtala avteR extraktionen, så detta steg måste vara så snabbt som möjligt. - Använd ett par fina tångar för att skära av Reicherts membran och placentan.
- Ta försiktigt bort äggulaen och placera den i en vävnadskulturplatta med 24 brunnar med 0,5 ml digereringsblandning.
OBS! Vid detta steg kan embryonalt blod samlas in.- Omedelbart efter avskiljning av navel- och vitellinkärl överför embryot till en 12-brunns vävnadsodlingsplatta innehållande 10 mM iskall etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Dekapitera embryot med en skarp fina sax, försök att begränsa så mycket som möjligt vävnadsutspädning. Inkubera på is i 10-15 min och samla EDTA som innehåller blodet.
- Ta bort amnionen som omger embryot.
- För steg <E11.5, räkna antalet somitpar för bättre staging av embryon och en bättre tidsupplösning (varje somitpar utvecklas i ~ 1 h 30 min).
- Klipp embryonets huvud ossIngångar eller fina saxar. Överför huvudet till en 24-brunnsplatta med 0,5 ml digestionsblandning.
OBS: Neuroektoderm och hjärna vid senare steg dissekeras vidare för flödescytometrianalys; Ta försiktigt bort den omgivande vaskulära plexusen. - Klipp embryot ovanför bakbenet och ta bort förbenen.
- För att isolera levern, öppna thoraxen med hjälp av ett par fina pincett. Kläm anteriorly till hjärtat och dra försiktigt medan du använder andra pincett för att frigöra organen från kroppen.
- Separera försiktigt fostrets lever från hjärtat och tarmarna. Överför fetala lever till en 24-brunnsplatta med 0,5 ml digestionsblandning. Övervaka noga överföringen under dissekeringsmikroskopet.
- Samla svansområdet (eller någon annan embryondel) för genotypning genom polymerasekedjereaktionsanalys (PCR).
OBS: Andra vävnader och organ kan skördas från E10.5-embryon för en liknande analys med flödescytometri. Blod, huvudskidorN, aorta-gonad-mesonephros region (AGM), hjärta och neuroektoderm kan samlas på E10.5. Vid senare skeden kan även lung, njure, milt och bukspottkörtel uppsamlas. En detaljerad beskrivning av årsmötets dissektion vid olika utvecklingsstadier har tidigare beskrivits 14 .
3. Behandling av embryonvävnader för flödescytometri
- Inkubera organen (placerad i matsmältningsblandningen) i 30 minuter vid 37 ° C.
- Överför vävnaden och den enzymatiska lösningen på en 100 μm filter placerad i en 6-brunns vävnadsodlingsplatta fylld med 6 ml FACS-buffert (0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA i 1x PBS). Mekaniskt dissocieras genom försiktigt mashing med den svarta gummi kolven i en 2 ml spruta för att erhålla en enkelcells suspension.
OBS! Från och med nu ska alla steg utföras vid 4 ° C. - Samla cellsuspensionen med en Pasteur pipette och överför den till ett 15 ml rör.
- SpiN i 7 minuter vid 320 xg vid 4 ° C. Kassera supernatanten genom aspiration.
- Resuspendera pelleten i 60 | il Fc-blockerande buffert (CD16 / CD32-blockerande antikropp utspädd 1/50 i FACS-buffert).
- Överför 50 μl av enkelcellsuspensionen per brunn i en 96-brunnsplatta med rund botten 96. Inkubera i minst 15 minuter på is.
OBS! Färgningen kan också utföras i 5 ml polystyren-FACS-rör vid hantering av ett litet antal prover. - Överför de återstående 10 | il till ett 5 ml polystyren-FACS-rör för att erhålla en pool av proven från varje vävnad. Denna pool kommer att fungera som kontroller ( dvs ostämplade prover och fluorescerande minus en (FMO) kontroller för varje fluorokrom). Överför 50 μl av poolen för varje fluorescerande minus en (FMO) kontroll (en per fluorokrom) till 96-brunnsplattan.
OBS! Varje FMO-kontroll innehåller alla fluorokrom-kopplade antikroppar från antikroppspanelen, förutom denSom mäts. FMO används för att identifiera grindgränser och för att styra spektralöverlapp i flerfärgade paneler. För att korrekt adressera variationerna i bakgrund och autofluorescens mellan olika vävnader är det viktigt att förbereda dessa kontroller från provpumpen av varje vävnad. Den lämpliga kontrollen för YFP-uttryck kommer att vara proven från Cre-negativa embryon, vilka bekräftas genom PCR-genotypning.
- Överför 50 μl av enkelcellsuspensionen per brunn i en 96-brunnsplatta med rund botten 96. Inkubera i minst 15 minuter på is.
4. Surface Antigen Staining
- Förbered antikroppsmixen i FACS-bufferten (tabell 2). Förbered 50 μl antikroppsblandning per prov.
- Använd följande fluorokrom-kopplade antikroppar: anti-CD45.2 (klon 104); Anti-CD11b (klon M1 / 70); Anti-F4 / 80 (klon BM8); Anti-AA4.1 (klon AA4.1); Anti-kit (klon 2B8); Och anti-Ter119 (klon Ter119).
- Förbered sex antikroppsmixar för FMO-kontrollerna i FACS-bufferten. Förbered 50 μl antikroppsblandning per kontrollprov.
NEJTE: Antikroppspädningen i antikroppsblandningen är två gånger mer koncentrerad än den slutliga koncentrationen som anges i materialtabellen. För en panel med sex fluorokrom-kopplade antikroppar, framställs 6 FMO-kontroller. Tabell 2 ger sammansättningen av antikroppsblandningen och FMO-kontrollerna för ett rör.
| Volym (μl) av antikropp (slutvolym 50 | il) | ||||||||
| Antikropp | Klona | Antikroppsmix | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | FMO Kit | FMO Ter119 |
| anti-CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| anti-CD11b | M1 / 70 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| anti-Kit | 2B8 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 |
| anti-Ter119 | Ter119 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| FACS-buffert | 45,5 | 46,5 | 46 | 46,5 | 46,5 | 46 | 46 | |
Tabell 2: Volymen av antikroppar som används för färgning och fluorescerande minus en (FMO) kontroller. Volym (μL) antikropp som krävs för en slutlig volym av 50 | il.
- Tillsätt 50 μl av antikroppsmixen till proverna i 96-multiwellplattan (slutvolymen under färgning är 100 pl). Försiktigt pipett upp och ner två gånger och inkubera på is i 30 minuter.
- Spin 96-multiwellplattan i 7 minuter vid 320 xg vid 4 ° C och kassera supernatanten. Resuspenderas i 200 pl FACS-buffert.
- Upprepa tvättproceduren (steg 4.3) två gånger med 150 μl FACS-buffert.
- Filtrera proverna och kontrollerna (FMO och ostämpade poolprover) i 5 ml polystyrenrör genom en 70 pm sil. Förvara på is tills förvärv.
5. Identifiering av EMP och YS-härledda makrofager genom flödescytometri
ANMÄRKNING: Detta protokoll optimerades med hjälp av en 4-flödescytometer med 4 laserUipped med en 405 nm violett laser, en 488 nm blå laser, en 562 nm gul laser och en 638 nm röd laser.
- Förbered kompensationspärlor för varje kopplad antikropp enligt tillverkarens anvisningar. Använd ostämpade prov och kompensationspärlor för att optimera laserintensiteterna.
- För att identifiera gränsgränser, använd FMO (Fluorescence minus one) kontroller för varje antikropp.
- För att utesluta döda celler, tillsätt 1 μL DAPI (1 mg / ml) till röret (innehållande 200 pl av färgad cellsuspension) 1 min före förvärv. Använd den starka DAPI-signalen och den framåtriktade parametern (FSC) för att utesluta dödceller och skräp.
OBS! Använd programvara från flödescytometern för att rita grindar under förvärvet. Kompensationsmatris och analys kan utföras efter provupptagning med användning av annan kommersiellt tillgänglig mjukvara. - Använd framåt och sidospridning (FSC vs SSC) för att utföra levande cell och dubbeldiskriminering från totala händelser.
- Skapa fluorescenspunktpunkter i logaxelaxeln och rita dotterportar för att först utesluta erytrocyter (Ter119 + ) och sedan identifiera progenitorceller (Kit + ) och hematopoetiska celler (CD45 + Kit neg ) (Se Figur 1 ).
- Skapa fluorescenshistogram för att kvantifiera märkningseffektiviteten hos YFP bland de olika identifierade populationerna i YS ( Figur 2 ), fosterlever ( Figur 3 ) och hjärna ( Figur 4 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genetisk ökningskartläggning uppnåddes genom administrering vid E8.5 av OH-TAM till Csf1r-Mer-iCre-Mer-kvinnor som parades med män som bär en Rosa26-LSL-eYFP-reporter. I närvaro av OH-TAM leder excisionen av stoppkassetten till det permanenta uttrycket av YFP i cellerna som uttrycker Csf1r . Vi samlade två hematopoetiska vävnader: äggula och fostrets lever och en icke-hematopoietisk vävnad, neuroektodermen, från embryonerna vid E10.5. Encellsuspensioner erhölls genom enzymatisk och mekanisk dissociation och prover analyserades genom flödescytometri efter färgning med fluorescerande kopplade antikroppar. Efter uteslutning av döda celler och dubletter analyserades enkelcellssuspensioner ( Figur 1 ). Alla grindar definierades med hjälp av Fluorescence Minus One (FMO) kontroller. Det rekommenderas att även utföra en erytrocytutslagning (Ter119 + -celler) för att förbättra analysens klarhet ( Figur 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 low och Kit neg CD45 + ( Figur 1 ). Progenitorer analyserades ytterligare baserat på deras uttryck av AA4.1 ( figurerna 2-4 ). Faktum är att AA4.1 är en ytmarkör som möjliggör anrikning av stamfödelsepopulationen inom erytromyeloidprogenitorer i äggula sac, såsom demonstreras i kolonnbildande analyser 15 . När intressanta populationer identifierades kvantifierade vi YFP-märkningseffektiviteten i varje population med hjälp av histogram. Bland ojämnhetens uppsättning Kit + progenitorer innehåller både CD45 neg ( Figur 2A ) och CD45 låga ( Figur 2B ) cellpopulationer AA4.1 + YFP + -celler. Men AA4.1 + YFP <sup> + celler i levern och hjärnan finns endast i Kit + CD45 låg progenitor populationen (figur 3B och 4B). Eftersom hjärnan inte är en aktiv plats för hematopoiesis, kan progenitorer som hittas i denna vävnad motsvara cirkulerande progenitorer. Detta föreslår också en process av förföljande mognad när de migrerar från äggula till fostrets lever och perifera vävnader. Kit + föregångare uttrycker först AA4.1, oberoende av CD45-uttryck, men när de når cirkulationen och fosterleveren, uttrycker alla AA4.1 + YFP + -öppnarna detekterbara nivåer av cellyta CD45. Makrofager, definierade som F4 / 80 ljus CD11b + , hittades i Kit neg CD45 + -grinden ( Figur 2-4 ). Makrofager i E10.5 äggula, lever och hjärna märktes effektivt (60 till 80% av F4 / 80 ljusa CD11b + cellerna är YFP + ) b En enkel OH-TAM administrering vid E8.5 ( Figur 2C , 3C och 4C ).
För att jämföra märkningseffektiviteten mellan kullar rekommenderar vi att en intern kontroll för rekombinationseffektivitet används. Variabiliteten i reporternas uttryck kan observeras mellan experiment, på grund av variationer i utvecklingstiden mellan kullar och musstammar när OH-TAM injiceras i utero . Därför rekommenderar vi att embryostation från E8.5 till E11.5 embryon utförs genom att räkna somite par. I detta protokoll föreslår vi att använda märkningseffektiviteten i hjärnboende makrofagerna (microglia) som en referens för att jämföra effektiviteten hos Cre-rekombination mellan olika experiment och stammar ( Figur 4C ). Andra bosatta makrofager kan användas, men microglia var de första cellerna som skulle beskrivas som yolkack-härledda makrofagerEf "> 16 och de representerar den mest omfattande populationen av vävnadsbosatta makrofager vid E10.5. Således kan YFP-märkning i microglia användas för att bedöma öde-kartläggningseffektiviteten i varje experiment och jämföra data från olika kullar.
Figur 1: Gatingstrategi för att identifiera progenitorceller (Kit + CD45 neg och Kit + CD45 low ) och differentierade hematopoietiska celler (Kit neg CD45 + ). ( A ) Diskriminering av levande celler och singletter utförs med användning av DAPI-färgning och framåt och sidospridning (FSC / SSC) parametrar. ( B ) Efter att rött blodcellsuteläggning (Ter119 neg ) identifierats identifieras tre populationer av celler av intresse baserat på cellytaxpression av Kit och CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 låg neg CD45 + celler. ( C ) Csfl-uttryckande celler närvarande när OH-TAM injiceras och deras avkomma identifieras i Cre-rekombinas-positiva embryon som uttrycker YFP jämfört med Cre-rekombinas-negativa embryon (bekräftad senare genom polymeraskedjereaktionsanalys, PCR). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Märkningseffektivitet i äggula från E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospulserad med OH-TAM vid E8.5. (A) Kit + CD45 neg celler är gated baserat på Kit och CD45-uttryck på levande gulesäckceller (blå grind, vänster panel). AA4.1 och Kit uttryck på Kit + CD45 neg celler. Blue grind omsluter AA4.1 + Kit + CD45 neg celler (mittpanel). Jämförelse av YFP märkning i AA4.1 + Kit + CD45 neg-celler (högra panelen) i Cre negativa kontroller (svart) och Cre-positiva prover (grön). Histogram representerar procentandelen celler (y-axeln) positiv för YFP-signalen (x-axeln). ( B ) Kit + CD45 låga celler är gated baserat på Kit och CD45 uttryck (blå grind, vänster panel). AA4.1 och Kit uttryck på Kit + CD45 låga celler. Blå grinden omsluter EMP, definierad som AA4.1 + Kit + CD45 låga celler (mittpanel). Jämförelse av YFP-märkning i AA4.1 + Kit + CD45 låga celler (höger panel) i Cre negativa kontroller (svarta) och Cre positiva prov (gröna). Histogram representerar procentandelen celler (y-axeln) positiv för YFP-signalen (x-axeln). ( C ) Hematopoietiska celler definieras som Kit neg CD45
Figur 3: Märkningseffektivitet i levern från E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospulserad med OH-TAM vid E8.5. (A) Kit + CD45 neg celler grindas baserat på Kit och CD45Uttryck på levande leverceller (blå grind, vänster panel). AA4.1 och Kit uttryck på Kit + CD45 neg celler. Blå porten omsluter AA4.1 + Kit + CD45 neg celler (mittpanel). Jämförelse av YFP märkning i AA4.1 + Kit + CD45 neg-celler (högra panelen) i Cre negativa kontroller (svart) och Cre-positiva prover (grön). Histogram representerar procentandelen celler (y-axeln) positiv för YFP-signalen (x-axeln). ( B ) Kit + CD45 låga celler är gated baserat på Kit och CD45 uttryck (blå grind, vänster panel). AA4.1 och Kit uttryck på Kit + CD45 låga celler. Blå grinden omsluter EMP, definierad som AA4.1 + Kit + CD45 låga celler (mittpanel). Jämförelse av YFP-märkning i AA4.1 + Kit + CD45 låga celler (höger panel) i Cre negativa kontroller (svarta) och Cre positiva prov (gröna). Histogram representerar procentandelenCeller (y-axeln) positiva för YFP-signalen (x-axeln). ( C ) Hematopoietiska celler definieras som Kit neg CD45 + och gated i blått (vänster panel). F4 / 80 och CD11b uttryck på Kit neg CD45 + celler. Makrofager definieras som F4 / 80 ljusa CD11b + celler (mittpanel). Jämförelse av YFP-märkning i F4 / 80 ljusa CD11b + makrofager (höger panel) i Cre negativa kontroller (svarta) och Cre positiva prov (gröna). Histogram representerar procentandelen celler (y-axeln) positiv för YFP-signalen (x-axeln). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Märkningseffektivitet i hjärnan från E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP- embryospuLeds med OH-TAM vid E8.5. (A) Kit + CD45 neg celler är gated baserat på Kit och CD45-uttryck på levande hjärnceller (blå grind, vänster panel). AA4.1 och Kit uttryck på Kit + CD45 neg celler. Blå porten omsluter AA4.1 + Kit + CD45 neg celler (mittpanel). Jämförelse av YFP märkning i AA4.1 + Kit + CD45 neg-celler (högra panelen) i Cre negativa kontroller (svart) och Cre-positiva prover (grön). Histogram representerar procentandelen celler (y-axeln) positiv för YFP-signalen (x-axeln). ( B ) Kit + CD45 låga celler är gated baserat på Kit och CD45 uttryck (blå grind, vänster panel). AA4.1 och Kit uttryck på Kit + CD45 låga celler. Blå grinden omsluter EMP, definierad som AA4.1 + Kit + CD45 låga celler (mittpanel). Jämförelse av YFP-märkning i AA4.1 + Kit + CD45 låg C ) Hematopoietiska celler definieras som Kit neg CD45 + och gated i blått (vänster panel). F4 / 80 och CD11b uttryck på Kit neg CD45 + celler. Makrofager definieras som F4 / 80 ljusa CD11b + celler (mittpanel). Jämförelse av YFP-märkning i F4 / 80 ljusa CD11b + makrofager (höger panel) i Cre negativa kontroller (svarta) och Cre positiva prov (gröna). Histogram representerar procentandelen celler (y-axeln) positiv för YFP-signalen (x-axeln). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De olika vågorna av hematopoietiska prekursorceller överlappar delvis inom en kort tidsram, vilket gör analysen av varje våg av utvecklingshematopoiesis bidrag till immunceller tekniskt mycket utmanande.
Tamoxifen-inducerbara Cre-system erbjuder möjlighet att märka specifika celler på ett temporärt inducerbart sätt och att utföra linjäranalys i embryon eller vuxna, utan behov av ex vivo eller in vitro- odling eller transplantation. I tamoxifen-inducerbara Cre-stammar skapas en fusionsgen mellan ett bakteriellt Cre rekombinas och en mutant form av den ligandbindande domänen hos den mänskliga östrogenreceptorn (CRE-ER) eller mellan en förbättrad enkelpunktsmutant Cre och två musestrogenreceptorer (Mer-icre-Mer). Fusion av Cre med östrogenreceptorer leder till cytoplasmatisk sekvestrering av Cre av Hsp90, varigenom förhindrande av nukleär Cre-medierad rekombination. Tamoxifen (TAM) metaboliseras av thE lever i 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), dess aktiva metabolit med hög bindningsaffinitet för östrogenreceptor. OH-TAM-bindning till fusionsen Cre leder till störningen av interaktionen med Hsp90, vilket möjliggör dess translokation till kärnan och initiering av Cre-medierad rekombination. Injektion av TAM eller OH-TAM i utero till gravida kvinnor har visat sig aktivera rekombination i det utvecklande embryot. Tamoxifen administrering under graviditeten kan leda till abort och därmed minska kullstorleken, men det förhindrar också födseln om den levereras efter midsvården, i vilket fall poppleverans genom en kejsarsnitt krävs. För att motverka tamoxifeneffekter under graviditeten kompletterar vi OH-TAM administrering med en halv dos progesteron, för att förbättra överlevnaden av embryon och minska risken för aborter 17 .
Flera vägar kan användas för att leverera TAM eller OH-TAM till gravida kvinnor. För närvarande oral gavaGe eller intra peritoneal (ip) injektion används för tamoxifen. OH-TAM har fördelen att det är omedelbart tillgängligt, eftersom det inte behöver metaboliseras av den gravida dammens lever. Men medan tamoxifen är mycket lätt att lösa upp i majsolja är OH-TAM mycket svårt att förbereda med samma teknik och resulterar i en emulsion. Detta har varit ett begränsningssteg vid användning av OH-TAM för utero pulsmärkning. Vi har anpassat protokollet för beredning av OH-TAM som utvecklats av gruppen JF Nicolas 13 , där de använder PEG-35-ricinolja, ett lösningsmedel med amfifila egenskaper för att solubilisera OH-TAM, eftersom tamoxifenlösning är ett av de mest kritiska stegen I förfarandet. Detta möjliggör reproducerbar och optimal förberedelse av OH-TAM och förkortar tiden tamoxifenberedningen avsevärt. Vidare är det nödvändigt att anpassa koncentrationen av OH-TAM för injektion vid användning av olika inducerbara Cre-stammar. Kombinationen av ett bärbarhetsfärgämne (DAPI) och storlek (FSC) är avgörande för att ta bort döda celler och cellulära skräp. Döda celler och skräp är mycket autofluorescerande i de flesta av de violetta, blåa och röda laserdetektorerna, och kan hindra flödescytometrisk analys. Vidare rekommenderar vi inte att fixera cellerna efter färgning före analys med flödescytometern. Fixering kan leda till förändringar i cellmorfologi och därigenom gör svår diskriminering på grund av framåt och sidospridning (FSC vs SSC). Vidare leder fixering av prover med PFA till en signifikant förlust av YFP-fluorescerande intensitet.
Huvudbegränsningen inom detta protokoll är att populationerna inte testas på deras funktionalitet och differentieringspotential. För att övervinna detta kan celler sorteras efter ett liknande protokoll med användning av en fluorescensaktiverad cell sorterare (FACS) för att utföra kolonidannande analys. I detta fall måste proceduren utföras under sterila betingelser och användning av fetalt bovint serum (FBS) i FACS-bufferten, i stället för BSA, rekommenderas starkt. Den låga märkningseffektivitet som uppnås med denna teknik och det följaktligen låga antalet YFP + -celler av intresse per embryonvävnad är en stor utmaning vid studien av EMP-fenotyp. Detta protokoll använder en 4-laser flödescytometer. En flödescytometer med 3 lasrar kan också användas men det är viktigt att anpassa antikroppspanelen för att ta hänsyn till den ökade spektralöverlappningen mellan färgämnen. Dessutom krävs titrering av antikroppar för att hitta den lämpliga koncentrationen vid byte av antikroppspanelen och vi rekommenderar att man utför titrering av antikroppar och validering av den nya antikroppspanelen i ett pilotförsök där alla embryon per vävnad slås samman för att öka antalet Celler analyserade per vävnad.
Utvecklingsbiologins område har revolutionerats med Cre / Lox-metoden, vilket möjliggör permanent märkning av celler in situ . Detta tillvägagångssätt uppnårVävnads- eller celltypspecifikitet genom expression av Cre-rekombinaset under kontroll av en specifik promotor. I vårt fall valde vi att studera uttrycket av Cre rekombinaset under kontroll av promotorn av Csf1r (kolonistimulerande faktor 1 receptor), en viktig mitogen och tillväxtfaktorreceptor för makrofager och deras stamfödare, med användning av en stam som utvecklats av gruppen Av J. Pollard 18 . Fördelen med en ökningskartläggningsstrategi baserad på Csf1r-uttryck jämfört med andra publicerade strategier är att det medger märkning av äggula-avledda celler (EMP och makrofager) utan att märka några fetala HSCs 12 . Cx3cr1 Creert2- stammen kan även märka äggulackceller utan märkning av HSCs 19 , men det kan bara märka makrofager och makrofagprekursorer men det märker inte EMP-progenitorer 1 . Cx3cr1 Creert2- stammen har samma försiktighet som Csf1r
Denna metod kan vara viktigt inom en snar framtid för att studera EMP-differentieringsvägar. Medan EMP kommer fram från äggulfsendotelet från E8.5 till E10.5 4 tillåter denna metod endast att märka en bråkdel av progenitorerna som uppkommer mellan E8.5-E9.5. Därför är en begränsning av denna metod att endast en liten del av EMP är märkt, vilket gör det svårt att analysera i klassiska studier av förlust av funktion med fluxade alleler för cAndidatgener. Alternativt kan sparsam märkning bli en fördel i klonala studier av EMP-differentiering in vivo , med användning av klonal reporter. Emellertid måste märkningseffektiviteten karakteriseras för varje floxed reporter eller floxed allel som används, eftersom rekombinationseffektivitet hos floxade konstruktioner beror på genomiskt lokus (floxerade alleler) eller Rosa26-reporterkonstruktionen. Faktum är att olika Rosa26 reporterlinjer finns tillgängliga med olika promotorer och det rapporteras att Rosa26 tdTomato och Rosa26 mTmG- stammen har högre rekombinationseffektivitet än Rosa26 LSL-eYFP- linjen. Reportermusstammen som används i detta protokoll är Rosa26 LSL-eYFP- linje, som inte kan ge information om den dynamiska processen för förföljande mognad som nämns i resultatavsnittet. Frågan om mognadsprocessen kan delvis åtgärdas med olika reporterstammar som Rosa26 mTmG . I en sådan stam kan celler distanseraUished baserat på tiden som förflutit sedan rekombinationshändelsen. Alla celler i Rosa26 mTmG- stammen uttrycker membranbundet tdTomato-fluorescerande protein och Cre-rekombinationer exciterar tdTomatokassetten och möjliggör expression av membranbunden GFP. Eftersom tdTomato har en lång halveringstid, är celler som fortfarande innehåller tdTomato men som har börjat uttrycka GFP (kort efter rekombination) tdTomato + GFP låg / int och kan särskiljas från tdTomato neg GFP + -celler som inte längre uttrycker tdTomato och Uttrycka högre nivåer av GFP (senare efter rekombination).
Såsom diskuterats ovan är OH-TAM-beredning ett kritiskt steg för att konsekvent leverera liknande doser av OH-TAM mellan experiment och för att minska tamoxifen-bieffekter. Samtidig administrering av progesteron är också användbar för att begränsa skadlig verkan av tamoxifen vid graviditet. Ett annat kritiskt element i protokollet är livsdugligheten för encellsuspensionenN erhållen från olika embryonala vävnader. Vi brukar få> 90% livskraftiga celler för flödescytometrisk analys. För att uppnå detta är det viktigt att följa alla steg snabbt och för att behålla alla prov på is efter vävnadssamling. Lämpliga kontroller såsom ostämpade prover, enkla fläckar och fluorescerande minus en (FMO) kontroller är nödvändiga för att identifiera grindgränser och för att styra spektralöverlappningen i mångfärgade paneler. Förändringar i antikroppen måste valideras i termer av antikropptitrering och spektral överlappning. Slutligen måste valet av Rosa26-reporterstammen anpassas till den vetenskapliga frågan som undersöks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Prof Frederic Geissmann och Prof Christian Schulz för insiktsfulla diskussioner. Dr Hannah Garner för kritisk läsning av manuskriptet, Dr Xavier Montagutelli och Dr Jean Jaubert och personalen på Institut Pasteur djur anläggning för stöd med muskultur; Och Pascal Dardenne och Vytaute Boreikaite, en Amgen Scholar, för deras tekniska hjälp. Forskningen inom EGP-laboratoriet finansieras av Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM) och ett startpaket från Institut Pasteur och REVIVE-konsortiet. LI stöds av ett doktorskt stipendium från REVIVE-konsortiet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
