Artikeln beskriver en metod som ökar genomströmningen samtidigt som man balanserar ansträngning och noggrannhet för utvinning av lipider från mikroorganismernas membranmembran för användning vid karakterisering av både totala lipider och den relativa överflödigheten av indikatorlipider för bestämning av markmikrobiell samhällsstruktur i studier med många prover.
Mikrobiella samhällen är viktiga drivrutiner och reglerare för ekosystemprocesser. För att förstå hur förvaltningen av ekosystem kan påverka mikrobiella samhällen är en relativt exakt men ansträngningskrävande teknik för att analysera mikrobiell gemenskapsammansättning fosfolipidfettsyra (PLFA) -analys. PLFA utvecklades för att analysera fosfolipidbiomarkörer, som kan användas som indikatorer på mikrobiell biomassa och sammansättningen av breda funktionella grupper av svampar och bakterier. Det har vanligtvis använts för att jämföra jordar i alternativa växtsamhällen, ekologi och förvaltningssystem. PLFA-metoden har visat sig vara känslig för att detektera skift i mikrobiell samhällssammansättning.
En alternativ metod, extrakt och analys av fettsyra-metylester (MIDI-FA) utvecklades för snabb extraktion av totala lipider, utan separation av fosfolipidfraktionen, från rena kulturer som en mikrobiell identifieringsteknik. Denna metod ärSnabb men är mindre lämplig för markprover eftersom det saknar ett första steg som skiljer markpartiklar och börjar istället med förtvålningsreaktion som sannolikt producerar artefakter från bakgrunden organisk substans i jorden.
Denna artikel beskriver en metod som ökar genomströmningen samtidigt som man balanserar ansträngning och noggrannhet för utvinning av lipider från mikroorganismernas membranmembran för användning för att karakterisera både totala lipider och den relativa överflöd av indikatorlipider för bestämning av markmikrobiell samhällsstruktur i studier med många prover. Metoden kombinerar noggrannheten som uppnåtts genom PLFA-profilering genom att extrahera och koncentrera marklipider som ett första steg och en minskning av ansträngningen genom att förtviva det organiska materialet som extraheras och behandlas med MIDI-FA-metoden som ett andra steg.
Med tanke på mikroorganismernas viktiga roll i näringscykeln 1 , modifiering av växtföreningens sammansättning 2 , reglering av växtproduktivitet 3 och sönderdelning av organiskt material 4 är förståelsen av markmikrobiella samhällen en viktig förståelse för markbundna ekosystem.
På grund av deras relativt stora överflöd i marken och deras kemiska signatur kan lipidbiomarkörer användas för att profilera de dominerande ekologiska grupperna som innefattar mikrobiella gemenskaper i jorden 5 . Genom att kvantifiera lipidbiomarkörer som är karakteristiska för olika mikrobiella grupper kan vi uppskatta totala lipider, och separera sedan dessa lipider i ekologiskt relevanta grupper, såsom Gram-positiva (Gm +) och gramnegativa (Gm) bakterier, arbuskulär mykorrhizal (AM) och saprotrofisk Svampar och aktinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .
Det finns många metoder för att karakterisera aspekter av mikrobiella samhällen. PLFA-metoden är en som vanligtvis används för att förstå grundläggande mikrobiell samhällsstruktur. Det är ett effektivt sätt att bedöma den relativa överflöd av mikrobiella grupper samt total mikrobiell biomassa. På grund av snabb lipidomsättning möjliggör PLFA-profilering också relativt snabb detektering av förändringar i jordmikrobiell gemenskap och ger information som möjliggör jämförelse av ekosystemfunktionen, t.ex. svamp: bakterieförhållanden för att bedöma näringscykeln 1 , 9 , 10 . Medan PLFA-extraktionsmetoden är tidskrävad och väl respekterad, är det också tidskrävande och låter sig inte bra i studier av ekosystemskalor som kräver ett stort antal prover från fältskalansreplikatF "> 11 , 12 .
I motsats härtill har fettsyra-metylester-extraktionsmetoden (MIDI-FA) potential att möjliggöra snabb genomströmning. I denna metod förtäppas proverna, omvandlas till FAMEs, extraheras och analyseras därefter. MIDI-FA-metoden är snabb men mindre diskriminerande än PLFA, som kombinerar extraktion av lipider med separation av olika lipidklasser 13 (fosfolipider, neutrala lipider och glykolipider).
I det här protokollet beskriver vi en metod som kombinerar element i både lipofilter och PLI-lipidprofilering. Det utnyttjar extraktion av lipider med användning av de initiala kloroformutvinningsstegen i den modifierade Bligh och Dyer-metoden och sedan förtvålning och omvandling till FAMEs. Detta ger ett robust sätt att upptäcka mikrobiell samhällsstruktur samtidigt som mycket av bakgrundsbruset utesluts från icke-mikrobiellt material 5 , 14 </sup>. Denna metod utvecklades för att uppnå en balans mellan både PLFA- och MIDI-FA-protokollen, dvs behålla det mesta av noggrannheten med ökad genomströmning för att göra det logistiskt och ekonomiskt möjligt att analysera lipider från storskaliga studier med många prover 15 . Genom att utföra den initiala extraktionen och isolera de organiskt lösliga komponenterna (t ex lipider) innan MIDI-FA utförs och slutföra detta med ett reningssteg, erbjuder protokollet en balans mellan hastighet och precision.
För undersökning av flera prov från experiment med många replikat och / eller experimentella enheter kan forskare hitta fosfolipidfettsyraanalys (PLFA) för att vara oöverträffad när det gäller tid och material 25 . Med PLFA-metoden extraheras cellmembranfosfolipider, renas och identifieras med användning av den modifierade Bligh och Dyer 26 tvåfas vattenhaltig organisk extraktion. Detta följs av silikakromatografi i fast fas för att separera lipider genom polaritet och en alkalisk metylering av fosfolipidfettsyror i fettsyra-metylestrar. I PLFA kan profilering av lipider vara låg men av mycket hög renhet. Mikrobiellt ID införde en alternativ metod, fettsyra-metylesterproceduren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden extraheras alla lipider direkt från rena kulturer eller mark / sedimentprover 11 , 12 , 27 genomförtvålning. Denna metod har lägre lipidförlust och är snabb eftersom den inte har någon av koncentrations- eller reningsstegen i PLFA-metoden. Medan MIDI-FA-metoden är snabb och billigare, eftersom den ursprungligen var utformad för att identifiera organismer i ren kultur, finns inga initiala extraktions- eller reningssteg. Således kan det innefatta lipidliknande föreningar samekstraherade från organiska organiska material som förvränger gemenskapsunderskriften 27 , 28 , 29 . Eftersom denna inkludering också kan snedvrida biomassanordningar har MIDI-FA typiskt endast använts för att grovt kvalitativt beskriva marklipider 13 .
Förfarandet som vi beskriver här kombinerar det bästa av de två separata extraktionsförfarandena: 1) en extraktion och koncentration av lipider med användning av den modifierade Bligh och Dyer 26- metoden och 2) fettsyra-metylestern saPonifiering, metylering, extraktion och basvätskeprocedur som utvecklats kommersiellt. Denna metod utvecklades för att uppnå fördelarna med båda dessa protokoll samtidigt som nackdelarna 15 minimeras. Genom att utföra den initiala extraktionen och isolera de organiskt lösliga komponenterna (t ex lipider) innan MIDI-FA utförs och slutföra detta med ett reningssteg, erbjuder detta protokoll en balans mellan hastighet och precision. Även om denna metod kanske inte är lämplig när hög renhet krävs ( dvs. för 13 C PLFA-analys) eller när man analyserar fosfolipider och neutrala lipider separat, möjliggör det i många fall detektion av mikrobiella samhällsresponser på miljöförhållanden med större känslighet än DNA-baserad Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider sönderdelas snabbt efter celldöd så att de kanReflektera det levande mikrobiella samhället vid tidpunkten för provtagning 5 , 7 , i motsats till miljö-DNA där mycket av informationen kommer från döda eller inaktiva organismer 34 . Med tanke på den höga dormanshastigheten som observeras bland markmikroorganismer 35 kan karaktäriseringen av levande biomassa användas för att förstå tidsmässiga växtmikro-interaktioner i en relativt fin temporär skala och lipidbiomarkörer kan användas för att analysera mikrobiella samhällets fysiologiska status 7 . Det har visat sig att höga genomströmningsmetoder krävs för att bedöma mikrobiellt svar i stora fältinställningar 25 och medan metoden vi föreslår här inte replikerar noggrannheten av PLFA-biomarkörsprofilering ökar den genomströmningen samtidigt som den minimerar variationen realiserad med MIDI-FA procedur. Metoden har visat sig vara ett effektivt verktyg vid adresseringFrågor kring mikrobiell samhällsdynamik på ett stort antal jordar i storskaliga jordbruks- och ekosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .
Lipidklasser kombineras med denna metod och det kan finnas en förlust av informationen i de separata klasserna 22 , 39 men kombinationen av lipidklassen kan stärka kraften för att detektera det arbusculara mycorrhizala svampuppkomsten av 16: 1 co5c från båda fosforerna – och neutrala lipider 40 . Dessutom, medan tHans antal okända fettsyror (som kan härledas från icke-levande organiskt material) kan vara högre med denna metod, det visade sig vara lägre än MIDI-FA och möjliggör behandling jämförelse av lipidprofiler från studier med många prover där prov Genomströmningskapacitet är en oro 15 . Den neutrala fraktionen anses allmänt att härledas främst från lagringslipider som framställs av svampar, men det kan också vara något mindre bidrag från jordfena 41 . Mot bakgrund av detta kan metoden som beskrivs här ge resultat som visar ett större bidrag från svamplipiderna 18: 2 co 6,9c och 18: 1 co 9c än PLFA. De andra lipiderna som tenderar att dyka upp i den neutrala fraktionen inkluderar några av de mättade fettsyrorna, t.ex. 16: 0, 18: 0, 20: 0.
Det finns olika sätt på vilka lipiddata kan uttryckas och analyseras. De vanligaste representationerna är överflöd (nmol g -1 jord), mole fractioN (nmol individuell lipid nmol -1 total lipid) och molprocent (molfraktion * 100). Normaliserad av de totala lipiderna i ett prov är molfraktion och molprocent åtgärder av den relativa överflödet av en given lipid. Efter en lämplig transformation, t.ex. arcsin kvadratrot, är molfraktionen lämplig för användning vid analys av huvudkomponenter eller redundansanalysordination. Överflöd är den absoluta mängden av en given lipid extraherad per gram jord. Eftersom mängden lipid per cell är rimligt konstant och lipidutvinningen är mycket effektiv och omfattande är total överflöd en bra uppskattning av totala lipider och överflöd av nyckelindikatorer återspeglar biomassan i den ekologiska gruppen som den representerar 17 . Slutligen är ett bra sätt att titta på mikrobiell samhällssammansättning att använda multivariata analysmetoder 16 , t.ex. ordningsmetoder som icke-metrisk multidimensionell skalning (NMDS -Som inte behöver dataomvandling) eller huvudkomponentanalys (PCA), kan vara användbar för att jämföra den relativa överflödigheten av alla lipidbiomarkörer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades delvis av DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) och DOE OBP Office för energieffektivitet och förnybar energi (DE-AC05-76RL01830). Författarna skulle vilja erkänna Anders Gurda för hans patient och skickliga bidrag till videografi och redigering.
RapidVap | Labconco | 7900000 | Evaporative system |
RapidVap | Labconco | 7491400 | Sample block |
Chem-resistant vacuum pump | Labconco | 7584000 | Vacuum pump |
Chemical trap cannister | Labconco | 7815300 | Trap cannister |
Solvent insert | Labconco | 7515200 | Solvent trap insert |
Diaphragm pump | Welch | 7398000 | DryFast vacuum pump |
Water bath | Fisher | 15-462-15Q | 2 well water bath |
Gas chromatograph | Various | N/A | For sample analysis |
Centrifuge | Various | N/A | For sample separation |
Freeze Dryer | Various | N/A | For sample lyophilization |
Repipet (6) | BrandTech | 4720440 | For dispensing reagents |
Vortex | Fisher | 02-215-365 | Analog vortex mixer |
Teflon centrifuge tubes | Thermo/Nalgene | 3114-0030 | Teflon sample tubes |
Caps | Thermo/Nalgene | DS3131-0020 | Caps for teflon tubes |
Test tube | Corning | 9825-16 | 16x100mm tubes |
Test tube | Corning | 9825-16xx | 16x150mm tubes |
Caps | Corning | 9998-15 | 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner |
Pasteur pipets | Fisher | 13-678-20B | 14.6cm |
500 uL glass syringe | Fisher | 13684106LC | Hamilton 81217 |
Amber vials | Agilent | 5182-0716 | 4mL Amber vials |
Caps | Agilent | 5182-0717 | Blue screw caps |
Inserts | Agilent | 5181-3377 | 400uL flat bottom glass inserts |
Standards | |||
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) | VWR | TCN0459-5G | Analytical standard |
Chemicals | |||
Dipotassium phosphate (K2HPO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Methanol (CH3OH – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 2 |
Sodium hydroxide (NaOH – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 4 |
Hydrochloric acid (6N HCL) | Various | N/A | For making Reagent 2 |
Hexane (HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
MTBE (Methyl tert-butyl ether – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |