Summary
Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.
Abstract
Les macrophages sont des phagocytes professionnels du bras inné du système immunitaire. À l'état stable, les macrophages sessiles se retrouvent dans les tissus adultes où ils agissent comme des sentinelles de front d'infection et des lésions tissulaires. Alors que d'autres cellules immunitaires sont continuellement renouvelées à partir de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) situées dans la moelle osseuse, une lignée de macrophages, connue sous le nom de macrophages résidents, s'est révélée être auto-entretenue dans les tissus sans apport de HSPC de moelle osseuse. Cette lignée est illustrée par la microglie dans le cerveau, les cellules de Kupffer dans le foie et les cellules de Langerhans dans l'épiderme parmi d'autres. La lamelle intestinale et la lame de côlon sont les seuls tissus adultes dépourvus de macrophages résidents indépendants de HSPC. Des recherches récentes ont révélé que les macrophages résidents proviennent de l'hématopoïèse extra-embryonnaire des sacs vésicaux à partir de progéniteurs distincts des cellules souches hématopoïétiques fœtales (HSC). Chez l'hématopoïèse définitive du sac jaune, eLes progéniteurs rythromyélidiques (EMP) donnent naissance à la fois aux cellules érythroïdes et myéloïdes, en particulier les macrophages résidents. EMP ne sont générés que dans le sac jaune entre E8.5 et E10.5 jours de développement et ils migrent vers le foetus foetal dès que la circulation est connectée, où ils se développent et se différencient jusqu'à au moins E16.5. Leur descendance comprend les érythrocytes, les macrophages, les neutrophiles et les mastocytes, mais seuls les macrophages dérivés de l'EMP persistent jusqu'à l'âge adulte dans les tissus. La nature transitoire de l'émergence de l'EMP et le chevauchement temporel avec la génération HSC rend difficile l'analyse de ces progéniteurs. Nous avons établi un protocole de cartographie du sort inducible au tamoxifène basé sur l'expression du promoteur Csf1r du récepteur des cytokines des macrophages pour caractériser les cellules dérivées de l'EMP et de l'EMP in vivo par cytométrie de flux.
Introduction
Il existe plusieurs vagues de progéniteurs hématopoïétiques successifs mais se chevauchant pendant le développement dont la descendance myéloïde reste à l'âge adulte. Tout d' abord, unipotentes progéniteurs « primitives » apparaissent dans le sac vitellin de la souris 1, 2 entre E7.5-E8.25 et donnent lieu à des macrophages embryonnaires sans intermédiaire monocytaire. Que les macrophages dérivés de progéniteurs primitifs persistent dans le cerveau adulte car la microglie reste un sujet d'investigation active. Deuxièmement, les précurseurs érythro-myéloïdes (EMP) apparaissent dans le sac jaune chez E8.5, entre dans la circulation sanguine et colonisent l'embryon. Les EMP sortent de l'endothélium hémogène du sac vénitien dans une transition endothélial-hématopoïétique dépendant de Runx1 3 , 4 . Alors que EMP peut se différencier en macrophages dans le sac jaune, ils colonisent également le foie foetal du jour embryonnaire (E) 9 5 et différentDans les érythrocytes, les mégacaryocytes, les macrophages, les granocytes monocytes et les mastocytes 6 . Les macrophages qui proviennent des EMP présentent une capacité proliférative dans les tissus de développement et adultes. La question de savoir si les macrophages dérivés de l'EMP contournent le stade de la différenciation des monocytes est encore controversée car on sait très peu de choses sur leur voie de différenciation 7 , 8 . Enfin, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) émergent à E10.5 dans l'embryon proprement dite de la région aorte-gonade-mésonephros et migrent vers le foie foetal. Les HSC avec une capacité de repeuplement à long terme ne sont détectés qu'après E11 (au stade de la paire 42 somite) 9 . Là, ils se développent et se différencient de E12.5 jusqu'à ce que l'hématopoïèse définitive commence à se déplacer vers la moelle osseuse, ce qui devient le site prédominant de la production de globules sanguins pendant la durée de la vie postnatal 10 .
Le spLe chevauchement temporel et temporel dans l'émergence, ainsi que les marqueurs immuno-phénotypiques partagés ont jusqu'à présent entravé notre capacité à distinguer les contributions spécifiques de ces ondes de progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires. Alors que EMP et HSC sont générés de manière dépendante de Runx1 et expriment le facteur de transcription Myb et le récepteur du facteur de croissance Csf1r (Récepteur Factor 1 de Colony-Stimulating, également connu sous le nom de Récepteur de Facteur Stimulant de colonie de Macrophage) parmi d'autres, les EMP peuvent être distingués de HSC par leur manque de potentiel lymphoïde, in vitro et in vivo , leur manque de potentiel de repopulation à long terme et le manque d'expression superficielle du marqueur de lignée Sca-1 11 . Des modèles de cartographie du sort génétique sont nécessaires pour caractériser l'ontogénie des macrophages, car ils permettent de cibler les progéniteurs embryonnaires de manière spécifique à chaque cellule et à chaque fois. Nous présentons ici le protocole de cartographie du destin utilisé dans notre laboratoire pour discriminer les deux lignéesS des macrophages présents dans la plupart des tissus adultes: les macrophages infiltrés dérivés de HSC et les macrophages résidents indépendants de HSC.
Les macrophages résiduaires de tissus ont été remontés aux cellules précurseurs indépendantes de Myb exprimant le récepteur de cytokine Csf1r 12 et sont présents dans l'embryon à E8.5-E10.5 en utilisant trois stratégies complémentaires de cartographie du sort 6 . Pour étudier l'hématopoïèse des sacs vésicaux sans étiquetage des HSC foetaux, nous utilisons une souche transgénique, Csf1r MeriCreMer , exprimant une protéine de fusion inducible au tamoxifène de Cre recombinase améliorée et deux récepteurs d'œstrogènes de souris (Mer-iCre-Mer) sous le contrôle de Le promoteur Csf1r. Par conséquent, la recombinase Cre sera active dans Csf1r -expressing cells pendant une fenêtre temporelle limitée. Lorsqu'il est utilisé avec une souche rapportrice contenant une protéine fluorescente en aval d'une cassette Lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), elle conduira à la permanenceL'étiquetage génétique des cellules présentes au moment de l'induction mais aussi de leur descendance. L'administration à E8.5 de la forme active du tamoxifène, du 4-hydroxytamoxifène (OH-TAM), des EMP et des macrophages, sans étiquetage des progéniteurs "primitifs" ou des HSC foetaux unipotents. Ainsi, nous avons caractérisé l'immunophénotype des EMP et leur descendance pendant le développement embryonnaire, ainsi que la contribution des macrophages dérivés du sac vésiculaire aux pools de macrophages adultes. Un travail supplémentaire est nécessaire pour caractériser si les macrophages dérivés de progéniteurs primitifs sont également étiquetés en utilisant cette approche et s'ils peuvent contribuer à des pools de macrophages adultes.
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Protocol
Les procédures animales ont été effectuées conformément au comité institutionnel approuvé de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut Pasteur (CETEA).
1. Dans l' étiquetage du pouls Utero dans les embryons Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP
- Préparer la solution mère de 4-hydroxytamoxifène (OH-TAM, 50 mg / mL).
- Sous la fumée, ouvrir le flacon de 25 mg de OH-TAM et ajouter 250 μL d'éthanol (100%).
- Transférer la solution OH-TAM à un tube de microcentrifugeuse de 2 mL avec une extrémité tronquée et un vortex à la vitesse maximale pendant 10 minutes.
- Sonicate 30 min dans un bain sonicateur.
- Ajouter 250 μL d'huile de ricin PEG-35 sous l'humidité pour obtenir une solution mère de 50 mg / ml.
NOTE: L'huile de ricin PEG-35 est un solvant avec des propriétés amphiphiles qui lient des molécules hydrophobes et les solubilise dans des solvants aqueux. - Vortex pendant environ 5 minutesÀ vitesse maximale et sonicate 30 min dans un bain sonicateur.
- Aliquote de 90 μL (4,5 mg) par tube de microcentrifugeuse (1 aliquote par injection).
- Conserver à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C à long terme comme décrit précédemment 13 .
- Préparer la solution mère de progestérone (10 mg / mL)
- Ajouter 250 μL d'éthanol 100% à 25 mg de progestérone pour préparer une suspension de 10 mg / 100 μl sous l'humidité. Vortex doucement.
- Ajouter 2250 μL d'huile de tournesol autoclavée pour préparer 10 mg / ml de solution de progestérone sous le capot.
- Vortex pendant environ 5 min à la vitesse maximale, aliquote et conserver à 4 ° C. Notez que la solution est claire lorsqu'elle est stockée.
- Administration du tamoxifène
NOTE: Le développement embryonnaire a été estimé en fonction du jour de la formation de bouchons vaginaux en tant que jour embryonnaire (E) 0,5. La recombinaison est induite par injection unique à E8.5Chez les femelles Csf1r MeriCreMer enceintes 12 . Supplément OH-TAM avec 37,5 μg par g de Progestérone pour réduire les taux d'avortement après l'administration de tamoxifène. Injecter à 13 heures (pour le bouchon vaginal observé le matin).- Le matin de l'injection, soignez une portion aliquote de la solution OH-TAM pendant 10 minutes (ou jusqu'à la remise en suspension complète).
- Ajouter 360 μL de NaCl 0,9% sous l'humidité pour obtenir une solution de 10 mg / ml de OH-TAM et tourbillonner complètement. Sonicate jusqu'à ce que la solution soit claire et complètement remis en suspension (au moins 30 minutes).
- Préchauffer la progestérone à température ambiante.
- Mélanger 450 μL de OH-TAM et 225 μL de progestérone dans un tube de microcentrifugeuse. Vortex.
- Sonicate au moins 10 min et charge sur une seringue de 1 mL avec une aiguille 25G.
- Dans l'établissement animal, pesez la femme enceinte (les femelles Csf1r MeriCreMer sont dans un fond génétique de la FVB consanguine et pèsent typiquement entre ellesEn 25 et 33 g).
- Effectuer une injection intra-péritonéale en injectant lentement le volume calculé dans la souris. Après avoir retiré l'aiguille, appuyez doucement sur la blessure par ponction et masser l'abdomen pour distribuer le OH-TAM.
NOTE: La dose d'injection de OH-TAM est de 75 mg / kg et la dose de Progestérone est de 37,5 mg / kg. Le tableau 1 fournit le volume à injecter chez les femmes enceintes.
| Poids de la souris (g) | Volume total à injecter à partir du mélange (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 | </ Tr>
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tableau 1: Volume d'injection du 4-OH-tamoxifène (OH-TAM). Volume nécessaire pour une injection unique à E8,5 de 75 μg par g (poids corporel) de OH-TAM additionné de 37,5 μg par g de progestérone.
2. Dissection du Yolk Sac (YS) et Foetal Liver (FL)
REMARQUE: Des techniques stériles rigoureuses ne sont pas nécessaires lors de la manipulation d'embryons, sauf si elles vont être utilisées pour une culture à long terme. Néanmoins, la zone de travail doit être propre et recouverte de papier d'aluminium sous du papier absorbant.
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS) et un mélange de digestion (PBS contenant 1 mg / mL de collagénase D, 100 U / mL de désoxyribonucléase I (DNase I) et 3% de sérum bovin fœtal).
- Sacrifiez les femmes enceintes par cerLuxation sexuelle au jour de gestation souhaité ( p. Ex. Stade embryonnaire E10.5).
- Pincer la peau juste au-dessus des organes génitaux et faire une petite incision à la ligne médiane avec des ciseaux. Tirez la peau vers la tête pour exposer complètement la paroi du corps sans fourrure. Couper les muscles abdominaux pour exposer les organes internes et pousser l'intestin pour exposer les deux cornes utérines.
- Avec des pinces mijoteuses de taille moyenne, saisissez le bloc-gouttes attaché à l'ovaire et tirez délicatement l'utérus. Couper au niveau cervical des cornes utérines et soulever les cornes de la cavité péritonéale. Retirez le tampon gras pour libérer complètement les cornes utérines et couper les cornes de l'ovaire de chaque côté.
- Mettez les cornes dans du PBS glacé dans une boîte de Petri de 10 mm. Attaque rapidement les couches musculaires de l'utérus à une extrémité (extrémité cervicale) et faites glisser des ciseaux fins entre la couche musculaire et le tissu décalé pour libérer les embryons avec le tissu décalé environnant.
NOTE: Muscle a tendance à se contracter rapidement aprèsL'extraction, donc cette étape doit être aussi rapide que possible. - Utilisez une paire de pinces fines pour couper la membrane de Reichert et le placenta.
- Retirez doucement le sac jaune et placez-le dans une plaque de culture tissulaire de 24 po avec 0,5 ml de mélange de digestion.
REMARQUE: à cette étape, le sang embryonnaire peut être collecté.- Immédiatement après la séparation des vaisseaux ombilicaux et vitellinois, transférer l'embryon dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits contenant 10 mM d'acide éthylènediaminetétracétique glacé (EDTA). Décapiter l'embryon à l'aide de ciseaux fins et fins, en essayant de limiter autant que possible la dilaceration des tissus. Incuber sur de la glace pendant 10-15 min et recueillir l'EDTA contenant le sang.
- Retirer l'amnium entourant l'embryon.
- Pour les étapes <E11.5, comptez le nombre de paires somites pour une meilleure mise en scène des embryons et une meilleure résolution du temps (chaque paire somite se développe en ~ 1 h 30 min).
- Coupez la tête de l'embryon nousDes pinceaux ou des ciseaux fins. Transférer la tête vers une plaque à 24 puits avec 0,5 mL de mélange de digestion.
NOTE: Le neuroectoderme et le cerveau à des stades ultérieurs sont encore disséqués pour l'analyse de cytométrie en flux; Retirez soigneusement le plexus vasculaire environnant. - Couper l'embryon au-dessus du membre postérieur et retirer les membres avant.
- Pour isoler le foie, ouvrez le thorax en utilisant une pince fine. Pinche vers l'avant du cœur et tirez doucement pendant l'utilisation du deuxième pincement pour libérer les organes du corps.
- Séparez soigneusement le foie foetal du cœur et de l'intestin. Transférer le foie foetal à une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de mélange de digestion. Surveillez attentivement le transfert sous microscope de dissection.
- Recueillir la région de la queue (ou toute autre partie de l'embryon) pour le génotypage par dosage par réaction de polymérase en chaîne (PCR).
NOTE: D'autres tissus et organes peuvent être récoltés à partir d'embryons E10.5 pour une analyse similaire utilisant la cytométrie en flux. Sang, tête de skiN, la région aorta-gonad-mésonephros (AGM), le cœur et le neuroectoderme peuvent être collectés à E10.5. Aux étapes ultérieures, le poumon, le rein, la rate et le pancréas peuvent également être collectés. Une description détaillée de la dissection de l'AGA à différents stades de développement a déjà été décrite 14 .
3. Traitement des tissus embryonnaires pour la cytométrie de flux
- Incuber les organes (placés dans le mélange de digestion) pendant 30 min à 37 ° C.
- Transférer le tissu et la solution enzymatique sur un filtre de 100 μm placé dans une plaque de culture de tissu de 6 puits remplie de 6 ml de tampon FACS (albumine de sérum bovin à 0,5% (BSA) et EDTA 2 mM dans 1x PBS). Dissociez mécaniquement en faisant tremper doucement avec le piston en caoutchouc noir d'une seringue de 2 ml pour obtenir une suspension à une seule cellule.
REMARQUE: à partir de maintenant, toutes les étapes doivent être effectuées à 4 ° C. - Recueillir la suspension cellulaire avec une pipette Pasteur et la transférer dans un tube de 15 mL.
- SpiN pendant 7 min à 320 xg à 4 ° C. Jeter le surnageant par aspiration.
- Remettre en suspension la pastille dans 60 μL de tampon bloquant Fc (anticorps bloquant CD16 / CD32 dilué 1/50 dans un tampon FACS).
- Transférer 50 μL de la suspension à une seule cellule par puits dans une plaque à 96 puits multiples à fond rond. Incuber pendant au moins 15 minutes sur de la glace.
REMARQUE: La coloration peut également être effectuée dans 5 ml de tubes FACS en polystyrène lors de la manipulation d'un petit nombre d'échantillons. - Transférer les 10 μL restants dans un tube FACS en polystyrène de 5 ml pour obtenir un pool d'échantillons de chaque tissu. Ce pool servira de témoins ( c'est-à-dire des échantillons non colorés et des témoins fluorescents moins un (FMO) pour chaque fluorochrome). Transférer 50 μL de la piscine pour chaque contrôle fluorescent moins (FMO) (un par fluorochrome) à la plaque multi-puits 96.
NOTE: Chaque contrôle FMO contient tous les anticorps couplés au fluorochrome du panneau d'anticorps, à l'exception de celuiQui est mesuré. Les FMO sont utilisés pour identifier les limites des barrières et pour contrôler le chevauchement spectral dans les panneaux multicolores. Pour traiter correctement les variations de fond et l'autofluorescence entre différents tissus, il est important de préparer ces contrôles à partir du pool d'échantillons de chaque tissu. Le contrôle approprié pour l'expression de YFP sera les échantillons d'embryons Cre-négatifs, qui sont confirmés par le génotypage par PCR.
- Transférer 50 μL de la suspension à une seule cellule par puits dans une plaque à 96 puits multiples à fond rond. Incuber pendant au moins 15 minutes sur de la glace.
4. Coloration antigénique en surface
- Préparer le mélange d'anticorps dans le tampon FACS (tableau 2). Préparer 50 μL de mélange d'anticorps par échantillon.
- Utiliser les anticorps couplés au fluorochrome suivants: anti-CD45.2 (clone 104); Anti-CD11b (clone M1 / 70); Anti-F4 / 80 (clone BM8); Anti-AA4.1 (clone AA4.1); Anti-kit (clone 2B8); Et anti-Ter119 (clone Ter119).
- Préparez six mélanges d'anticorps pour les contrôles FMO dans le tampon FACS. Préparer 50 μL de mélange d'anticorps par échantillon témoin.
NONTE: La dilution d'anticorps dans le mélange d'anticorps est deux fois plus concentrée que la concentration finale indiquée dans la table des matériaux. Pour un panneau avec six anticorps couplés au fluorochrome, 6 contrôles FMO sont préparés. Le tableau 2 fournit la composition du mélange d'anticorps et des témoins FMO pour un tube.
| Volume (μL) d'anticorps (Volume final 50 μL) | ||||||||
| Anticorps | Cloner | Mélange d'anticorps | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | Kit FMO | FMO Ter119 |
| Anti-CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-CD11b | M1 / 70 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| Anti-kit | 2B8 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 |
| Anti-Ter119 | Ter119 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| Tampon FACS | 45,5 | 46,5 | 46 | 46,5 | 46,5 | 46 | 46 | |
Tableau 2: Volume des anticorps utilisés pour la coloration et les contrôles Fluorescent moins un (FMO). Volume (μL) d'anticorps requis pour un volume final de 50 μL.
- Ajouter 50 μL du mélange d'anticorps aux échantillons dans la plaque 96-multiwell (le volume final pendant la coloration est de 100 μL). Incorporer délicatement les pipettes deux fois et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Faire tourner la plaque à 96 puits multiples pendant 7 min à 320 xg à 4 ° C et jeter le surnageant. Resuspendre dans 200 μL de tampon FACS.
- Répéter la procédure de lavage (étape 4.3) deux fois avec 150 μL de tampon FACS.
- Filtrer les échantillons et les témoins (FMO et échantillons de pool non étayés) dans des tubes de 5 ml de polystyrène dans un filtre de 70 μm. Stocker sur la glace jusqu'à l'acquisition.
5. Identification des EMP et des macrophages dérivés de YS par cytométrie de flux
REMARQUE: Ce protocole a été optimisé à l'aide d'un cytomètre à flux laser 4 eqMis au point avec un laser Violet de 405 nm, un laser bleu de 488 nm, un laser jaune de 562 nm et un laser rouge de 638 nm.
- Préparer des perles de compensation pour chaque anticorps couplé suivant les instructions du fabricant. Utilisez des échantillons non étagés et des perles de compensation pour optimiser les intensités laser.
- Pour identifier les limites des barrières, utilisez les contrôles FMO (Fluorescence moins un) pour chaque anticorps.
- Afin d'exclure les cellules mortes, ajouter 1 μL de DAPI (1 mg / ml) au tube (contenant 200 μL de suspension de cellules colorées) 1 minute avant l'acquisition. Utilisez le signal DAPI fort et le paramètre dispersé vers l'avant (FSC) pour effectuer l'exclusion des cellules mortes et des débris.
REMARQUE: utilisez le logiciel du cytomètre de flux pour attirer les portes pendant l'acquisition. La matrice de compensation et l'analyse peuvent être effectuées après l'acquisition de l'échantillon en utilisant d'autres logiciels disponibles dans le commerce. - Utilisez la diffusion directe et latérale (FSC vs SSC) pour effectuer une discrimination de cellules vivantes et de doublet par rapport aux événements totaux.
- Créez des diagrammes de points de fluorescence dans l'axe de l'échelle logarithmique et tirez les portes filles pour, d'abord, exclure les érythrocytes (Ter119 + ) et ensuite identifier les cellules progénitrices (Kit + ) et les cellules hématopoïétiques (CD45 + Kit neg ) (voir la figure 1 ).
- Créez des histogrammes de fluorescence pour quantifier l'efficacité d'étiquetage du YFP parmi les différentes populations identifiées dans le YS ( Figure 2 ), le foie foetal ( Figure 3 ) et le cerveau ( Figure 4 ).
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Representative Results
La cartographie du sort génétique a été obtenue par administration à E8.5 de OH-TAM dans des femelles Csf1r-Mer-iCre-Mer associées à des mâles portant un reporter Rosa26-LSL-eYFP. En présence de OH-TAM, l'excision de la cassette d'arrêt conduit à l'expression permanente de YFP dans les cellules exprimant Csf1r . Nous avons recueilli deux tissus hématopoïétiques: le sac jaune et le foie foetal et un tissu non hématopoïétique, le neuroectoderme, des embryons à E10,5. Les suspensions monocellulaires ont été obtenues par dissociation enzymatique et mécanique et les échantillons ont été analysés par cytométrie de flux après coloration avec des anticorps à couplage fluorescent. Après l'exclusion des cellules mortes et des doublets, des suspensions de cellules individuelles ont été analysées ( figure 1 ). Toutes les portes ont été définies à l'aide des contrôles Fluorescence Minus One (FMO). Il est recommandé d'effectuer également une exclusion érythrocytaire (cellules Ter119 + ) pour améliorer la clarté de l'analyse ( Figure 1B + CD45 neg ; Kit + CD45 faible et Kit nég CD45 + ( Figure 1 ). Les progéniteurs ont été analysés plus en profondeur en fonction de leur expression de AA4.1 ( figures 2-4 ). En effet, AA4.1 est un marqueur de surface qui permet l'enrichissement de la population progénitrice dans les progéniteurs érythromyélidiques dans le sac jaune, comme démontré dans les essais de formation de colonies 15 . Une fois que les populations d'intérêt ont été identifiées, nous avons quantifié l'efficacité d'étiquetage du YFP dans chaque population en utilisant des histogrammes. Parmi le sac jaune Kit + progéniteurs, les deux populations cellulaires neg CD45 (figure 2A) et CD45 faible (figure 2B) contiennent des cellules AA4.1 + YFP +. Cependant, AA4.1 + YFP <Les cellules sup> + du foie et du cerveau ne se retrouvent que dans la population de progéniteurs de Kit + CD45 faible ( figure 3B et 4B ). Comme le cerveau n'est pas un site actif d'hématopoïèse, les progéniteurs présents dans ce tissu peuvent correspondre à des progéniteurs circulants. Cela suggère également un processus de maturation des progéniteurs lorsqu'ils migrent du sac jaune vers le foie foetal et les tissus périphériques. Les progéniteurs Kit + expriment d'abord AA4.1, indépendamment de l'expression CD45, mais au moment où ils atteignent la circulation et le foie foetal, tous les progéniteurs AA4.1 + YFP + expriment des niveaux détectables de CD45 de la surface cellulaire. Les macrophages, définis comme CD4b + CD lumineux F4 / 80, ont été trouvés dans la porte Kit- Neg CD45 + ( Figure 2-4 ). Les macrophages dans le sac jaune E10.5, le foie et le cerveau ont été efficacement étiquetés (60 à 80% des cellules F4 / 80 brillantes CD11b + sont YFP + ) b Ya une administration unique de OH-TAM à E8.5 ( Figure 2C , 3C et 4C ).
Pour comparer l'efficacité de l'étiquetage entre les portées, nous recommandons d'utiliser un contrôle interne pour l'efficacité de la recombinaison. La variabilité dans le niveau d'expression du journaliste peut être observée entre les expériences, en raison des variations du temps de développement entre les litières et les souches de souris lorsque l'OH-TAM est injecté dans l'utérus . Par conséquent, nous recommandons que la mise en place d'embryons à partir d'embryons E8.5 à E11.5 soit effectuée par comptage de paires de somites. Dans ce protocole, nous proposons d'utiliser l'efficacité d'étiquetage dans les macrophages résidents du cerveau (microglie) comme référence pour comparer l'efficacité de la recombinaison Cre entre différentes expériences et souches ( Figure 4C ). D'autres macrophages résidents pourraient être utilisés, mais la microglie était les premières cellules à être décrites comme des macrophages dérivés du sac de vitellinEf "> 16 et représentent la population la plus abondante de macrophages résiduaires de tissus à E10.5. Ainsi, l'étiquetage YFP dans la microglie peut être utilisé pour évaluer l'efficacité du cartographie du devenir dans chaque expérience et comparer les données de différentes larves.
Figure 1: Stratégie de gating pour identifier les cellules progénitrices (kit + CD45 nég et Kit + CD45 faible ) et les cellules hématopoïétiques différenciées (Kit nég CD45 + ). ( A ) La discrimination des cellules et des singes en direct est effectuée à l'aide des paramètres de coloration DAPI et Scatter Forward (FSC / SSC). ( B ) Après l'exclusion des globules rouges (Ter119 neg ), trois populations de cellules d'intérêt sont identifiées en fonction de l'expression de la surface cellulaire de Kit et CD45: Kit + CD45 neg ; Kit + CD45 faible neg CD45 + . ( C ) Les cellules exprimant Csf1r sont présentes lorsque l'OH-TAM est injecté et que leur descendance est identifiée dans des embryons positifs à la Cre recombinase comme exprimant YFP par rapport aux embryons Cre-recombinase négatifs (confirmés plus tard par un essai de réaction en chaîne par polymérase, PCR). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Efficacité d'étiquetage dans le sac jaune d'E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 Les embryons LSL-eYFP ont été transmis avec OH-TAM à E8.5. ( A ) Les cellules Kit + CD45 nég sont gated en fonction de l'expression Kit et CD45 sur les cellules du sac jaune vif (porte bleue, panneau gauche). AA4.1 et l'expression du kit sur les cellules Kit + CD45 neg . BluLa porte e comprend les cellules AA4.1 + Kit + CD45 neg (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les cellules négatives AA4.1 + Kit + CD45 neg (panneau droit) dans les contrôles Cre négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage de cellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). (B) + Kit basse cellules CD45 sont déclenchés sur la base de Kit et l' expression de CD45 (bleu de grille, panneau de gauche). AA4.1 et l'expression du kit sur les cellules CD Kit + CD45. La porte bleue comprend EMP, telle que définie par AA4.1 + Kit + CD45 low cells (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les cellules AA4.1 + Kit + CD45 faible (panneau droit) dans les contrôles cré négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage de cellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). ( C ) Les cellules hématopoïétiques sont définies comme Kit neg CD45
Figure 3: Efficacité de l'étiquetage dans le foie à partir de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryons avec OH-TAM à E8.5. ( A ) Les cellules Kit + CD45 nég sont gated en fonction de Kit et CD45Expression sur des cellules de foie en direct (porte bleue, panneau de gauche). AA4.1 et l'expression du kit sur les cellules Kit + CD45 neg . La porte bleue comprend AA4.1 + Kit + CD45 cellules négatives (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les cellules négatives AA4.1 + Kit + CD45 neg (panneau droit) dans les contrôles Cre négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage de cellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). (B) + Kit basse cellules CD45 sont déclenchés sur la base de Kit et l' expression de CD45 (bleu de grille, panneau de gauche). AA4.1 et l'expression du kit sur les cellules CD Kit + CD45. La porte bleue comprend EMP, telle que définie par AA4.1 + Kit + CD45 low cells (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les cellules AA4.1 + Kit + CD45 faible (panneau droit) dans les contrôles cré négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage deCellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). ( C ) Les cellules hématopoïétiques sont définies comme Kit neg CD45 + et fermées en bleu (panneau gauche). Expression F4 / 80 et CD11b sur les cellules Kit- Neg CD45 + . Les macrophages sont définis comme des cellules lumineuses F4 / 80 brillantes CD11b + (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les macrophages lumineux CD4b + F4 / 80 (panneau droit) dans les contrôles Cre négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage de cellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Efficacité de l'étiquetage dans le cerveau à partir de E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuLsed avec OH-TAM à E8.5. ( A ) Les cellules Kit + CD45 nég sont gated en fonction de l'expression Kit et CD45 sur les cellules du cerveau vivant (porte bleue, panneau gauche). AA4.1 et l'expression du kit sur les cellules Kit + CD45 neg . La porte bleue comprend AA4.1 + Kit + CD45 cellules négatives (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les cellules négatives AA4.1 + Kit + CD45 neg (panneau droit) dans les contrôles Cre négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage de cellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). (B) + Kit basse cellules CD45 sont déclenchés sur la base de Kit et l' expression de CD45 (bleu de grille, panneau de gauche). AA4.1 et l'expression du kit sur les cellules CD Kit + CD45. La porte bleue comprend EMP, telle que définie par AA4.1 + Kit + CD45 low cells (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans AA4.1 + Kit + CD45 faible C ) Les cellules hématopoïétiques sont définies comme Kit neg CD45 + et fermées en bleu (panneau gauche). Expression F4 / 80 et CD11b sur les cellules Kit- Neg CD45 + . Les macrophages sont définis comme des cellules lumineuses F4 / 80 brillantes CD11b + (panneau central). Comparaison de l'étiquetage YFP dans les macrophages lumineux CD4b + F4 / 80 (panneau droit) dans les contrôles Cre négatifs (noir) et les échantillons Cre positifs (vert). Les histogrammes représentent le pourcentage de cellules (axe y) positif pour le signal YFP (axe des x). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les différentes ondes de cellules précurseurs hématopoïétiques se chevauchent partiellement dans un court laps de temps, ce qui rend l'analyse de la contribution de chaque onde d'hématopoïèse du développement aux cellules immunitaires techniquement très difficile.
Les systèmes créateurs inducibles au tamoxifène offrent l'opportunité de marquer des cellules spécifiques de façon inducible dans le temps et d'effectuer une analyse de lignage chez des embryons ou des adultes, sans avoir besoin de culture ou de transplantation ex vivo ou in vitro . Dans les souches de Cre inducibles par le tamoxifène, un gène de fusion est créé entre une recombinase recombinante bactérienne et une forme mutante du domaine de liaison au ligand du récepteur des œstrogènes humains (CRE-ER) ou entre un mutant amélioré Cre mutant et deux récepteurs d'œstrogènes de souris (Mer-iCre-Mer). Fusion de Cre avec des récepteurs d'œstrogène conduit à la séquestration cytoplasmique de Cre par Hsp90, empêchant ainsi la recombinaison nucléaire à médiation par Cre. Le tamoxifène (TAM) est métabolisé parLe foie dans le 4-hydroxytamoxifène (OH-TAM), son métabolite actif avec une forte affinité de liaison pour le récepteur des œstrogènes. La liaison OH-TAM à la fusion Cre conduit à la perturbation de l'interaction avec Hsp90, permettant sa translocation vers le noyau et l'initiation de la recombinaison à médiation par Cre. L'injection de TAM ou d'OH-TAM dans l'utérus chez les femmes enceintes a été révélée pour activer la recombinaison dans l'embryon en développement. L'administration de tamoxifène pendant la grossesse peut conduire à un avortement et réduit ainsi la taille de la litière, mais elle empêche également la naissance si elle est livrée après la mi-gestation, auquel cas l'accouchement des chiens par une césarienne est nécessaire. Pour contrebalancer les effets de tamoxifène pendant la grossesse, nous complétons l'administration d'OH-TAM avec une demi-dose de progestérone, afin d'améliorer la survie des embryons et de réduire le risque d'avortements 17 .
Plusieurs voies peuvent être utilisées pour délivrer TAM ou OH-TAM chez des femelles enceintes. Gava à l'heure actuelleL'injection intra ou péritonéale (ip) est utilisée pour le tamoxifène. OH-TAM a l'avantage d'être immédiatement disponible, car il ne nécessite pas d'être métabolisé par le foie du barrage enceinte. Cependant, bien que le tamoxifène soit très facile à dissoudre dans l'huile de maïs, OH-TAM est très difficile à préparer en utilisant la même technique et entraîne une émulsion. Cela a été une étape limitante dans l'utilisation de OH-TAM pour l' étiquetage de l'impulsion in utero . Nous avons adapté le protocole de préparation de OH-TAM développé par le groupe de JF Nicolas 13 , où ils utilisent de l'huile de ricin PEG-35, un solvant à propriétés amphiphiles pour solubiliser OH-TAM, car la dissolution du tamoxifène est l'une des étapes les plus critiques Dans la procédure. Cela permet une préparation reproductible et optimale de OH-TAM et réduit considérablement le temps de préparation du tamoxifène. En outre, il est nécessaire d'adapter la concentration de OH-TAM à injecter lors de l'utilisation de différentes souches creuses indescibles. La combinaison d'un colorant de viabilité (DAPI) et la taille (FSC) est essentiel pour éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires, respectivement. Les cellules mortes et les débris sont très autofluorescents dans la plupart des détecteurs laser violet, bleu et rouge et peuvent entraver l'analyse cytométrique en flux. En outre, nous ne recommandons pas de fixer les cellules après coloration avant analyse avec le cytomètre de flux. La fixation peut conduire à des changements dans la morphologie cellulaire et rend ainsi une discrimination de taille difficile basée sur Forward and Side Scatter (FSC vs SSC). En outre, la fixation des échantillons avec PFA entraîne une perte significative de l'intensité fluorescente du YFP.
La principale limitation dans ce protocole est que les populations ne sont pas testées quant à leur fonctionnalité et leur potentiel de différenciation. Afin de remédier à cela, les cellules peuvent être triées suivant un protocole similaire utilisant un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS) pour effectuer un test de colonisation. Dans ce cas, la procédure doit être effectuée dans des conditions stériles et l'utilisation du sérum bovin fœtal (FBS) dans le tampon FACS, au lieu de BSA, est fortement recommandé. La faible efficacité d'étiquetage obtenue avec cette technique et le faible nombre de cellules YFP + d'intérêt par tissu embryonnaire est un défi majeur dans l'étude du phénotype EMP. Ce protocole utilise un cytomètre à flux laser 4-laser. Un cytomètre de flux avec 3 lasers peut également être utilisé, mais il est important d'adapter le panneau d'anticorps pour tenir compte de l'accroissement du chevauchement spectral entre les colorants. En outre, le titrage des anticorps est nécessaire pour trouver la concentration appropriée lors de la modification du panneau d'anticorps et nous recommandons d'effectuer le titrage d'anticorps et la validation du nouveau panneau d'anticorps dans une expérience pilote où tous les embryons par tissu sont regroupés afin d'augmenter le nombre de Cellules analysées par tissu.
Le domaine de la biologie du développement a été révolutionné par la méthode Cre / Lox, qui permet l'étiquetage permanent des cellules in situ . Cette approche atteintTypologie du type tissu ou cellule par l'expression de la recombinase Cre sous le contrôle d'un promoteur spécifique. Dans notre cas, nous avons choisi d'étudier l'expression de la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur du Csf1r (récepteur stimulant le facteur 1 de colonie), un important facteur de croissance mitogène et de facteur de croissance pour les macrophages et leurs progéniteurs, en utilisant une souche développée par le groupe De J. Pollard 18 . L'avantage d'une stratégie de cartographie du destin basée sur l'expression de Csf1r par rapport à d'autres stratégies publiées est qu'il permet l'étiquetage des cellules dérivées du sac jaune (EMP et macrophages) sans étiqueter de HSC foetale 12 . La souche Creert2 de Cx3cr1 peut également étiqueter les cellules du sac jaune sans étiquetage des HSC 19 , mais elle ne peut étiqueter que les macrophages et les précurseurs de macrophages, mais elle ne marque pas les progéniteurs EMP 1 . La souche Creert2 de Cx3cr1 présente la même mise en garde que le Csf1r
Cette méthode pourrait être importante dans un proche avenir pour étudier les voies de différenciation EMP. Alors que les EMP sortent de l'endothélium du sac jaune de E8.5 à E10.5 4, cette méthode permet seulement d'étiqueter une fraction des progéniteurs émergents entre E8.5-E9.5. Par conséquent, une limitation de cette méthode est que seule une petite fraction de EMP est marquée, ce qui rend difficile l'analyse dans les études classiques de perte de fonction avec des allèles floxed pour cAndidate des gènes. Alternativement, l'étiquetage éparse pourrait devenir un avantage dans les études clonales de la différenciation EMP in vivo , en utilisant un journaliste clonal. Néanmoins, l'efficacité de l'étiquetage doit être caractérisée pour chaque reporter floxed ou allèle floxed utilisé, car l'efficacité de recombinaison des constructions floxed dépend du locus génomique (allèles floxed) ou de la construction rapporteur Rosa26. En effet, différentes lignes rapporteurs Rosa26 sont disponibles avec différents promoteurs et il est rapporté que les souches Rosa26 tdTomato et Rosa26 mTmG ont une efficacité de recombinaison plus élevée que la ligne Rosa26 LSL-eYFP . La souche de souris rapporteur utilisée dans ce protocole est la ligne Rosa26 LSL-eYFP , qui ne peut pas fournir d'informations concernant le processus dynamique de maturation des progéniteurs mentionné dans la section des résultats. La question du processus de maturation peut être partiellement abordée en utilisant différentes souches rapporteurs comme Rosa26 mTmG . Dans une telle tension, les cellules peuvent être distinguesCalculé en fonction du temps écoulé depuis l'événement de recombinaison. Toutes les cellules dans la souche Rosa26 mTmG expriment la protéine fluorescente tdTomato liée à la membrane et la recombinaison Cre accise la cassette tdTomato et permet l'expression de la GFP liée à la membrane. Étant donné que tdTomato a une longue demi-vie, les cellules qui contiennent encore tdTomato mais ont commencé à exprimer le GFP (peu après la recombinaison) sont tdTomato + GFP low / int et peuvent être distinguées des cellules TDTomato neg GFP + qui n'expriment plus tdTomato et Exprimer des niveaux plus élevés de GFP (plus tard après la recombinaison).
Comme discuté ci-dessus, la préparation de OH-TAM est une étape critique pour constamment administrer des doses similaires de OH-TAM entre les expériences et pour réduire les effets secondaires de tamoxifène. La co-administration de progestérone est également utile pour limiter les effets néfastes du tamoxifène sur la grossesse. Un autre élément critique du protocole est la viabilité du suspensio à une seule celluleN obtenu à partir de différents tissus embryonnaires. Nous obtenons habituellement> 90% de cellules viables pour l'analyse cytométrique en flux. Pour ce faire, il est essentiel de suivre rapidement toutes les étapes et de maintenir tous les échantillons sur la glace après la collecte des tissus. Des contrôles appropriés tels que des échantillons non colorés, des taches simples et des contrôles fluorescents moins un (FMO) sont nécessaires pour identifier les limites des portes et pour contrôler le chevauchement spectral dans les panneaux multicolores. Les changements dans l'anticorps doivent être validés en termes de titrage d'anticorps et de chevauchement spectral. Enfin, le choix de la souche rapportrice Rosa26 doit être adapté à la question scientifique étudiée.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Frédéric Geissmann et le professeur Christian Schulz pour des discussions approfondies; Dr Hannah Garner pour la lecture critique du manuscrit, le Dr Xavier Montagutelli et le Dr Jean Jaubert et le personnel de l'établissement animalier Institut Pasteur pour le soutien à l'élevage de souris; Et Pascal Dardenne et Vytaute Boreikaite, un Amgen Scholar, pour leur assistance technique. La recherche dans le laboratoire EGP est financée par l'Institut Pasteur, le CNRS, le Cercle FSER (FRM et un paquet de départ de l'Institut Pasteur et le consortium REVIVE. LI est soutenu par une bourse de doctorat du consortium REVIVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
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