Artikkelen beskriver en metode som øker gjennomstrømmingen samtidig som innsats og nøyaktighet balanseres for utvinning av lipider fra cellemembranene til mikroorganismer for bruk ved karakterisering av både totale lipider og den relative overflod av indikatorlipider for å bestemme jordmikrobiell samfunnsstruktur i studier med mange prøver.
Mikrobielle samfunn er viktige drivere og regulatorer av økosystemprosesser. For å forstå hvordan forvaltningen av økosystemene kan påvirke mikrobielle samfunn, er en relativt presis, men innsatsintensiv teknikk for å analysere mikrobiell samfunnssammensetning, fosfolipidfettsyre (PLFA) analyse. PLFA ble utviklet for å analysere fosfolipidbiomarkører, som kan brukes som indikatorer for mikrobiell biomasse og sammensetningen av brede funksjonelle grupper av sopp og bakterier. Det har ofte blitt brukt til å sammenligne jordarter under alternative plantesamfunn, økologi og styringssystemer. PLFA-metoden har vist seg å være følsom for å oppdage skift i mikrobiell samfunnssammensetning.
En alternativ metode, utvinning og analyse av fettsyremetylester (MIDI-FA) ble utviklet for rask utvinning av totale lipider, uten separering av fosfolipidfraksjonen, fra rene kulturer som en mikrobiell identifikasjonsteknikk. Denne metoden erRask, men er mindre egnet for jordprøver fordi den mangler et innledende trinn som skiller jordpartikler og begynner i stedet med en forsåpningsreaksjon som sannsynligvis produserer artefakter fra bakgrunnen organisk materiale i jorden.
Denne artikkelen beskriver en metode som øker gjennomstrømmingen, samtidig som man balanserer innsats og nøyaktighet for utvinning av lipider fra cellemembranene til mikroorganismer for bruk for å karakterisere både totale lipider og den relative overflod av indikatorlipider for å bestemme jordmikrobiell samfunnsstruktur i studier med mange prøver. Metoden kombinerer nøyaktigheten oppnådd gjennom PLFA-profilering ved å ekstrahere og konsentrere jordlipider som et første trinn, og en reduksjon i innsats ved å saponifisere det organiske materialet ekstrahert og behandle med MIDI-FA-metoden som et andre trinn.
Gitt nøkkelrollen av mikroorganismer i næringssyklus 1 , modifisering av plantesammensetning 2 , regulering av planteproduktivitet 3 og dekomponering av organisk materiale 4 , er forståelse av jordmikrobielle samfunn en avgjørende for å forstå terrestriske økosystemer.
På grunn av deres relativt høye overflod i jord og deres kjemiske signatur kan lipidbiomarkører brukes til å profilere de dominerende økologiske gruppene som omfatter jordmikrobielle samfunn 5 . Ved å kvantifisere lipidbiomarkører som er karakteristiske for forskjellige mikrobielle grupper, kan vi estimere totale lipider, og deretter adskille disse lipidene til økologisk relevante grupper som Gram-positive (Gm +) og Gram-negative (Gm) bakterier, arbuskulær mykorrhizal (AM) og saprotrofisk Sopp og actinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .
Det er mange metoder for å karakterisere aspekter av mikrobielle samfunn. PLFA-metoden er en vanlig brukt til å forstå grunnleggende mikrobiell samfunnsstruktur. Det er en effektiv måte å vurdere den relative overflaten av mikrobielle grupper, samt total mikrobiell biomasse. På grunn av rask lipidomsetning gir PLFA-profilering også relativt rask gjenkjenning av endringer i jordmikrobiell samfunn og gir informasjon som gjør det mulig å sammenligne økosystemfunksjonen, f.eks. Sopp: bakterieforhold for å vurdere næringssyklus 1 , 9 , 10 . Imidlertid, mens PLFA-ekstraksjonsmetoden er æret og respektert, er det også tidkrevende og gir ikke godt til økosystemskala-studier som krever et stort antall prøver fra feltskalaereplikaterF "> 11 , 12 .
I motsetning hertil har fettsyremetylester-ekstraksjonsmetoden (MIDI-FA) potensialet til å gi rask gjennomstrømning. I denne metoden blir prøver saponified, konvertert til FAMEs, ekstrahert, og deretter analysert. MIDI-FA-metoden er rask, men mindre diskriminerende enn PLFA, som kombinerer ekstraksjon av lipider med separasjon av forskjellige lipidklasser 13 (fosfolipider, nøytrale lipider og glykolipider).
I denne protokollen beskriver vi en metode som kombinerer elementer fra både PLFA og MIDI-FA lipid profilering. Den anvender ekstraksjon av lipider ved anvendelse av de første kloroformekstraksjonstrinnene i den modifiserte Bligh og Dyer-metoden, og deretter forsåpning og konvertering til FAMEs. Dette gir en robust måte å oppdage mikrobiel samfunnsstruktur mens det utelukkes mye av bakgrunnsstøy fra ikke-mikrobielt materiale 5 , 14 </sup>. Denne metoden ble utviklet for å oppnå balanse mellom både PLFA- og MIDI-FA-protokollene, dvs. beholde det meste av nøyaktigheten mens økende gjennomstrømning gjør det logistisk og økonomisk mulig å analysere lipider fra store studier med mange prøver 15 . Ved å utføre den første ekstraksjonen og isolere de organisk oppløselige komponentene ( f.eks. Lipider) før du utfører MIDI-FA, og fullføre dette med et rensingstrinn, gir protokollen en balanse mellom hastighet og presisjon.
For undersøkelse av flere prøver fra eksperimenter med mange replikater og / eller eksperimentelle enheter, kan forskere finne fosfolipidfettsyreanalyse (PLFA) å være uoverkommelig når det gjelder tid og materialer 25 . Ved PLFA-metoden blir cellemembranfosfolipider ekstrahert, renset og identifisert ved bruk av den modifiserte Bligh og Dyer 26 -tofase vandig-organisk ekstraksjon. Dette følges av fastfase silikakromatografi for å separere lipider ved polaritet og en alkalisk metylering av fosfolipidfettsyrer i fettsyremetylestere. I PLFA kan profilering lipidutbytte være lav, men av meget høy renhet. Mikrobiell ID introduserte en alternativ metode, fettsyremethylester-prosedyren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden blir alle lipider ekstrahert direkte fra rene kulturer eller jord / sedimentprøver 11 , 12 , 27 gjennomforsåpning. Denne metoden har lavere lipid tap og er rask fordi den ikke har noen av konsentrasjonene eller rensingstrinnene i PLFA-metoden. Imidlertid, mens MIDI-FA-metoden er rask og rimeligere, fordi den opprinnelig ble utformet for å identifisere organismer i ren kultur, er det ingen innledende ekstraksjons- eller rensingstrinn. Dermed kan det inkludere lipidlignende forbindelser som samekstraheres fra jordorganisk materiale som forvrenger fellesskiltnavnet 27 , 28 , 29 . Fordi denne inkluderingen også kan forvride biomassetiltak, har MIDI-FA vanligvis kun blitt brukt til grovt kvalitativt å beskrive jordlipider 13 .
Prosedyren vi beskriver her kombinerer det beste av de to separate ekstraksjonsprosedyrene: 1) en ekstraksjon og konsentrasjon av lipider ved hjelp av den modifiserte Bligh og Dyer 26- metoden, og 2) fettsyremetylesteren saPonifiserings-, metylerings-, ekstraksjons- og basisvaskprosedyre utviklet kommersielt. Denne metoden ble utviklet for å oppnå fordelene ved begge disse protokollene, samtidig som ulemperne 15 minimeres. Ved å utføre den første ekstraksjonen og isolere de organisk oppløselige komponentene ( f.eks. Lipider) før du utfører MIDI-FA, og fullføre dette med et rensingstrinn, gir denne protokollen en balanse mellom hastighet og presisjon. Selv om denne metoden kanskje ikke er egnet når høy renhet kreves ( dvs. for 13 C PLFA analyse) eller når det analyseres fosfolipider og nøytrale lipider separat, gjør det i mange tilfeller mulig å påvise mikrobial samfunnsresponser på miljøforhold med større følsomhet enn DNA-basert Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider nedbrytes raskt etter at celledød tillater dem åReflektere det levende mikrobielle samfunnet ved prøvetaking 5 , 7 , i motsetning til miljø-DNA, hvor mye av informasjonen kommer fra døde eller inaktive organismer 34 . I lys av den høye dvalevilkåren observert blant jordmikroorganismer 35 , kan karakteriseringen av levende biomasse brukes til å forstå tidsmessige plante-mikrobe-interaksjoner i en relativt fin temporal skala og lipidbiomarkører kan brukes til å analysere den fysiologiske statusen til det mikrobielle samfunn 7 . Det har vist seg at høye gjennomstrømmingsmetoder er nødvendige for å vurdere mikrobiel respons i store feltinnstillinger 25 , og mens metoden vi foreslår her ikke gjengir nøyaktigheten av PLFA biomarkørprofilering, øker den gjennomstrømmingen samtidig som variasjonen blir realisert med MIDI-FA fremgangsmåte. Metoden har vist seg å være et effektivt verktøy for adresseringSpørsmål knyttet til mikrobiell samfunnsdynamikk på et bredt spekter av jordsmonn i store landbruks- og økosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .
Lipid klasser er kombinert med denne metoden, og det kan være et tap av informasjonen som finnes i de separate klassene 22 , 39 , men kombinering av lipidklassene kan styrke kraften til å oppdage arbuskulær mycorrhizal sopp opprinnelse av 16: 1 ω5c fra begge fosfor – og nøytrale lipider 40 . I tillegg, mens tAntallet ukjente fettsyrer (som kan stamme fra ikke-levende organisk materiale) kan være høyere med denne metoden, det ble vist å være lavere enn MIDI-FA og muliggjør behandling av sammenligning av lipidprofiler fra studier med mange prøver hvor prøven Gjennomgangskapasitet er en bekymring 15 . Den nøytrale fraksjonen antas generelt å stamme primært fra lagringslipider produsert av sopp, selv om det også kan være noe mindre bidrag fra jordfauna 41 . I lys av dette kan fremgangsmåten beskrevet her gi resultater som viser et større bidrag av sopplipidene 18: 2ω 6,9c og 18: 1ω 9c enn PLFA. De andre lipidene som har en tendens til å dukke opp i den nøytrale fraksjonen, inkluderer noen av de mettede fettsyrene, f.eks. 16: 0, 18: 0, 20: 0.
Det finnes forskjellige måter hvor lipiddata kan uttrykkes og analyseres. De vanligste representasjonene er overflod (nmol g -1 jord), mole fractioN (nmol individuell lipid nmol -1 total lipid) og molprosent (molfraksjon * 100). Normalisert av de totale lipidene i en prøve er molfraksjon og molprosent tiltak av den relative overflod av en gitt lipid. Etter en hensiktsmessig transformasjon, f.eks . Arcsin kvadratrot, er molfraksjonen hensiktsmessig for bruk ved analyse av hovedkomponenter eller redundansanalyseprøving. Overflod er absolutt mengde av et gitt lipid ekstrahert pr. Gram jord. Fordi mengden lipid per celle er rimelig konstant, og lipidekstraksjonen er svært effektiv og omfattende, er total overflod et godt estimat av totale lipider, og overfloden av nøkkelindikatorer reflekterer biomassen til den økologiske gruppen den representerer 17 . Endelig er en god måte å se på mikrobiell samfunnssammensetning å bruke multivariate analysemetoder 16 , for eksempel ordinasjonsmetoder som ikke-metrisk flerdimensjonal skalering (NMDS -Som ikke trenger dataomforming) eller hovedkomponentanalyse (PCA), kan være nyttig for å sammenligne den relative overflaten av alle lipidbiomarkører.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert delvis av DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Science of Science DE-FC02-07ER64494) og DOE OBP Office of Energy Efficiency and Renewable Energy (DE-AC05-76RL01830). Forfatterne vil gjerne anerkjenne Anders Gurda for hans pasient og dyktige bidrag til videografi og redigering.
RapidVap | Labconco | 7900000 | Evaporative system |
RapidVap | Labconco | 7491400 | Sample block |
Chem-resistant vacuum pump | Labconco | 7584000 | Vacuum pump |
Chemical trap cannister | Labconco | 7815300 | Trap cannister |
Solvent insert | Labconco | 7515200 | Solvent trap insert |
Diaphragm pump | Welch | 7398000 | DryFast vacuum pump |
Water bath | Fisher | 15-462-15Q | 2 well water bath |
Gas chromatograph | Various | N/A | For sample analysis |
Centrifuge | Various | N/A | For sample separation |
Freeze Dryer | Various | N/A | For sample lyophilization |
Repipet (6) | BrandTech | 4720440 | For dispensing reagents |
Vortex | Fisher | 02-215-365 | Analog vortex mixer |
Teflon centrifuge tubes | Thermo/Nalgene | 3114-0030 | Teflon sample tubes |
Caps | Thermo/Nalgene | DS3131-0020 | Caps for teflon tubes |
Test tube | Corning | 9825-16 | 16x100mm tubes |
Test tube | Corning | 9825-16xx | 16x150mm tubes |
Caps | Corning | 9998-15 | 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner |
Pasteur pipets | Fisher | 13-678-20B | 14.6cm |
500 uL glass syringe | Fisher | 13684106LC | Hamilton 81217 |
Amber vials | Agilent | 5182-0716 | 4mL Amber vials |
Caps | Agilent | 5182-0717 | Blue screw caps |
Inserts | Agilent | 5181-3377 | 400uL flat bottom glass inserts |
Standards | |||
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) | VWR | TCN0459-5G | Analytical standard |
Chemicals | |||
Dipotassium phosphate (K2HPO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Methanol (CH3OH – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 2 |
Sodium hydroxide (NaOH – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 4 |
Hydrochloric acid (6N HCL) | Various | N/A | For making Reagent 2 |
Hexane (HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
MTBE (Methyl tert-butyl ether – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |