Het artikel beschrijft een methode die de doorvoer vergroot, terwijl de inspanningen en nauwkeurigheid voor de extractie van lipiden uit de celmembranen van micro-organismen worden gecompenseerd voor gebruik bij het karakteriseren van beide totale lipiden en de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de microbiële structuur van de bodem te bepalen in studies met veel monsters.
Microbiële gemeenschappen zijn belangrijke bestuurders en regelgevers van ecosysteemprocessen. Om te begrijpen hoe het beheer van ecosystemen microbiële gemeenschappen kan beïnvloeden, is een analyse van fosfolipide vetzuur (PLFA) een relatief precieze, maar inspannende intensieve techniek om microbiële samenleving te analyseren. PLFA is ontwikkeld om fosfolipide biomarkers te analyseren, die kan worden gebruikt als indicatoren van microbiële biomassa en de samenstelling van de brede functionele groepen schimmels en bacteriën. Het is meestal gebruikt om grondsoorten te vergelijken onder alternatieve plantengemeenschappen, ecologie en beheersregimes. De PLFA-methode blijkt gevoelig te zijn voor het opsporen van verschuivingen in de microbiële gemeenschapssamenstelling.
Een alternatieve methode, extractie en analyse van vetzuurmethylester (MIDI-FA) werd ontwikkeld voor snelle extractie van totale lipiden, zonder scheiding van de fosfolipidfractie, uit pure culturen als een microbiële identificatie techniek. Deze methode isSnel, maar is minder geschikt voor bodemmonsters omdat het een eerste stap ontbreekt die gronddeeltjes scheidt en in plaats daarvan begint met een verzepingstoestand die waarschijnlijk artefacten op de achtergrond organische stof in de bodem produceert.
Dit artikel beschrijft een methode die de doorvoer vergroot, terwijl de inspanningen en nauwkeurigheid worden gecompenseerd voor de extractie van lipiden uit de celmembranen van micro-organismen voor gebruik bij het karakteriseren van zowel totale lipiden als de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de microbiële structuur van de bodem te bepalen in studies met veel monsters. De methode combineert de nauwkeurigheid die wordt bereikt door PLFA-profilering door het opvullen en concentreren van bodemlipiden als een eerste stap, en een vermindering van de inspanning door het organisch materiaal te extraheren en te verwerken met de MIDI-FA methode als tweede stap.
Gezien de sleutelrol van micro-organismen in de voedingscyclus 1 , wijziging van plantengemeenschapssamenstelling 2 , regulering van plantproductiviteit 3 en decompositie van organische stof 4 , is het begrip van bodemmicrobiële gemeenschappen van vitaal belang om terrestrische ecosystemen te begrijpen.
Vanwege hun relatief hoge overvloed in bodem en hun chemische handtekening kunnen lipide biomarkers worden gebruikt om de dominante ecologische groepen te profileren die bodemmicrobiële gemeenschappen omvatten 5 . Door het kwantificeren van lipide biomarkers die kenmerkend zijn voor verschillende microbiële groepen, kunnen we de totale lipiden schatten en deze lipiden vervolgens scheiden in ecologisch relevante groepen, zoals Gram-positieve (Gm +) en Gram-negatieve (GM) bacteriën, arbusculaire mycorrhizale (AM) en saprotrofe Schimmels en actinomyceten 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .
Er zijn veel methoden om aspecten van microbiële gemeenschappen te karakteriseren. De PLFA-methode is een die algemeen gebruikt wordt om de basis microbiële gemeenschap structuur te begrijpen. Het is een effectieve manier om de relatieve overvloed aan microbiële groepen en totale microbiële biomassa te beoordelen. Door de snelle lipideverschakeling maakt PLFA-profilering ook relatief snelle detectie van veranderingen in de bodemmicrobiële gemeenschap mogelijk en geeft informatie die een vergelijking van de ecosysteemfunctie mogelijk maakt, bijvoorbeeld schimmel: bacterieverhoudingen om de voedingscyclus 1 , 9 , 10 te beoordelen . Echter, terwijl de PLFA-extractiemethode wordt geëerd en gerespecteerd, is het ook tijdrovend en leent het zich niet goed aan ecosysteem-schaalstudies die een groot aantal monsters van veldschaalreplicaten vereisenF "> 11 , 12 .
In tegenstelling hiermee kan de extractiemethode voor vetzuurmethylester (MIDI-FA) het mogelijk maken om snel door te voeren. Bij deze methode worden monsters gesaponeerd, geconverteerd naar FAMEs, geëxtraheerd en vervolgens geanalyseerd. De MIDI-FA methode is snel maar minder discriminerend dan PLFA, die de extractie van lipiden combineert met scheiding van verschillende lipidklasse 13 (fosfolipiden, neutrale lipiden en glycolipiden).
In dit protocol beschrijven we een methode die elementen combineert van zowel lipofilamenten als PLFA. Het maakt gebruik van extractie van lipiden met behulp van de initiële chloroform extractie stappen van de gemodificeerde Bligh en Dyer methode, en vervolgens verzeping en conversie naar FAMEs. Dit biedt een robuuste manier om microbiële gemeenschapsstructuur te detecteren, terwijl veel van het achtergrondgeluid uit niet-microbiële materialen 5 , 14 wordt uitgesloten </sup>. Deze methode is ontwikkeld om een evenwicht te vinden tussen zowel de PLFA- als MIDI-FA-protocollen, dwz de meeste nauwkeurigheid behouden terwijl de doorvoer verhoogd wordt, zodat het logistisch en economisch haalbaar is om lipiden uit grootschalige studies met veel monsters 15 te analyseren. Door de initiële extractie uit te voeren en de organische oplosbare componenten ( bijv. Lipiden) te isoleren voordat MIDI-FA wordt uitgevoerd, en dit met een zuiveringsstap afronden, biedt het protocol een evenwicht tussen snelheid en precisie.
Voor het onderzoek van meerdere monsters uit experimenten met veel replicaten en / of experimentele eenheden, kunnen onderzoekers fosfolipide vetzuuranalyse (PLFA) onvoldoende vinden in termen van tijd en materialen 25 . Met de PLFA-methode worden celmembraanfosfolipiden geëxtraheerd, gezuiverd en geïdentificeerd met gebruikmaking van de gemodificeerde Bligh en Dyer 26 tweefase waterige organische extractie. Dit wordt gevolgd door vaste fase silica chromatografie om lipiden door polariteit te scheiden en een alkalische methylering van fosfolipide vetzuren in vetzuurmethylesters. In PLFA kan profielen lipide opbrengst laag zijn maar met een zeer hoge zuiverheid. Microbiële ID introduceerde een alternatieve methode, de methyleester-methode van de vetzuur (MIDI-FA). In de MIDI-FA methode worden alle lipiden rechtstreeks geëxtraheerd uit pure culturen of grond- / sedimentmonsters 11 , 12 , 27 tot en metverzeping. Deze methode heeft een lager lipideverlies en is snel omdat het geen van de concentratie- of zuiveringsstappen van de PLFA-methode heeft. Hoewel de MIDI-FA methode snel en minder duur is, omdat het oorspronkelijk is ontworpen voor het identificeren van organismen in pure cultuur, zijn er geen initiële extractie- of zuiveringsstappen. Zo kan het lipide-achtige verbindingen omvatten die gecoëxtraheerd zijn uit bodem organisch materiaal dat de gemeenschapshandtekening 27 , 28 , 29 vervormt. Omdat deze opname ook biomassa-maatregelen kan vervormen, is MIDI-FA doorgaans alleen gebruikt om grondlipiden 13 grof kwalitatief te beschrijven.
De procedure die we hier beschrijven combineert het beste van de twee afzonderlijke extractieprocedures: 1) een extractie en concentratie van lipiden met behulp van de gemodificeerde methode Bligh and Dyer 26 , en 2) de vetzuurmethylester saPonificatie-, methylering-, extractie- en basiswasprocedure die commercieel is ontwikkeld. Deze methode is ontwikkeld om de voordelen van beide van deze protocollen te bereiken, terwijl de nadeel 15 tot een minimum wordt beperkt. Door de initiële extractie uit te voeren en de organische oplosbare componenten ( bijv. Lipiden) te isoleren voorafgaand aan het uitvoeren van MIDI-FA, en dit te voltooien met een zuiveringsstap, biedt dit protocol een evenwicht tussen snelheid en precisie. Hoewel deze methode mogelijk niet geschikt is wanneer hoge zuiverheid vereist is (dat wil zeggen bij 13 C PLFA analyse) of bij het analyseren van fosfolipiden en neutrale lipiden afzonderlijk, kan het in veel gevallen het detecteren van microbiële gemeenschapsreacties op milieuomstandigheden met grotere gevoeligheid dan DNA-gebaseerd Methoden 30 , 31 , 32 , 33 . Membraanlipiden ontleden snel na de dood van de cel waardoor ze kunnenWeerspiegelen de levende microbiële gemeenschap ten tijde van steekproefneming 5 , 7 , in tegenstelling tot milieu-DNA waarin veel van de informatie afkomstig is van dode of inactieve organismen 34 . Gezien het hoge dormiteitsniveau tussen bodemmicro-organismen 35 , kan de karakterisering van levende biomassa worden gebruikt om temporele plant-microbe-interacties op een relatief fijne temporale schaal te begrijpen en lipidbiomarkers kunnen gebruikt worden om de fysiologische status van de microbiële gemeenschap te beoordelen 7 . Er is gebleken dat hoge doorvoermethoden nodig zijn om microbiële respons in grote veldinstellingen 25 te beoordelen en terwijl de methode die we hier voorstellen niet de nauwkeurigheid van PLFA biomarkerprofielen repliceert, verhoogt het de doorvoer, terwijl de variabiliteit die met de MIDI-FA gerealiseerd wordt, worden beperkt procedure. De methode is bewezen een effectief hulpmiddel bij het aanpakkenVragen over microbiële gemeenschapsdynamiek op een breed scala aan gronden in grootschalige landbouw- en ecosysteemstudies 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .
Lipid klassen worden gecombineerd met deze methode en er kan een verlies van de informatie in die afzonderlijke klassen 22 , 39 zijn , maar het combineren van de lipideclassen kan de kracht versterken om de arbusculaire mycorrhizale schimmels herkenning van de 16: 1 co5c van beide fosfo – en neutrale lipiden 40 . Bovendien, terwijl tHet aantal onbekende vetzuren (die afkomstig is van niet-levend organisch materiaal) kan bij deze methode hoger zijn, het bleek lager te zijn dan MIDI-FA en zorgt voor een vergelijking van de lipidenprofielen van de behandeling bij studies met veel monsters waarbij het monster Doorvoercapaciteit is een zorg 15 . De neutrale fractie wordt meestal geacht hoofdzakelijk afkomstig te zijn van opslaglipiden die door schimmels worden geproduceerd, hoewel er ook een kleinere bijdrage kan leveren uit de bodem fauna 41 . In dit licht kan de hier beschreven werkwijze resultaten opleveren die een grotere bijdrage van de schimmellipiden 18: 2 co 6,9c en 18: 1 co 9c tonen dan PLFA. De andere lipiden die in de neutrale fractie voorkomen zijn enkele van de verzadigde vetzuren, bijv. 16: 0, 18: 0, 20: 0.
Er zijn verschillende manieren waarop lipide data uitgedrukt en geanalyseerd kunnen worden. De meest voorkomende voorstellingen zijn overvloed (nmol g -1 grond), mole fractioN (nmol individuele lipide nmol -1 totale lipide) en molprocent (molfractie * 100). Normaliseerd door de totale lipiden in een monster, molfractie en molprocent zijn maatregelen van de relatieve overvloed van een gegeven lipide. Na een geschikte transformatie, bijvoorbeeld , arcsine vierkantswortel, molefractie is geschikt voor gebruik in analyse door hoofdcomponenten of redundantieanalyse-coördinatie. Overvloed is de absolute hoeveelheid van een gegeven lipide geëxtraheerd per gram grond. Omdat de hoeveelheid lipide per cel redelijk constant is en de lipidextractie zeer efficiënt en uitgebreid is, is totale overvloed een goede schatting van de totale lipiden en het overvloed aan sleutelindicatoren weerspiegelt de biomassa van de ecologische groep die het vertegenwoordigt 17 . Tenslotte is een goede manier om naar de microbiële gemeenschapssamenstelling te kijken, gebruik te maken van multivariate analysemethoden 16 , bijvoorbeeld ordeningsmethoden zoals nonmetrische multidimensionale schaling (NMDS -Die geen data transformatie nodig heeft) of principe componenten analyse (PCA), kan nuttig zijn voor het vergelijken van de relatieve overvloed van alle lipide biomarkers.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd door het DOE Great Lakes Bioenergie Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) en DOE OBP Office of Energy Efficiency and Renewable Energy (DE-AC05-76RL01830). De auteurs willen Anders Gurda graag erkennen voor zijn geduldige en bekwame bijdrage aan videografie en editing.
RapidVap | Labconco | 7900000 | Evaporative system |
RapidVap | Labconco | 7491400 | Sample block |
Chem-resistant vacuum pump | Labconco | 7584000 | Vacuum pump |
Chemical trap cannister | Labconco | 7815300 | Trap cannister |
Solvent insert | Labconco | 7515200 | Solvent trap insert |
Diaphragm pump | Welch | 7398000 | DryFast vacuum pump |
Water bath | Fisher | 15-462-15Q | 2 well water bath |
Gas chromatograph | Various | N/A | For sample analysis |
Centrifuge | Various | N/A | For sample separation |
Freeze Dryer | Various | N/A | For sample lyophilization |
Repipet (6) | BrandTech | 4720440 | For dispensing reagents |
Vortex | Fisher | 02-215-365 | Analog vortex mixer |
Teflon centrifuge tubes | Thermo/Nalgene | 3114-0030 | Teflon sample tubes |
Caps | Thermo/Nalgene | DS3131-0020 | Caps for teflon tubes |
Test tube | Corning | 9825-16 | 16x100mm tubes |
Test tube | Corning | 9825-16xx | 16x150mm tubes |
Caps | Corning | 9998-15 | 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner |
Pasteur pipets | Fisher | 13-678-20B | 14.6cm |
500 uL glass syringe | Fisher | 13684106LC | Hamilton 81217 |
Amber vials | Agilent | 5182-0716 | 4mL Amber vials |
Caps | Agilent | 5182-0717 | Blue screw caps |
Inserts | Agilent | 5181-3377 | 400uL flat bottom glass inserts |
Standards | |||
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) | VWR | TCN0459-5G | Analytical standard |
Chemicals | |||
Dipotassium phosphate (K2HPO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Methanol (CH3OH – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 2 |
Sodium hydroxide (NaOH – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 4 |
Hydrochloric acid (6N HCL) | Various | N/A | For making Reagent 2 |
Hexane (HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
MTBE (Methyl tert-butyl ether – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |