Summary
Этот протокол описывает использование водоотливной тампоны и анализ шлама данио рерио систем, что приводит к увеличению числа случаев обнаружения по сравнению с исключительно для использования часовые обнаружить патогены, например Aeromonas hydrophila, микобактерии spp. и Pseudocapillaria tomentosa. Предлагается также системы мониторинга P. tomentosa яйца в карантин.
Abstract
Разрабатываются и применяются в zebrafish научно-исследовательских учреждений потому что возбудители данио рерио Aeromonas hydrophila, микобактерии spp. и Pseudocapillaria tomentosa имеют потенциал для мониторинга систем здравоохранения ухудшить благополучия животных и исследований. Рыбы, обычно анализируемого посмертное обнаружить микробов. Использование часовые является предлагаемый способ улучшить чувствительность наблюдения и уменьшить количество животных для выборки. Описывается настройка предварительной фильтрации дозорных танк из рециркуляционные системы. Техника для предотвращения загрязнения воды и представлять рыбы населения разработан тщательный отбор возраста, пола и штаммов. Чтобы использовать минимальное количество животных, также подробно изложены методы для окружающей среды. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) на поверхности поддона тампоны используется значительно улучшить обнаружение некоторых видов распространенных и патогенных микобактериальной Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumи Микобактерии chelonae. Другой метод окружающей среды состоит из обработки шлама в нижней части бачок или отстойник искать P. tomentosa яйца. Это дешевый и быстрый метод, который может быть применен в карантин, где устройство разведения погружался в бачок импортных животных. Наконец ПЦР применяется к выборке шлама и A. hydrophila обнаружен на дно поддона и поверхности. Как правило эти методы экологической проверки применительно к этим конкретным патогенов привели к повышенной чувствительности, по сравнению с тестирование предварительной фильтрации часовые.
Introduction
Чтобы защитить исследований и благосостояние животных1,2, в животных зал отслеживается наличие патогенов. В случае данио рерио, работоспособностью3,4,5,6,,78,9,10,11 часто опирается на животных проанализированы посмертное гистопатология, бактериология культуры или молекулярных методов. Тестирование только колонии животных не является рекомендуемым способом из-за количества рыбы и связанные с этим расходы, которые могут потребоваться для выявления возбудителей низкой распространенности. Таким образом предпочтительным методом является подвергать небольшой группы животных в более высокие нагрузки загрязнителей. Эти рыбы, называются часовые предварительной фильтрации. Это воздействие длится в течение месяцев и включает в себя увеличение рабочей нагрузки животных уход и/или некоторые специально инженерное решение. Еще одной проблемой является скрининг импортных линий в карантин где плодородные животных должны поддерживаться и это не совместимо с рутинных анализов на туши.
Здесь мы описываем некоторые методы для обнаружения определенных патогенов данио рерио (A. hydrophila, микобактерии spp. и P. tomentosa) путем проведения скрининга среды водной системы. Цель-сократить количество рыб, используемых для мониторинга состояния и для оптимизации оборота, стоимости и чувствительность обнаружения. Такие методы являются альтернативой использования животных и некоторые методы могут быть применены для проверки импорта в карантин. К примеру Mocho9 смогла выявить больше видов патогенных микобактерий, выполняя ПЦР на Картер тампоны, а не на данио рерио (включая часовых), и это было получено с меньшим количеством образцов. В этом же исследовании, P. tomentosa яйца были обнаружены с больше чувствительности скрининга с помощью флотации и микроскопии осадка танк вместо тестирования рыбы методом ПЦР и гистопатология.
В таблице 1 перечислены различные характеристики дозорных программы3,4,5,6,,78,9,10 используется ряд данио рерио объектов. После фильтрации часовые получают воду так же, как любой рыбы колонии, в то время как часовые предварительной фильтрации получают воду после того, как он распространил через колонии рыбы цистерны сначала. Например часовые предварительной фильтрации можно установить в системе рециркуляции, непрерывно получив грязевика воды. Это не может быть вариант, когда существует множество независимых систем в одной комнате. В этом случае один танк предварительной фильтрации часовые могут использоваться для экран всю комнату. Часовые в статической танк, рециркуляционные системы, и их воды меняется регулярно, используя только предварительной фильтрации воды т.е., отстойник воды из всех систем в комнате. Этот метод описан ниже как базовый уровень для сравнения с эффективность экологической проверки. Предлагаемое создание предназначен для управления вопросы качества воды как снижение рН или загрязнения азотом.
Концепция бактериальных экологического скрининга опирается на предположение, что бактерии обнаруживаются в биопленки, как это имеет место на стене колодца на поверхности воды или осадка в нижней части бака. Поддон кажется идеальной точки рециркуляционного аквакультуры системы так, как он собирает отходы (воды, фекалии, корма и другие органические материалы) от всех танков предварительной фильтрации. Поверхность поддона часто легко добраться, свабирование быстро, и она может быть выполнена асептически чтобы избежать перекрестного загрязнения образца (от перчатки для примера). Концепция используется для идентификации распространенными патогенными Mycobacterium spp. в данио рерио систем9,12. Этот метод описан ниже и мы также отчетности обнаружение A. hydrophila в данио рерио Картер поверхностных смывов и шлама.
Экологического скрининга для яиц паразита основана на обнаружении Murray et al. 13 и Флотационный метод обычно используется для паразитологии и микроскопических скрининг яиц паразита в фекалиях14. Mocho9 предложил альтернативу процесс выборки и показали, что метод может использоваться для обнаружения других видов рыбы биотопа. Зараженных D. рерио проходят P. tomentosa яйца с их фекалии и яйца паразита остаются в нижней части бака, в осадок. Они могут быть собраны там из-за их плотность, больше, чем вода. Плотности яиц используется для обработки экологических образцов тоже. Первый флотации с центрифугированием отделяет воды и света мусора от тяжелее материи. Второй центрифугирования опирается на насыщенных сахаром решения (с плотностью больше чем плотность яйца P. tomentosa ) для яиц паразита появляться на поверхности трубы.
Скрининг для бактерий биопленки и P. tomentosa от нижней части цистерны могут быть объединены путем выполнения ПЦР для всех этих патогенов на образец отложения осадка, полученные после первого центрифугирования. Это оптимизирует время выборки. Этот метод описан ниже. Мы также предлагаем использовать эти методы в контексте карантина. Для блокировки импортированные взрослых рыбок данио, которые должны поддерживаться, разводить устройство вставляется в бак карантина. После одной недели фекалии и другие отходы в устройстве разведения собираются и проверяются по микроскопии или ПЦР. Ниже описывается метод и некоторые P. tomentosa яйца были обнаружены при микроскопии в этом контексте.
Protocol
1. выявление предварительной фильтрации часовые из рециркуляционные системы
-
Установите чистый 8 Л резервуар из рециркуляционные системы. Заполните его водой из отстойников. Добавить 2 керамический бисер или Губка кубов био-средств массовой информации от систем экран (Рисунок 1). Добавьте 1-2 D.рерио/l (то есть, 12 рыба). Использование дикого типа рыб доминирующим генетический фон на объекте, например AB.
- Выберите по крайней мере 6 рыбы следующим образом: по крайней мере одна женщина и один мужчина ниже 6 месяцев возраст, одна женщина и один мужчина между 6 и 18 месяцев и одна женщина и один мужчина старше 18 месяцев возраста.
-
Кормить один раз в день. Варьироваться диеты (например, сухой диете, артемии) чтобы убедиться, что часовые подвержены все диеты, используемые в объекте данио рерио. Менять воду в понедельник, среду и пятницу, т.е., три раза в неделю в течение 4 месяцев.
- Для проведения воды изменений, часовые передачи и био СМИ в временной бак. Полностью Опорожните емкость дозорных и очистить его. Пополните дозорных танк поддон водой только. Вернуть часовые и био СМИ.
- Разоблачить часовые 4 месяцев, чтобы поддон водой. Усыпить рыбы утвержденным методом как погружение в раствор передозировки 2-феноксиэтанол (3 мл/Л).
-
Чтобы подтвердить смерть, через 10 минут после прекращения Оперкулум движения.
- Возьмите труп с щипцами и заморозить ее полностью на-80 ° C в выявленных контейнера. Это будет использоваться для ПЦР12,15.
- Кроме того сократить tailat хвостового стебля, Ник брюшной стенки и в 4% формалина.
Предупреждение: Использовать перчатки и вытяжной шкаф для гистопатология. Метки образца контейнера.
2. Картер тампоны
- Используйте стерильные сухим тампоном с пластиковой валом. Надевайте перчатки. Найдите поверхности тампоном (Картер стены на поверхности воды) и удалить любой элемент предотвращения легкий доступ к поверхности. Выберите поверхность поддона с низким потоком.
-
Unsheathe тампон, удалив наружной тары и разоблачить наконечник стерильным хлопка в воздух. Избегайте перекрестного загрязнения тампоном, стараясь не коснуться непроверенных поверхностей.
- Тампоном Картер стены более 5-10 см для поглощения воды и биопленки на уровне поверхности воды отстойник.
- Оболочка тампоном обратно или сломать кончик в стерильных пластиковых пробирок. Метки образца и отправить для PCR тестирования или заморозить при температуре-80 ° C.
3. Обнаружение P. tomentosa яиц в нижней части бака
-
Анализ шлама по микроскопии
- Используйте 60 мл шприц9 для аспирационная осадок на дне колодца или любой танк, холдинг рыбы, включая часовые. Разделите образца на 15 мл пробирок. Закройте трубки с их винтовой крышкой и метки трубы.
- Подготовить раствор сахара насыщенных (удельный вес = 1,27), смешивая с магнитной мешалкой14227 г сахарного песка в 177 мл горячей воды.
- Центрифуга для 15 мл пробирок на 175-250 x g 10 мин в центрифуге с качели ведра. Декант трубы и отложений в их трубки.
- Заполните трубы на полпути с сахар насыщенный раствор. Закройте трубки с их завинчивающейся крышкой и тщательно перемешайте отложений с решением.
- Место труб в качели ведер центрифуга и заполнить их с сахар насыщенный раствор на вершину. Установить один Стекло покровное мягко на вершине каждой трубы и при контакте с сахар насыщенный раствор.
- Центрифуги на 175-250 x g 10 мин Обратите внимание, что некоторые покровным стеклом может упасть и перерыв во время центрифугирования следовательно там находятся 4 трубы для каждого образца, 60 мл. Поднимите крышку стекла и установить его на стеклянное скольжение. Метка слайда с карандашом или маркером ручкой.
- В случае, если слишком много Стекло покровное обрывы происходят, заполнить большую часть трубки с раствор сахара насыщенных, центрифуги на 175-250 x g за 10 мин, заполнить доверху сахар насыщенный раствор, а затем осторожно установите крышку стекла. Подождите 30 минут.
- Ищите P. tomentosa яйца с микроскопом13 (рис. 2 и 1 видео). Идентифицировать биполярного вилки на увеличение, 400 X6.
Примечание: Размер яйца-57-78 мкм длиной и 27-39 мкм диаметром16,17. Обратите внимание, что один положительный слайд достаточно для 60 мл образца должны быть объявлены положительный.
-
Скрининг импорта животных в карантин для P. tomentosa яйца
- Установите мужского и женского пола D. рерио в баке. Залейте в бак устройства обычно используются для сбора урожая и сохранить породил яйца, но использовать его здесь для сбора фекалий (рис. 3).
Примечание: например, полным баком разводить 1 Л (внешнего резервуара и внутренний резервуар с тертым внизу) полностью погружать в 13 Л бак, позволяя свободный доступ для рыбы для перемещения и из разведения устройства. - Удалите устройство разведения после одной недели и урожай собранные шлама в селекции устройство, как описано в шаге 3.1 «осадка анализ по микроскопии.»
- Установите мужского и женского пола D. рерио в баке. Залейте в бак устройства обычно используются для сбора урожая и сохранить породил яйца, но использовать его здесь для сбора фекалий (рис. 3).
4. ПЦР на отложения осадка
- Аспирационная шлама в нижней части бака или поддон с 60 мл шприц9 и передать образец 60 мл. Закройте трубку с его завинчивающейся крышкой и этикетке трубки. Выбрасывайте шприц.
- Встряхните тюбик 60 мл и передачи 15 мл 15 мл. Закройте трубку с его завинчивающейся крышкой и этикетке трубки.
- Центрифуга 15 мл на 175-250 x g 10 мин в центрифуге с качели ведра. Декант трубы и держать отложений в трубе.
-
Unsheathe тампоном, удалив наружной тары и разоблачить наконечник стерильным хлопка в воздух. Избегайте перекрестного загрязнения тампоном, стараясь не коснуться непроверенных поверхностей.
- Тампон отложений в трубе для 15 s.
- Оболочка тампоном обратно или сломать кончик в стерильных пластиковых пробирок. Метки образца, заморозить при температуре-80 ° C и отправить для PCR тестирования.
Примечание: 45 мл остаются в 60 мл. Это может храниться для обнаружения яиц P. tomentosa анализ шлама при микроскопии как описано в пункте 3.1, например, для подтверждения результатов ПЦР. ПЦР в осадок может быть привлечен для досмотра импортных животных, следующий шаг 3.2.
Representative Results
Преимущества Картер тампоны для выявления распространенных Mycobacterium spp., по сравнению с образцы рыбы поддерживаются результаты на рисунке 4. Из 115 рыбы испытания м. chelonae и м. haemophilum были обнаружены в 5% и 3% проб, соответственно. Без других видов, патогенных микобактериальной была определена. От тех же систем 49 Картер тампоны показали наличие 5 микобактериальной видов. Отношение шансов рассчитываются с гипотезой, что м. chelonae и м. fortuitum обнаруживаются чаще методом ПЦР в поверхности поддона тампоны, чем в образце рыбы. Это статистически значимым с соответствующих коэффициентов соотношения 11 (95% ДИ: 4-29; p < 0.0001) и 306 (95% ДИ: 18 до 5208; p = 0.0001). Результаты показывают, что техника тампоном поверхности Картер является ценной альтернативой исключительно для использования часовые экран данио рерио объекта для Mycobacterium spp. Экологические пробы были также использованы для экран для A. hydrophila. Эти бактерии были обнаружены в рыбе, шлама и поверхности образцов (рис. 4). Это также поддерживает способность предлагаемых методов экран биотоп рыбы.
Относительно анализа шлама для обнаружения P. tomentosa яйца Mocho9 в 27% образцов рыб ПЦР и гистопатологии обнаружено паразита в то время как яйца были обнаружены в 93% проанализированных осадка из той же системы. Здесь техника была оспорена воспроизвести карантина скрининга. В этом контексте нельзя попробовать импортные животных, и оценке их состояния здоровья своевременно помогает с руководством биозащищенности. В 8 танков с разведения устройства были установлены рыбы неизвестного состояния от объекта позитивные P. tomentosa : максимум 16 бака рыб/13 Л, 7 трансгенных и 1 дикого типа линии, обоего пола, в возрасте от 4 до 24 месяцев. Шлама было собрано из устройства после одной недели и анализируемой микроскопии. P. tomentosa яйца были замечены в 7 образцах (88%). Наконец ПЦР обнаружение паразитов было тестируется на Картер тампоны и отложения осадка. 4 из 6 образцов шлама были ПЦР позитивные и все результаты были отрицательными для поверхностных смывов. Это не удивительно, поскольку отбор шлама опирается на способность яйца падают на дно бака. Это показывает, что методы анализа шлама может использоваться для экран D. рерио аквариумов для заражения P. tomentosa и что методы могут быть адаптированы для проверки импортируемых животных.
Рисунок 1: Предварительная фильтрация дозорных танк из рециркуляционные системы. 8 Л бак заполняется водой и био СМИ из отстойников систем экран. Две белые керамические био медиа бусины сидеть в нижней части бака (в центре рисунка). 12 рыбы выбираются в зависимости от их возраста, деформации и пола, и они добавляются к дозорных танк. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: P. tomentosa яйцо, обнаруженных во время анализа шлама микроскопии. Увеличение используемых был 400 X. Стрелки указывают биполярного вилки. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Разведение устройство погруженной в рыбы бачок для сбора шлама для анализа. Этот резервуар устанавливается на скамейке с целью изображение; в противном случае она устанавливается в системе рециркуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Процент идентификации Mycobacterium spp., A. hydrophilaи P. tomentosa методом ПЦР на рыбу, поверхности поддона тампоны и отстойник ила. Процент получается путем деления числа положительных результатов для каждого вида патогена на количество испытанных образцов. Процент положительных результатов дается образец типа как рыба, поверхность или осадка и указывается после имени бактерий. 115 рыбы и 49 поверхности поддона мазки были протестированы ПЦР для выявления микобактерий spp. Данные компилируются с Mocho в9 результаты, так как она является продолжением этого исследования. Рыбы являются главным образом предварительной фильтрации часовые согласно протоколу раздела 1. Редко, когда стражи были не доступны, беглецов и старой колонии рыбы (> 18 месяцев) были взяты пробы. Всех протестированных систем микобактерии spp. были протестированы на рыбу и Картер тампоны. Отношение шансов рассчитываются с гипотезой, что м. chelonae и м. fortuitum обнаруживаются чаще методом ПЦР в поверхности поддона тампоны, чем в образце рыбы. Это статистически значимым с соответствующих коэффициентов соотношения 11 (95% ДИ: 4-29; p < 0.0001) и 306 (95% ДИ: 18 до 5208; p = 0.0001). Mycobacterium marinum PCR был отрицательным для всех образцов и поэтому считается отсутствие от этих объектов и не включены в анализ. 12 рыб, 14 поверхности поддона тампоны и 6 отстойник ила были протестированы методом ПЦР на наличие A. hydrophila. 6 грязевики были проверены на наличие P. tomentosa на поверхности и в осадок. ПЦР = полимеразной цепной реакции. CI = доверительный интервал. * и ** указывают статистической значимости; другие сравнения не были статистически значимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: сканирование для яйцо из P. tomentosa с микроскопом. Слайд получается из анализа шлама, как описано в пункте 3.1. Поле отсканированы для обнаружения яиц P. tomentosa. После того, как структура распознается, она увеличена для подтверждения идентификации с высоким разрешением. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| Авторы | Возраст в начале экспозиции | Длина экспозиции | Возраст выборки | До или после Фильтрация |
Пол | Strain(s) |
| Бартон и др. 3 | 4 месяца | 6 месяцев | 10 месяцев | Предварительная фильтрация | Н/Д | Н/Д |
| Борхес и др. 4 | 6 месяцев | 6 месяцев | 12 месяцев | Предварительная фильтрация | Н/Д | AB дикого типа |
| Коллимор и др. 5 | В возрасте | 3 месяца | < 6 месяцев | Предварительная фильтрация | Н/Д | Н/Д |
| Гейслер и др. 6 | 4 месяца | 4 месяца | 8 месяцев | Pre и post Фильтрация |
Н/Д | AB дикого типа |
| Лю и др. 7 | 3 месяца | 1-6 месяцев | 4-9 месяцев | Pre и post Фильтрация |
Н/Д | Дикого типа |
| Мартинс и др. 8 | 3 месяца | 3 месяца | 6 месяцев | Предварительная фильтрация | Н/Д | Дикого типа |
| Mocho9 | < 6 месяцев, 6 - 12 месяцев, > 18 месяцев |
4 месяца | 7 - 24 месяца | Предварительная фильтрация | 1 женщины и 1 кобель каждой возрастной группы |
AB дикого типа |
| Мюррей и др. 10 | 3-4 месяца | 3 месяца, 6 месяцев, 1 год | 7, 10 и 16 месяцев |
Pre и post Фильтрация |
Н/Д | AB дикого типа |
Таблица 1: сравнение контрольных параметров в зал данио рерио. Дозорный рыбы может быть выбран согласно их возраста, пола или деформации. Они подвергаются на определенный период, и они получают системы до или после фильтрации воды. Данные компилируются с 2016 года Специальный выпуск на здоровье данио рерио журнал3,4,5,6,,78,9, 10.
Discussion
Ограничения методов, важнейшие шаги и устранение неполадок:
Возраст, пол, штамм и продолжительности воздействия часовые не стандартизированы. Это показано в таблице 1. Существует очень мало скрининг рыбы ниже 6 месяцев возраст, или возрасте рыбы. Там могут быть некоторые патогены, которые затрагивают молодых рыб, как есть некоторые патогены, которые являются более распространенными в19,10,18,старых населения20. Аналогичным образом пол не рассматривается в выборе некоторых дозорных групп, несмотря на некоторые сообщают, что дискриминации по признаку пола для некоторых патогенов21. Предлагаемый метод пытается решать эти вопросы, хотя выбор штамма может производиться согласно конкретного патогена для мониторинга. Например ту может помочь в обнаружении Mycobacterium spp.12,22, но есть риск, что часовые затем будет выступать в качестве резервуара или отображения клинических признаков. Относительно продолжительности облучения подход данио рерио Международный ресурсный центр10 увеличивает шансы обнаружения патогенов, которые могут быть пропущены с периодом неадекватной загрязнения. Необходимость длительного воздействия подразумевает, что стражи не легко доступны. Добавление экологических проб позволяет некоторую гибкость и умножения отбора событий. Например выборка может иметь место каждый месяц с интервалом в 4 месяца между каждого метода скрининга. Это может сократить промежуток времени до обнаружения новых патогенов.
Методы экологической проверки полагаются на обнаружение патогенных микроорганизмов в окружающей среде. Возбудители пролить рыбы и поэтому разводят в воде системы. Не была изучена возможность захвата патогенов путем фильтрации воды23 . Методы, которые мы опишем эффективны только если патогенов получили достаточно времени для умножения в рыбе и биопленки достичь порога загрязнения, позволяя обнаружения. Это ограничение методов сводится к минимуму критический выбор участков отбора проб: выборку шлама в резервуаре вместо отстойник ила, и вода и биопленки отбираются на поверхности поддона, а не в танк или после фильтрации. Тем не менее все образцы из той же системы вряд ли дают одинаковые результаты. Положительные результаты для P. tomentosa может быть подтверждена с помощью другой пробирного (гистопатология, ПЦР или анализ шлама). Микобактериальной положительные результаты ПЦР может быть подтверждена культуры или другой диагностической лабораторией. Однако при установлении состояния здоровья, далее образцы рекомендуется для подтверждения отрицательные результаты из любой экологической Скрининг технике.
Значение метода в отношении существующих/альтернативные методы:
Микобактерии spp. широко распространены в окружающей среде, и их присутствие в картере не предсказать их патогенности12. Mocho9 показал, что мониторинг смертности является ключом для обследования события вопросов здравоохранения. Использование животных образцы по-прежнему необходимы для любого райграса. Мониторинг состояния означает обнаружение всех распространенных возбудителей в объекте и это не может быть достигнуто с единственной использование методов экологического скрининга. Тем не менее отсутствие чувствительности средств диагностики может задержать или предотвратить точное описание состояния здоровья. Хотя использование часовые уменьшает количество рыбы, необходимых для выявления распространенных микробом в населения, отсутствие чувствительности добавляет вес с использованием комбинации методов, в том числе экологического скрининга5,23. Действительно конкретного возбудителя свободного статуса обычно определяется как отсутствие вида на объекте таким образом, что проб окружающей среды и животных необходимо проверить негативные24,25.
Результаты тампоном поддон для выявления микобактерий spp. показывают, что опираясь на рыбу, которую образцы могут привести к ложным отрицательный здоровья. 6 протестированных микобактериальной видов описаны как патогенных или потенциал патогенных данио рерио15 и некоторые не быть устранены путем дезинфекции поверхности яйца с хлора26 как регулярно выступал в карантин. Таким образом ложный отрицательный результат может иметь определенные последствия для сотрудников, которые импортируют линии. Например м. fortuitum была упущена методом ПЦР на образце рыбы, но более половины Картера мазок ПЦР обнаруженные. Учитывая, что эти микобактерий более устойчивы к воздействию хлора, чем другие и их способности расти в систем водоснабжения27, это риск для незагрязненные импорта объекта. Чтобы разрешить импорт линий, руководители должны доверять и сравнить отчеты здоровья экспорт объекта с их. Программа оценки производительности ICLAS28 является ключом к этому процессу в грызунов. RESAMA сети сообщает об обнаружении м. gordonae и м. mucogenicum в французском D. рерио11. Эти микобактерии не предлагается в панели коммерческих лабораторий, которые мы используем. Было бы полезно расширить программу ICLAS и согласовать диагностических анализов, а также перечень патогенных видов29.
A. hydrophila является также возбудителя, который имеет потенциал, чтобы вводиться при ввозе животных, хотя его восприимчивость к хлора30 делает ее ликвидации чаще во время рутинной яйцо поверхности дезинфекции. Картер, тампоном и шлама результаты показывают, что экологические скрининг может использоваться для обнаружения этого патогена. Другие бактерии, как Mycobacterium spp. были обнаружены в осадок ПЦР23. Этот тип образца особенно важна, поскольку она позволяет обнаруживать возбудителей сарай. Например еще одно новое применение является анализ шлама на экран импорта рыбы в карантин для P. tomentosa. Паразит представляет собой угрозу для животного здоровья13 и неоплазия модели16. Кроме того концентрации хлора, используемые в обычных данио рерио яйцо поверхности дезинфекции не являются эффективным31. Таким образом способность экрана импортных животных с оборачиваемостью одной недели и без каких-либо эвтаназии рыбы кажется очень привлекательным. Эта техника может влиять правила карантина и биозащищенности, позволяя очередности импорта. Согласно распространенной патогенов в объекте экспортеров, обнаруженных патогенов в образцах из импортированного рыбы и риск ущерба для состояния здоровья импорта объекта10затем предназначен процесс принятия решений.
Будущих приложений или направления после усвоения этих методов:
Даже если лечение обычной карантина является выбранный вариант, эффективность таких лекарств32,33,34,,3536 можно оценить с анализ шлама устройства размножения. В целом, экологической проверки могут использоваться для проверки соединения против бактерий и паразитов искоренения, в том числе в биотоп рыбы. Еще одно применение нише экологической проверки является мониторинг населения возбудителя в живых канал3837,. Хотя основное применение этих методов как ценное дополнение к диагноз инструментов для мониторинга в zebrafish услуги здравоохранения. Благодаря более точной, стоимость и время эффективное определение состояния здоровья, Картер тампоны и шлама анализа дополняют дозорного эпидемиологического надзора и практики рутинной карантина. Действительно будущее этих методов должно быть рутинной частью любой водной лаборатории здравоохранения доклад.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить команду БРФ Aquatics Фрэнсис Крик Института за их техническую помощь и критических ввода. Эта работа была поддержана института Фрэнсис Крик, который получает его основного финансирования исследований рака Великобритании (FC001999), Совет по медицинским исследованиям Великобритании (FC001999) и Уэллком траст (FC001999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
| Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
| BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
| Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
| Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
| Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
| Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
| 50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
| In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |
References
- Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
- Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
- Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
- Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
- Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
- Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
- Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
- Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
- Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
- Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
- Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
- Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
- Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
- Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
- Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R.
- Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
- Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
- Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
- Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
- Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
- Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
- Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
- Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
- Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
- Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
- Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
- Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
- Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
- Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
- Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
- Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
- Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
- Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
- Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
- Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
- Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
- Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
- Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).
