Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Miljøscreening af Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa i zebrafisk systemer

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/55306
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biological Research Facility, The Francis Crick Institute

Summary

Denne protokol beskriver brugen af sump svaberprøver og slam analyse af zebrafisk systemer, hvilket fører til øget påvisning i forhold til den eneste brug af sentinels at opdage patogener som Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa. Det foreslås også et system til at overvåge P. tomentosa æggene i karantæne.

Abstract

Sundhed overvågningssystemer er udviklet og anvendes i zebrafisk forskningsfaciliteter, fordi patogener af Danio rerio Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa har potentiale til at forringe dyrenes velfærd og forskning. Fiskene er typisk analyseret efter slagtning til at opdage mikrober. Brugen af sentinels er foreslåede måde at forbedre følsomheden af overvågning og at reducere antallet af dyr for smagsløgene. Indstilling af en pre filtrering sentinel tank ud af en recirkulerende system er beskrevet. Teknikken er udviklet til at forhindre vandforurening og til at repræsentere befolkningens fisk af en omhyggelig udvælgelse af alder, køn og stammer. Bruge Mindsteantallet af dyr, er teknikker til at screene for miljøet også detaljeret. Polymerase Chain Reaction (PCR) på overfladen sump svaberprøver bruges til at forbedre afsløring af nogle udbredt og patogene mykobakterielle arter som Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumog Mycobacterium chelonae. En anden miljømæssig metode består af behandling af slam på bunden af en holdingtank eller sump hen til kigge efter P. tomentosa æg. Dette er en hurtig og billig teknik, der kan anvendes i karantæne, hvor en avl enhed er neddykket i holdingtank af importerede dyr. Endelig, PCR anvendes til slam prøven og A. hydrophila er fundet på sumpen bund og overflade. Generelt, disse miljømæssige screening teknikker anvendes til disse specifikke patogener har ført til en øget følsomhed i forhold til afprøvning af Pre filtrering sentinels.

Introduction

For at beskytte forskning og dyrevelfærd1,2, overvåges tilstedeværelsen af patogener inden for animalsk faciliteter. For zebrafisk, sundhedsovervågning,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ofte beror på dyr analyseret slagtningen af histopatologi, bakteriologi kultur eller molekylære metoder. Test kun koloni dyr er ikke den anbefalede metode på grund af antallet af fisk og dermed forbundne udgifter, der ville være forpligtet til at registrere patogener af lav prævalens. Derfor er den foretrukne metode til at afsløre en lille gruppe af dyr til en højere belastning af forurenende stoffer. Disse fisk kaldes før filtrering sentinels. Denne udsættelse varer for måneder og det indebærer en stigning i den animalske omsorgsgiver arbejdsbyrde og/eller nogle specialbyggede engineering løsning. En anden udfordring er screening af importerede linjer i karantæne hvor de frugtbare dyr skal holdes i live og dette er ikke kompatibel med rutinemæssig assays på slagtekroppe.

Her beskriver vi nogle metoder til at opdage visse zebrafisk patogener (A. hydrophila, Mycobacterium spp., og P. tomentosa) ved screening af akvatiske systemmiljø. Målet er at reducere antallet af fisk, der anvendes til sundhedsovervågning af og optimering af omsætning, omkostninger og følsomheden af påvisning. Sådanne metoder er et alternativ til brugen af dyr og nogle teknikker kan anvendes til screening import i karantæne. For eksempel, Mocho9 var i stand til at identificere flere patogene mykobakterielle arter ved at udføre PCR på sump svaberprøver frem for zebrafisk (herunder sentinels), og dette blev opnået med færre prøver. I den samme undersøgelse, P. tomentosa æg blev opdaget med større følsomhed af screening tank slam ved hjælp af flotation og mikroskopi i stedet for at teste fisk af PCR og histopatologi.

Tabel 1 er en oversigt over de forskellige karakteristika af sentinel programmer3,4,5,6,7,8,9,10 bruges af en række zebrafisk faciliteter. Efter filtrering sentinels modtager vand på samme måde som enhver koloni fisk før filtrering sentinels modtage vandet når det har rundsendt via koloni akvarier først. For eksempel kan før filtrering sentinels sættes op på recirkulerende systemet ved løbende modtager sump vand. Dette kan ikke være en mulighed, når der er mange uafhængige systemer i ét rum. I dette tilfælde kan en tank af Pre filtrering sentinels bruges til at screene hele rummet. Sentinels er i en statisk tank, til recirkulerende således, og deres vand er ændrede regelmæssigt, bruger kun Pre filtrering vand dvs, sump vand fra alle systemer i rummet. Denne teknik er beskrevet nedenfor som en baseline til sammenligning med effekten af de miljøscreening. Den foreslåede set-up er designet til at kontrollere vand kvalitetsspørgsmål som et fald i pH eller en kvælstof forureningen.

Begrebet den bakterielle miljøscreening er baseret på den hypotese, at bakterier er påviselige i biofilm som den, der fandt på sump væggen på vandoverfladen eller i slam på bunden af en tank. Sump synes en ideel indsamlingspunkt i en recirkulerende akvakultur system da det indsamler affald (vand, afføring, foder og andet organisk materiale) fra alle tanke før filtrering. Overfladen af sumpen er ofte nemt nås, af svaberprøven er hurtig, og det kan udføres under aseptiske forhold for at undgå kontaminering af prøven (fra handsker for eksempel). Begrebet bruges til at identificere fremherskende patogene Mycobacterium spp. i zebrafisk systemer9,12. Teknikken er beskrevet nedenfor og vi også rapporterer påvisning af A. hydrophila i zebrafisk sump overflade svaberprøver og slam.

Miljøscreening for parasit æg er baseret på påvisning af Murray et al. 13 og flotation teknik anvendes rutinemæssigt til parasitologi og mikroskopiske screening af parasit æg i afføring14. Mocho9 foreslås en alternativ til prøvetagning proces og viste, at teknikken kan bruges til at registrere andre arter af fisk biotop. Inficerede D. rerio passere P. tomentosa æg med deres afføring og parasit æg forblive i bunden af tank, i slammet. De kan der være indsamlet på grund af deres tæthed bliver større end vand. Tætheden af æggene bruges til at behandle den miljømæssige prøve også. En første flotation med centrifugering adskiller vand og lys snavs fra tungere sag. En anden centrifugering afhængig mættet sukkeropløsning (med en massefylde større end tætheden af P. tomentosa æg) for at give mulighed for parasit-æg at dukke op på overfladen af glasset.

Screening for bakterier i biofilm og P. tomentosa fra bunden af tanken kan kombineres ved at udføre PCR for alle disse patogener på slam prøve sediment fremstillet efter den første centrifugering. Dette optimerer Prøvetagningstiden. Metoden, der er beskrevet nedenfor. Vi foreslår også at anvende disse teknikker i forbindelse med karantæne. Gennemgå importerede voksen zebrafisk, som skal holdes i live, er en avl enheden indsat til karantæne tank. Efter en uge, er afføring og andre affaldsmaterialer i avl enhed indsamlet og screenes ved mikroskopi eller PCR. Teknikken er beskrevet nedenfor og nogle P. tomentosa æg var blevet opdaget ved mikroskopi i denne sammenhæng.

Protocol

1. eksponering af Pre filtrering Sentinels ud af en recirkulerende System

  1. Angive en ren 8 L tank ud af en recirkulerende system. Fylde det op med vand, der kommer fra samleroer. Tilføj 2 keramiske perler eller svamp terninger af bio-medierne fra systemerne til skærmen (figur 1). Tilføje 1-2 D.rerio/l (dvs., 12 fisk). Bruge vildtype fisk af den dominerende genetiske baggrund i anlægget, for eksempel AB.
    1. Vælg mindst 6 fisk som følger: mindst en kvindelig og en mandlig under 6 måneder i alder, en kvindelig og en mandlig mellem 6 og 18 måneder, og en kvindelig og en mandlig over 18 måneder.
  2. Fodre en gang om dagen. Variere kostvaner (fx, tørre kost, artemia) for at sikre sentinels er udsat for alle de diæter, der anvendes i zebrafisk facilitet. Ændre vand på mandag, onsdag og fredag, dvs., tre gange om ugen i 4 måneder.
    1. At foretage ændring af vand, overførsel sentinels og bio-medierne ind i en midlertidig tank. Tøm helt sentinel tank og renses. Refill sentinel tank med sump vand kun. Sætte sentinels og bio-medie tilbage.
  3. Udsætte sentinels for 4 måneder til sump vand. Aflive fisken en godkendt metode som nedsænkning i en overdosis løsning af 2-phenoxyethanol (3 mL/L).
  4. For at bekræfte død, vent i 10 min efter ophør af opercula bevægelse.
    1. Få fat i den døde krop med pincet og fryse det helt ved-80 ° C i en identificeret container. Dette vil blive brugt til PCR12,15.
    2. Alternativt, skær tailat den halestilk, nick bugvæggen, og der i 4% formalin.
      Forsigtig: Brug handsker og fume skab til histopatologisk undersøgelse. Etiketten på prøvebeholder.

2. sump svaberprøver

  1. Bruge en steril tør vatpind med en plastik skaft. Bære handsker. Find overflade til vatpind (sump væg på overfladen af vandet) og fjerne ethvert element, der forhindrer let adgang til overfladen. Vælg en sump overflade med lav flow.
  2. Unsheathe svaber ved at fjerne den ydre emballage og udsætte sterile bomuld tip til luften. Undgå krydskontaminering af svaber af pas på ikke at røre uprøvet overflader.
    1. Svaber sump væggen over 5-10 cm til at absorbere vand og biofilm på niveauet sump vand overfladen.
    2. Jakke vatpind tilbage eller bryde aflæsse i en steril centrifugerør. Mærke prøven og sende til PCR test eller fryse ved-80 ° C.

3. påvisning af P. tomentosa æg i bunden af en Tank

  1. Slam analyse af mikroskopi
    1. Bruge en 60 mL sprøjte9 til Aspirér slam på bunden af en sump eller enhver tank holder fisk, herunder sentinels. Opdele prøven i 15 mL rør. Luk rør med deres skrue toppe og mærke rør.
    2. Forberede en mættet sukkeropløsning (vægtfylde = 1,27) ved at blande 227 g melis i 177 mL varmt vand med en magnetomrører14.
    3. Der centrifugeres i 15 mL rør på 175-250 x g i 10 min. i en centrifuge med swing spande. Dekanteres rør og holde sedimentet i deres rør.
    4. Fylde rør halvvejs med en mættet sukkeropløsning. Luk rør med deres skrue toppen og blandes grundigt sedimentet med løsningen.
    5. Sted rør i centrifuge swing spande og fylde dem med mættet sukkeropløsning til toppen. Indstille et cover glas forsigtigt på toppen af hver tube og i kontakt med en mættet sukkeropløsning.
    6. Der centrifugeres ved 175-250 x g i 10 min. Bemærk at nogle cover glas kan falde og bryde under centrifugering derfor der er 4 rør for hver 60 mL prøve. Løft dækslet glas og sæt den på et glas dias. Label diaset med en blyant eller markør pen.
      1. I tilfælde af for mange dækker glasset beskadigelser forekomme, fylde det meste af røret med mættet sukkeropløsning, centrifugeres ved 175-250 x g i 10 min., fylde op til toppen med en mættet sukkeropløsning, så forsigtigt sat dækslet glas. Vent i 30 min.
    7. Kigge efter P. tomentosa æg med mikroskop13 (figur 2 og Video 1). Identificere de bipolare stik på forstørrelse 400 X6.
      Bemærk: Størrelsen af æggene er 57-78 µm lange og 27-39 µm diameter16,17. Bemærk, at en positiv dias er nok til 60 mL prøven erklæres positive.
  2. Screening importerede dyr i karantæne for P. tomentosa æg
    1. Der er mandlige og kvindelige D. rerio i en tank. Tilføje til tanken en enhed, der normalt bruges til at høste og bevare opfostrede æg men bruge det her til at indsamle afføring (figur 3).
      Bemærk: For eksempel, en fuld 1 L avl tank (ydre tank og indre tank med revet bunden) er helt nedsænket i en 13 L tank, giver gratis adgang til fisk til at flytte ind og ud af avl enhed.
    2. Fjern enheden avl efter en uge og høst af indsamlede slam i avl enhed som beskrevet i trin 3.1 "slam analyse af mikroskopi."

4. PCR på slam Sediment

  1. Opsug slam på bunden af en tank eller sump med en 60 mL sprøjte9 og overføre prøven til et 60 mL tube. Luk røret med sin skrue-top og etiket røret. Bortskaffe sprøjten.
  2. Ryst 60 mL tube og 15 mL overføres til en 15 mL tube. Luk røret med sin skrue-top og etiket røret.
  3. Der centrifugeres i 15 mL tube på 175-250 x g i 10 min. i en centrifuge med swing spande. Dekanteres rør og holde sedimentet i røret.
  4. Unsheathe en vatpind ved at fjerne den ydre emballage og udsætte sterile bomuld tip til luften. Undgå krydskontaminering af svaber af pas på ikke at røre uprøvet overflader.
    1. Svaber sedimentet i røret til 15 s.
    2. Jakke vatpind tilbage eller bryde aflæsse i en steril centrifugerør. Etiket prøven, fryse ved-80 ° C og sende til PCR test.
      Bemærk: 45 mL forbliver i 60 mL reagensglas. Dette kan opbevares til påvisning af P. tomentosa æg af slam analyse af mikroskopi som beskrevet i trin 3.1, for eksempel, at bekræfte PCR-resultat. PCR i slammet kan blive retsforfulgt for screening importerede dyr efter trin 3.2.

Representative Results

Fordelene ved sump podninger at identificere fremherskende Mycobacterium spp. i forhold til fisk prøver understøttes af resultaterne i figur 4. 115 fisk testet, M. chelonae og M. haemophilum blev opdaget i 5% og 3% af prøverne, henholdsvis. Ingen andre patogene mykobakterielle arter blev identificeret. Fra de samme systemer afslørede 49 sump svaberprøver tilstedeværelsen af 5 mykobakterielle arter. Oddsratio beregnes med den hypotese, at M. chelonae og M. fortuitum påvises hyppigere af PCR i overfladen sump svaberprøver end i eksemplet fisk. Dette er statistisk signifikant med respektive oddsratio af 11 (95% CI: 4 til 29; p < 0,0001) og 306 (95% CI: 18 til 5208; p = 0,0001). Resultaterne viser, at overfladen sump svabermetoden er et værdifuldt alternativ til udelukkende brug af sentinels til skærmen zebrafisk facilitet for Mycobacterium spp. De miljømæssige prøver blev også anvendt til at screene for A. hydrophila. Disse bakterier blev opdaget i fisk, slam og overflade prøver (figur 4). Dette understøtter også de foreslåede teknikker evne til at screene fisk biotop.

Med hensyn til slam analyse at opdage P. tomentosa æg, opdaget Mocho9 parasitten i 27% af fisk prøverne af PCR og histopatologi mens æggene blev opdaget i 93% af analyseret slam fra det samme system. Her, blev teknikken udfordret til at reproducere karantæne screening. I denne sammenhæng, importerede dyr ikke kan udtages, og vurdere deres sundhedsstatus i tide hjælper med biosikkerhedsforanstaltninger forvaltning. Fisk med ukendt sundhedsstatus fra et P. tomentosa positive facilitet blev sat i 8 tanke med avl enheder: maksimalt 16 fisk/13 L tank, 7 transgene og 1 vildtype linje, blandet køn, i alderen 4-24 måneder. Slammet var høstet fra enhederne efter en uge og analyseret ved mikroskopi. P. tomentosa æg blev set i 7 (88%) prøver. Endelig var PCR påvisning af parasitten trialed på sump svaberprøver og slam sedimenter. 4 ud af 6 slam stikprøverne var PCR positive og alle resultaterne var negative for overflade podninger. Dette er ikke overraskende, da slam screening er afhængig af æggene evne til at falde til bunden af tanken. Dette viser, at slam analyseteknikker kan bruges til at screene D. rerio akvarier for P. tomentosa angreb og at metoderne, der kan tilpasses til screening af importerede dyr.

Figure 1
Figur 1: før filtrering sentinel tank recirkulerende systemets. En 8 L tank er fyldt med vand og bio-medie fra samleroer systemer til skærmen. To hvide keramiske bio-medierne perlerne sidder i bunden af tank (i midten af billedet). 12 fisk er udvalgt efter deres alder, stamme og køn, og de føjes til sentinel tank. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: P. tomentosa æg fundet under slam analyse af mikroskopi. Forstørrelse anvendes var 400 X. Pilene angiver de bipolare stik. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: avl enhed neddykket i et akvarium på bedriften til at indsamle slam for analyse. Denne tank er indstillet på en bænk med henblik på billedet; Det ligger ellers i recirkulerende systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Procentdel af identifikation af Mycobacterium spp., A. hydrophilaog P. tomentosa ved PCR på fisk, flade sump svaberprøver og sump slam. Procentdel er opnået ved at dividere antallet af positive resultater for hver patogen arter med antallet af testede prøver. Procentdelen af positive resultater er givet af prøvetypen som fisk, overflade eller slam og angivet efter bakteriernes navn. 115 fisk og 49 overflade sump svaberprøver blev testet ved PCR for identifikation af Mycobacterium spp. Dataene er kompileret med Mocho's9 resultater, da det er en udvidelse af denne undersøgelse. Fisken er hovedsagelig før filtrering sentinels ifølge protokollen afsnit 1. Sjældent, når sentinels ikke var tilgængelige, undslupne og gamle koloni fisk (> 18 måneder) blev udtaget. Alle testede systemer til Mycobacterium spp. blev testet på fisk og sump svaberprøver. Oddsratio beregnes med den hypotese, at M. chelonae og M. fortuitum påvises hyppigere af PCR i overfladen sump svaberprøver end i eksemplet fisk. Dette er statistisk signifikant med respektive oddsratio af 11 (95% CI: 4 til 29; p < 0,0001) og 306 (95% CI: 18 til 5208; p = 0,0001). Mycobacterium marinum PCR var negativ for alle prøverne og det er derfor anses for fraværende fra disse faciliteter og ikke medtaget i analysen. 12 fisk, 14 overflade sump svaberprøver og 6 sump slam blev testet ved PCR for tilstedeværelsen af A. hydrophila. 6 samleroer blev testet for tilstedeværelsen af P. tomentosa på overfladen og i slammet. PCR = Polymerase kædereaktion. CI = konfidensinterval. * og ** angiver Statistisk signifikans; andre sammenligninger var ikke statistisk signifikant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: Scanning for et æg af P. tomentosa med mikroskop. Diaset er fremstillet af slam analyse som beskrevet i trin 3.1. Feltet er scannet for at registrere et æg af P. tomentosa. Når en struktur er anerkendt, er det zoomede ind for at bekræfte identifikation ved højere opløsning. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Forfatterne Alder ved starten af eksponering Længden af eksponering Prøveudtagning alder Pre eller Post
filtrering		 Køn Stammen eller stammerne
Barton et al. 3 4 måneder 6 måneder 10 måneder Før filtrering NIELSEN NIELSEN
Borges et al. 4 6 måneder 6 måneder 12 måneder Før filtrering NIELSEN AB vildtype
Collymore et al. 5 Så unge som muligt 3 måneder < 6 måneder Før filtrering NIELSEN NIELSEN
Geisler et al. 6 4 måneder 4 måneder 8 måneder Pre og post
filtrering		 NIELSEN AB vildtype
Liu et al. 7 3 måneder 1-6 måneder 4-9 måneder Pre og post
filtrering		 NIELSEN Vildtype
Martins et al. 8 3 måneder 3 måneder 6 måneder Før filtrering NIELSEN Vildtype
Mocho9 < 6 måneder,
6 - 12 måneder,
> 18 måneder		 4 måneder 7 - 24 måneder Før filtrering 1 kvinde og
1 mand af
hver aldersgruppe.		 AB vildtype
Murray et al. 10 3-4 måneder 3 måneder, 6 måneder, 1 år 7, 10 og 16
måneder		 Pre og post
filtrering		 NIELSEN AB vildtype

Tabel 1: sammenligning af sentinel indstillinger i zebrafisk faciliteter. Sentinel fisk kan blive udvalgt efter deres alder, køn eller stamme. De er udsat for en bestemt periode og de modtager før eller efter filtrering system vand. Data er indsamlet fra 2016 særnummer om sundhed af zebrafisk journal3,4,5,6,7,8,9, 10.

Discussion

Begrænsninger af teknikkerne, kritiske faser, og fejlfinding:

Alder, køn, stamme og varigheden af eksponering af Sentinel-missionerne er ikke standardiseret. Dette er vist i tabel 1. Der er meget lidt screening af fisk under 6 måneder i alder eller ældre fisk. Der kan være nogle patogener, der påvirker de unge fisk, som der er nogle patogener, der er mere udbredt i den ældre befolkning10,18,19,20. Køn betragtes på samme måde, ikke i udvælgelsen af visse sentinel grupper trods nogle rapport, at der er en kønsskævhed for nogle patogener21. Den foreslåede teknik forsøger at løse disse problemer, selv om valget af stammen kunne foretages efter en specifik pathogen at overvåge. For eksempel, TU kunne hjælpe med påvisning af Mycobacterium spp.12,22, men der er en risiko for, at sentinels vil derefter fungere som et reservoir eller viser kliniske tegn. Vedrørende længden af eksponering øger tilgang af zebrafisk International Resource Center10 chancerne for at opdage patogener, som kunne være gået glip af med en utilstrækkelig forurening periode. Behovet for længerevarende eksponering indebærer, at Sentinel ikke er let tilgængelige. Tilføjelsen af de miljøprøver tillader nogle fleksibilitet og multiplikation af hændelserne screening. For eksempel, kan prøveudtagning finde sted hver anden måned med en 4 måneders interval mellem hver screeningsmetode. Dette kan reducere bortfalder om tid, før en nyligt indførte patogen er opdaget.

Miljøscreening teknikker stole på påvisning af patogener i miljøet. Patogener er udgydt af fisken og derfor fortyndet i vand system. Muligheden for indfange patogener af vandfiltrering23 blev ikke udforsket. De metoder vi beskrive er kun effektiv, hvis patogener får tilstrækkelig tid til at formere sig i fisk og biofilm at nå en grænseværdi for kontaminering giver mulighed for påvisning. Denne begrænsning af teknikkerne, der er minimeret ved en kritisk udvælgelsen af stikprøver websteder: slam i tanken er i stedet for sump slam, og vand og biofilm er stikprøven på overfladen af sumpen og ikke i en tank eller efter filtrering. Alle prøver fra det samme system er imidlertid usandsynligt, at give de samme resultater. Positive resultater for P. tomentosa kan bekræftes ved hjælp af en anden assay (histopatologi, PCR eller slam analyse). Mykobakterielle PCR positive resultater kan bekræftes af kultur eller en anden diagnostisk laboratorium. Når der etableres en sundhedsstatus, yderligere anbefales prøver dog at bekræfte negative resultater fra nogen miljøscreening teknik.

Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:

Mycobacterium spp. er almindelige i miljøet og deres tilstedeværelse i sumpen forudsige ikke deres patogenicitet12. Mocho9 viste, at overvågningen dødelighed er nøglen til at kortlægge udviklingen af sundhedsspørgsmål. Brug af animalsk prøver er fortsat afgørende for enhver veterinær undersøgelse. Sundhedsovervågning indebærer påvisning af alle udbredte patogener i en facilitet, og dette kan ikke opnås ved udelukkende brug af miljømæssige screening teknikker. Ikke desto mindre kan en manglende forståelse af diagnose værktøjer forsinke eller forhindre en nøjagtig beskrivelse af sundhedsstatus. Mens brugen af sentinels reducerer antallet af fisk, der kræves til at opdage en udbredt mikrobe i befolkningen, tilføjer manglen på følsomhed vægt ved hjælp af en kombination af metoder, herunder miljøscreening5,23. Faktisk er den specifikke patogen gratis status normalt defineret som fravær af en art i anlægget således, at miljø og dyrs prøver skal teste negativ24,25.

Sump vatpind resultater at identificere Mycobacterium spp. viser, at påberåbe sig fisk prøver kan føre til en falsk negative sundhedsmæssige status. 6 testet mykobakterielle arter er beskrevet som patogene eller potentielle patogene i zebrafisk15 og nogle ville ikke blive fjernet af æg overflade desinfektion med klor26 som rutinemæssigt udføres i karantæne. Derfor, den falske negative kan få nogle konsekvenser for samarbejdspartnere, der importerer linjer. For eksempel, M. fortuitum var savnet ved PCR på fisk prøve men mere end halvdelen af sump vatpinden PCR opdaget sig. I betragtning af at disse mykobakterier er mere modstandsdygtige over for klor end andre og deres evne til at vokse i vandsystemer27, er det en risiko for ikke-forurenet import faciliteten. For at tillade import af linjer, skal ledere stole og sammenligne sundhedsrapporter af det eksporterende facilitet med deres. ICLAS ydeevne evaluering Program28 er nøglen til denne proces i gnavere. RESAMA netværk rapporter påvisning af M. gordonae og M. mucogenicum i fransk D. rerio11. Disse mykobakterier er ikke foreslået i paneler af de kommercielle laboratorier, som vi bruger. Det ville være nyttigt at udvide programmet ICLAS og harmonisere de diagnostiske assays samt listen over patogene arter29.

A. hydrophila er også et patogen, der har potentiale til at blive indført ved import af dyr, selv om dens følsomhed over for klor30 gør dens afskaffelse mere sandsynligt under rutinemæssige æg overflade desinfektion. Sump, svaber og Slam resultater viser, at miljøscreening kan anvendes til at påvise dette patogen. Andre bakterier som Mycobacterium spp. er blevet påvist i slammet af PCR23. Denne type prøve er særlig relevant, da det giver mulighed for påvisning af skur patogener. For eksempel, er en anden ny ansøgning slam analyse til at screene importerede fisk i karantæne for P. tomentosa. Parasitten er en trussel mod dyrets sundhed13 og neoplasi modeller16. Derudover er klor koncentrationerne anvendes i rutinemæssige zebrafisk æg overflade desinfektion ikke effektiv31. Derfor, evnen til at screene de importerede dyr med en uges omsætning og uden nogen fisk eutanasi synes meget attraktiv. Denne teknik kan påvirke karantæne og biosikkerhedsforanstaltninger reglerne ved at tillade en triage af importen. En beslutningsproces er derefter designet efter de fremherskende patogener i det eksporterende facilitet, de fundne patogener i prøver fra den importerede fisk og risiko for at kompromittere den importerende facilitet10sundhedstilstand.

Fremtidige ansøgninger eller retninger efter beherske disse teknikker:

Selv om rutinemæssig karantæne behandling er den valgte løsning, kan effekten af sådan medicin32,33,34,35,36 vurderes med avl enhed slam analyse. Mere generelt den miljøscreening kunne bruges til at teste forbindelser mod bakterier og parasit udryddelse, herunder i fisk biotop. En anden niche anvendelse af miljømæssig screening er at overvåge befolkningens patogen i live feed37,38. Selv om den vigtigste anvendelse af disse teknikker er som et værdifuldt supplement til diagnosticering værktøjskassen for sundhedsovervågning i zebrafisk faciliteter. Takket være en mere præcis, omkostninger og tid effektiv definition af sundhedsstatus, sump svaberprøver og slam analyse er komplementær til sentinel overvågning og rutinemæssig karantæne praksis. Faktisk er fremtiden for disse teknikker at være en rutinemæssig del af enhver akvatiske laboratorium sundhedsrapport.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke kvalitet Aquatics team af Francis Crick Institut for deres tekniske hjælp og kritiske input. Dette arbejde blev støttet af Francis Crick Institute, som modtager sin basisfinansiering fra Cancer Research UK (FC001999), det britiske Medical Research Council (FC001999) og the Wellcome Trust (FC001999).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua-Sed 250 mL Vetark 2-phenoxyethanol
Tubed Sterile Dryswab Tip mwe MW100 Sump surface
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric Becton
Dickinson		 300866 They are actually
graduated to 60 ml
Centrifuge tube 15 mL Corning Corning 430766
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) Sanyo MSB020.CX1.5
Cover Glass 22 mm x22 mm Menzel-Glaser MNJ-350-020H
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific F155CA Swab sediment from sludge
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap Corning 430921
In-Tank Spawning Tray Set MBK Installations Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
  2. Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
  3. Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
  4. Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
  5. Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
  6. Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
  7. Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
  8. Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
  9. Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
  10. Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
  11. Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
  12. Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
  13. Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
  14. Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
  15. Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R. Mycobacteriosis in zebrafish colonies. ILAR J. 53 (2), 95-105 (2012).
  16. Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
  17. Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
  18. Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
  19. Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
  20. Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
  21. Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
  22. Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
  23. Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
  24. Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
  25. Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
  26. Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
  27. Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
  28. Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
  29. Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
  30. Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
  31. Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
  32. Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
  33. Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
  34. Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
  35. Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
  36. Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
  37. Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
  38. Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).

Tags

Mikrobiologi spørgsmålet 130 miljøscreening Aeromonas hydrophila Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa zebrafisk Danio rerio sundhedsovervågning biofilm slam karantæne fisk vand Mikrobiologi
Miljøscreening af <em>Aeromonas hydrophila</em>, <em>Mycobacterium</em> spp. og <em>Pseudocapillaria tomentosa</em> i zebrafisk systemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mocho, J. P., Martin, D. J.,… More

Mocho, J. P., Martin, D. J., Millington, M. E., Saavedra Torres, Y. Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems. J. Vis. Exp. (130), e55306, doi:10.3791/55306 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter