Artiklen beskriver en metode, der øger gennemstrømningen, mens balancering af indsats og nøjagtighed for udvinding af lipider fra cellemembraner af mikroorganismer til anvendelse ved karakterisering af både totale lipider og den relative overflod af indikatorlipider til bestemmelse af jordmikrobiell samfundsstruktur i undersøgelser med mange prøver.
Mikrobielle samfund er vigtige drivere og regulatorer af økosystemprocesser. For at forstå, hvordan forvaltningen af økosystemer kan påvirke mikrobielle samfund, er en relativt præcis, men indsatsintensiv teknik til at analysere mikrobiell samfundsammensætning, phospholipidfedtsyre (PLFA) analyse. PLFA blev udviklet til analyse af fosfolipidbiomarkører, som kan bruges som indikatorer for mikrobiell biomasse og sammensætningen af brede funktionelle grupper af svampe og bakterier. Det har almindeligvis været brugt til at sammenligne jordarter under alternative plantesamfund, økologi og forvaltningsregimer. PLFA-metoden har vist sig at være følsom overfor detektering af forskydninger i mikrobielle fællesskabssammensætninger.
En alternativ metode, udvinding og analyse af fedtsyremethylester (MIDI-FA) blev udviklet til hurtig udvinding af totale lipider uden separation af phospholipidfraktionen fra rene kulturer som en mikrobiel identifikationsteknik. Denne metode erHurtig, men er mindre egnet til jordprøver, fordi den mangler et indledende trin, der adskiller jordpartikler og begynder i stedet med en forsæbningsreaktion, der sandsynligvis producerer artefakter fra baggrunden organisk stof i jorden.
Denne artikel beskriver en metode, der øger gennemstrømningen, mens balancering af indsats og nøjagtighed for udvinding af lipider fra cellemembraner af mikroorganismer til anvendelse til karakterisering af både totale lipider og den relative overflod af indikatorlipider til bestemmelse af jordmikrobiell samfundsstruktur i undersøgelser med mange prøver. Metoden kombinerer nøjagtigheden opnået ved PLFA profilering ved at ekstrahere og koncentrere jordlipider som et første trin og en reduktion i indsatsen ved at forsæbe det organiske materiale ekstraheret og behandle med MIDI-FA-metoden som et andet trin.
I lyset af mikroorganismernes nøglerolle i næringscyklus 1 , modifikation af plantesammensætning 2 , regulering af planteproduktivitet 3 og nedbrydning af organisk materiale 4 er forståelse af jordmiljøsamfundene afgørende for at forstå jordbaserede økosystemer.
På grund af deres relativt store overflod i jorden og deres kemiske signatur kan lipidbiomarkører anvendes til profilering af de dominerende økologiske grupper omfattende jordmikrobielle samfund 5 . Ved at kvantificere lipidbiomarkører, som er karakteristiske for forskellige mikrobielle grupper, kan vi estimere totale lipider og derefter adskille disse lipider i økologisk relevante grupper, såsom Gram-positive (Gm +) og Gram-negative (Gm) bakterier, arbuscular mycorrhizal (AM) og saprotrofe Svampe og actinomycetes 5 , Ss = "xref"> 6 , 7 , 8 .
Der er mange metoder til at karakterisere aspekter af mikrobielle samfund. PLFA-metoden er en almindeligvis brugt til at forstå grundlæggende mikrobielle samfundsstruktur. Det er en effektiv måde at vurdere den relative overflod af mikrobielle grupper samt total mikrobiell biomasse. På grund af den hurtige lipidomsætning giver PLFA-profilering også relativt hurtig detektion af ændringer i jordmikrobiell samfund og giver information, der muliggør sammenligning af økosystemfunktionen, f.eks. Svampe: bakterieforhold for at bedømme satsen for næringscyklus 1 , 9 , 10 . Selvom PLFA-ekstraktionsmetoden er hædret og respekteret, er den imidlertid også tidskrævende og lænner sig ikke godt til økosystemskalaundersøgelser, der kræver et stort antal prøver fra feltskalaereplikaterF "> 11 , 12 .
I modsætning hertil har fedtsyre-methylesterekstraktionsmetoden (MIDI-FA) potentialet til at muliggøre hurtig gennemstrømning. I denne metode forsegles prøverne, konverteres til FAME'er, ekstraheres og analyseres derefter. MIDI-FA-metoden er hurtig, men mindre diskriminerende end PLFA, som kombinerer ekstraktion af lipider med adskillelse af forskellige lipidklasser 13 (fosfolipider, neutrale lipider og glycolipider).
I denne protokol beskriver vi en metode, der kombinerer elementer af både PLFA og MIDI-FA lipid profilering. Den anvender ekstraktion af lipider under anvendelse af de oprindelige chloroformekstraktionstrin af den modificerede Bligh og Dyer-metode og derefter forsæbning og omdannelse til FAME'er. Dette giver en robust måde at registrere mikrobiel samfundsstruktur, mens der udelukkes meget af baggrundsstøj fra ikke-mikrobielt materiale 5 , 14 </sup>. Denne metode blev udviklet for at opnå balance mellem både PLFA- og MIDI-FA-protokollerne, dvs. bevar det meste af nøjagtigheden og øge gennemstrømningen for at gøre det logistisk og økonomisk muligt at analysere lipider fra store studier med mange prøver 15 . Ved at udføre den oprindelige udvinding og isolering af de organisk opløselige komponenter ( fx lipider) forud for udførelse af MIDI-FA, og udførelse af dette med et oprensningstrin, giver protokollen en balance mellem hastighed og præcision.
Til undersøgelse af flere prøver fra eksperimenter med mange replikater og / eller eksperimentelle enheder kan forskere finde fosfolipid fedtsyreanalyse (PLFA) for at være uoverkommelige hvad angår tid og materialer 25 . Ved PLFA-metoden ekstraheres cellemembranfosfolipiderne, oprenses og identificeres ved anvendelse af den modificerede Bligh og Dyer 26 -faser med to fase vandig organisk ekstraktion. Dette efterfølges af fastfase silicakromatografi til separering af lipider ved polaritet og en alkalisk methylering af phospholipid fedtsyrer i fedtsyremethylestere. I PLFA kan profilering lipidudbytte være lavt, men af meget høj renhed. Microbial ID introducerede en alternativ metode, fedtsyremethylesterproceduren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden er alle lipider ekstraheret direkte fra rene kulturer eller jord / sedimentprøver 11 , 12 , 27 til og medforsæbning. Denne metode har lavere lipidtab og er hurtig, fordi den ikke har nogen af koncentrations- eller oprensningstrinnene i PLFA-metoden. Selvom MIDI-FA-metoden er hurtig og billigere, fordi den oprindelig var designet til at identificere organismer i ren kultur, er der ingen indledende ekstraktions- eller oprensningstrin. Det kan således indbefatte lipidlignende forbindelser co-ekstraheret fra organisk stof i jorden, der forvrider fællesskabsunderskriften 27 , 28 , 29 . Fordi denne inddragelse også kan fordreje biomasseforanstaltninger, har MIDI-FA typisk kun været brugt til groft kvalitativt at beskrive jordlipider 13 .
Fremgangsmåden, som vi beskriver her, kombinerer det bedste fra de to separate ekstraktionsprocedurer: 1) en ekstraktion og koncentration af lipider ved anvendelse af den modificerede Bligh og Dyer 26- metode og 2) fedtsyremethylesterenPonificerings-, methylerings-, ekstraktions- og basisvaskprocedure udviklet kommercielt. Denne metode blev udviklet for at opnå fordelene ved begge disse protokoller, samtidig med at ulemperne 15 minimeres. Ved at udføre den oprindelige ekstraktion og isolering af de organisk opløselige komponenter ( fx lipider) forud for udførelse af MIDI-FA og afslutte dette med et oprensningstrin, giver denne protokol en balance mellem hastighed og præcision. Selv om denne metode måske ikke er egnet, når der kræves høj renhed ( dvs. til 13 C PLFA analyse) eller ved analyse af phospholipider og neutrale lipider separat, muliggør det i mange tilfælde detektion af mikrobielle samfundsmæssige reaktioner på miljøforhold med større følsomhed end DNA-baseret Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider nedbrydes hurtigt efter celledød, der tillader dem atAfspejle det levende mikrobielle samfund på tidspunktet for prøveudtagning 5 , 7 i modsætning til miljø-DNA, hvor meget af informationen kommer fra døde eller inaktive organismer 34 . På grund af den høje dormitetsgrad, der observeres blandt jordmikroorganismer 35 , kan karakteriseringen af levende biomasse anvendes til at forstå tidsmæssige plante-mikrobe-interaktioner i en relativt fin temporal skala, og lipidbiomarkører kan anvendes til at analysere mikrobielle samfunds fysiologiske status 7 . Det har vist sig, at høje gennemløbsmetoder er nødvendige for at vurdere mikrobiel respons i store feltindstillinger 25 , og mens den metode, vi foreslår her, ikke replikerer nøjagtigheden af PLFA-biomarkørprofilering, øges gennemstrømningen, samtidig med at variabiliteten realiseres med MIDI-FA procedure. Metoden har vist sig at være et effektivt redskab til adresseringSpørgsmål relateret til mikrobiell samfundsdynamik på en bred vifte af jordbund i store landbrugs- og økosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 .
Lipid klasser kombineres med denne metode, og der kan være tab af informationen indeholdt i disse separate klasser 22 , 39 , men at kombinere lipidklasserne kan styrke kraften til at detektere arbuscular mycorrhizal svampes oprindelse af 16: 1 co5c fra begge phospho – og neutrale lipider 40 . Hertil kommer, at mens tAntallet af ukendte fedtsyrer (som kan stamme fra ikke-levende organisk stof) kan være højere ved denne metode. Det viste sig at være lavere end MIDI-FA og muliggør sammenligning af lipidprofiler fra forsøg med undersøgelser med mange prøver, hvor prøve Gennemstrømningskapacitet er en bekymring 15 . Den neutrale fraktion antages generelt at stamme primært fra opbevaringslipider produceret af svampe, selv om der også kan være noget mindre bidrag fra jordfauna 41 . I lyset heraf kan fremgangsmåden beskrevet her give resultater, som viser et større bidrag fra svampepipideme 18: 2ω 6,9c og 18: 1ω 9c end PLFA. De andre lipider, der har tendens til at dukke op i den neutrale fraktion, omfatter nogle af de mættede fedtsyrer, fx 16: 0, 18: 0, 20: 0.
Der er forskellige måder, hvorpå lipiddata kan udtrykkes og analyseres. De mest almindelige repræsentationer er overflod (nmol g -1 jord), mol fractioN (nmol individuelt lipid nmol -1 total lipid) og molprocent (molfraktion * 100). Normaliseret af de totale lipider i en prøve er molfraktion og molprocent foranstaltninger af den relative overflade af et givet lipid. Efter en hensigtsmæssig transformation er fx arcsin kvadratroden, molefraktion hensigtsmæssig til anvendelse ved analyse ved hjælp af hovedkomponenter eller redundansanalysekoordinering. Overflod er den absolutte mængde af et givet lipid ekstraheret pr. Gram jord. Fordi mængden af lipid pr. Celle er rimelig konstant, og lipidekstraktionen er yderst effektiv og omfattende, er den samlede overflod et godt skøn for de samlede lipider, og overfladen af nøgleindikatorer afspejler biomassen af den økologiske gruppe, den repræsenterer 17 . Endelig er en god måde at se på mikrobielle fællesskabssammensætninger at anvende multivariate analysemetoder 16 , fx ordinationsmetoder som ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS -Som ikke behøver datatransformation) eller hovedkomponentanalyse (PCA), kan være nyttig til sammenligning af den relative overflod af alle lipidbiomarkører.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist finansieret af DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) og DOE OBP Office for energieffektivitet og vedvarende energi (DE-AC05-76RL01830). Forfatterne vil gerne anerkende Anders Gurda for hans tålmodige og dygtige bidrag til videografi og redigering.
RapidVap | Labconco | 7900000 | Evaporative system |
RapidVap | Labconco | 7491400 | Sample block |
Chem-resistant vacuum pump | Labconco | 7584000 | Vacuum pump |
Chemical trap cannister | Labconco | 7815300 | Trap cannister |
Solvent insert | Labconco | 7515200 | Solvent trap insert |
Diaphragm pump | Welch | 7398000 | DryFast vacuum pump |
Water bath | Fisher | 15-462-15Q | 2 well water bath |
Gas chromatograph | Various | N/A | For sample analysis |
Centrifuge | Various | N/A | For sample separation |
Freeze Dryer | Various | N/A | For sample lyophilization |
Repipet (6) | BrandTech | 4720440 | For dispensing reagents |
Vortex | Fisher | 02-215-365 | Analog vortex mixer |
Teflon centrifuge tubes | Thermo/Nalgene | 3114-0030 | Teflon sample tubes |
Caps | Thermo/Nalgene | DS3131-0020 | Caps for teflon tubes |
Test tube | Corning | 9825-16 | 16x100mm tubes |
Test tube | Corning | 9825-16xx | 16x150mm tubes |
Caps | Corning | 9998-15 | 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner |
Pasteur pipets | Fisher | 13-678-20B | 14.6cm |
500 uL glass syringe | Fisher | 13684106LC | Hamilton 81217 |
Amber vials | Agilent | 5182-0716 | 4mL Amber vials |
Caps | Agilent | 5182-0717 | Blue screw caps |
Inserts | Agilent | 5181-3377 | 400uL flat bottom glass inserts |
Standards | |||
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) | VWR | TCN0459-5G | Analytical standard |
Chemicals | |||
Dipotassium phosphate (K2HPO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Methanol (CH3OH – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 2 |
Sodium hydroxide (NaOH – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 4 |
Hydrochloric acid (6N HCL) | Various | N/A | For making Reagent 2 |
Hexane (HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
MTBE (Methyl tert-butyl ether – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |