Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Het samenvoegen van Ion Concentratie polarisatie tussen Naast elkaar Ion Exchange membranen aan de voortplanting van de Polarisatie Zone blokkeren

Published: February 23, 2017 doi: 10.3791/55313
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1
1Center for BioMicrosystems, Korea Institute of Science and Technology, 2Department of Mechanical Engineering, Seoul National University, 3Department of Industrial Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign

Summary

Het protocol voor een nieuwe ionenconcentratie polarisatie (ICP) platform dat de voortplanting van de ICP zone kan stoppen, ongeacht de omstandigheden beschreven. Dit unieke vermogen van het platform ligt in het gebruik van fusie ion uitputting en verrijking, die twee polariteiten van de ICP fenomeen zijn.

Abstract

De ionconcentratie polarisatie (ICP) fenomeen is een van de meest gangbare methoden voor lage abundantie biologische monsters preconcentraat. De ICP induceert een niet-invasieve regio voor geladen biomoleculen (dwz het ion depletie zone), en doelstellingen kunnen worden gepreconcentreerd op deze regio grens. Ondanks de hoge prestaties preconcentratiestap met ICP, is het moeilijk om de bedrijfsomstandigheden van niet-voortplantende ion depletie zones vinden. Om deze smalle operationele venster te overwinnen, we recent ontwikkelde een nieuw platform voor spatiotemporeel vaste voorconcentrering. In tegenstelling tot voorgaande werkwijzen dat alleen ionen depletie gebruiken, dit platform gebruikt de tegengestelde polariteit van de ICP (dwz ion verrijking) tegen verspreiding van de ion uitputtingszone stoppen. Door de confrontatie met de verrijking zone met de uitputting zone, de twee zones samen te voegen elkaar en stoppen. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd experimenteel protocol bij deze spatiotemporeel gedefinieerd ICP platf bouwenorm en kenmerken de voorconcentratie dynamiek van het nieuwe platform door vergelijking met die van de conventionele inrichting. Kwalitatieve ion concentratie profielen en de huidige-time reacties met succes vastleggen van de verschillende dynamiek tussen de gefuseerde ICP en de stand-alone ICP. In tegenstelling tot de conventionele dat de preconcentratiestap locatie op ~ 5 V kan oplossen, kan het nieuwe platform een ​​doelwit-gecondenseerd plug produceren op een specifieke locatie in het brede bereik van bedrijfscondities: spanning (0,5-100 V), ionsterkte (1-100 mM) en pH (3,7-10,3).

Introduction

Ionenconcentratie polarisatie (ICP) verwijst naar een fenomeen dat optreedt tijdens ion ion verrijking en verarming een permselectief membraan, waardoor een extra potentiaaldaling met ionenconcentratie gradiënten 1, 2. Deze concentratiegradiënt is lineair, en steiler als een hogere spanning wordt aangelegd (Ohmse regime) tot de ionenconcentratie op het membraan nul nadert (beperking regime). Dit diffusie beperkte conditie, is de gradiënt (en overeenkomstige ion flux) bekend te maximaliseren / verzadigd 1. Afgezien van deze conventionele begrip, wanneer de spanning (of stroom) verder wordt verhoogd, een overlimiting stroom wordt waargenomen, met een flatscreen uitputting zones en zeer scherpe concentratie gradiënten op de zonegrens 1, 3. De vlakke zone heeft een zeer lage ionenconcentratie, maar oppervlaktegeleidingstype, elektro-osmoti c flow (EOF) en / of elektro-osmotische instabiliteit bevorderen ionflux en induceren een overlimiting huidige 3, 4, 5. Interessant is dat de vlakke uitputtingszone fungeert als elektrostatische barrière, die filtert 6, 7, 8, 9 en / of preconcentraten target 10, 11. Aangezien er een onvoldoende hoeveelheid ionen aan het oppervlak beschuldiging van geladen deeltjes (om te voldoen elektroneutraliteit) scherm, kunnen de deeltjes niet door deze depletiezone en daarom line-up op de grens. Deze lineaire ICP effect is een generiek verschijnsel in verschillende typen membranen 10, 11, 12, 13,> 14 en geometrieën 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; daarom onderzoekers in staat om verschillende soorten filtratie 6, 7, 8 hebben kunnen ontwikkelen, 9 en preconcentratiestap 10, 11 apparaten met behulp van de niet-lineaire ICP.

Zelfs bij een zo hoge flexibiliteit en stevigheid, het is nog steeds een praktische uitdaging om de bedrijfsomstandigheden voor de ICP-lineaire inrichtingen verduidelijken. De lineaire regime van de ICP snel verwijdert kationen door een kationenwisselingsmembraan, waarbij de verplaatsing van anionen richting van de anode veroorzaakt. Als eenHierdoor is de flat depletiezone propageert snel, wat doet denken aan shock voortplanting 22. Mani et al. noemde deze dynamische de deïonisatie (of uitputting) schokken 23. Om doelen preconcentraat op een aangewezen taststand, waardoor de uitbreiding van het ion uitputtingszone noodzakelijk, bijvoorbeeld door toepassing of EOF drukgedreven stroom tegen de expansie zone 24. Zangle et al. 22 verduidelijkt de criteria voor ICP propagatie in een eendimensionale model en sterk afhankelijk van elektroforetische mobiliteit 17, 18 ionsterkte, pH 25, enzovoort. Dit geeft aan dat de juiste bedrijfsomstandigheden wordt navenant te worden monstercondities.

Hier presenteren wij gedetailleerde ontwerp en experimentele protocollen voor een roman ICP-platform dat de streefcijfers preconcentraten binnen een spatiotemporaal gedefinieerde positie 26. De uitbreiding van de ionen uitputtingszone wordt geblokkeerd door de ion verrijking zone, waardoor een stationaire preconcentratiestap stekker aan een toegewezen positie, ongeacht de bedrijfstijd, aangelegde spanning, ionensterkte en pH. Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld voor de eenvoudigste methode om kationenuitwisselingsmembranen integreren in microfluïdische inrichtingen en de voorconcentratie prestaties van de nieuwe ISP platform ten opzichte van de conventionele tonen tonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricage van kationuitwisselingsmembraan geïntegreerde microfluïdische chips

  1. Bereiding van silicium masters
    1. Ontwerp twee soorten silicium meesters: een voor de patroonvorming van een kationenuitwisselingshars en de andere voor het bouwen van een microkanaal met polydimethylsiloxaan (PDMS).
      NB: Het detail geometrie zal in de stappen 1.3.1 en 1.4.1 worden beschreven.
    2. Fabriceren het silicium masters met behulp van conventionele fotolithografie of diepe reactief ion etsen 27.
    3. Silaniseren de micropatterned silicium meesters met trichloorsilaan (~ 30 pi) in een vacuüm pot voor 30 min.
      LET OP: Trichloorsilaan is een pyrofore vloeistof die is brandbaar en heeft een acute toxiciteit (inhalatie, orale inname).
  2. Bereiding van PDMS mallen
    1. Meng een siliconenelastomeer basis met een verharder in een 10: 1 verhouding en het kopje met deze uitgeharde PDMS(30-40 ml voor het repliceren van microstructuren op een 4-in silicium wafer) in een vacuüm pot voor 30 minuten om de luchtbellen te verwijderen.
      NB: De siliconen basis bevat siloxaan oligomeren eindigt met vinyl groepen en een platina gebaseerde katalysator. De verharder bevat crosslinking oligomeren die drie silicium hydride bindingen 28 hebben.
    2. Giet de uitgeharde PDMS op silicium meesters, de bellen met een ventilator en genezen van de PDMS bij 80 ° C gedurende 2 uur in een convectieoven.
    3. Maak de uitgeharde PDMS van silicium meesters en juiste vorm van de PDMS met een mes (vierkante vormen, zoals getoond in figuur 2a-b, iv).
  3. Patroonvorming van de kationenuitwisselmembranen
    1. Snijd de helft van de PDMS mal loodrecht op de twee parallelle microkanalen en perforeren aan de uiteinden van de PDMS kanalen met een 2,0-mm biopsie punch.
      LET OP: De PDMS mal voor de patroonvorming van het kation selectieve membraan heeft twee parallel microkanalen (width: 100 pm; height: 50 micrometer; interchannel afstand: 100 pm; figuur 1a). De oorspronkelijke vorm van de mal kan worden voorgesteld door het te spiegelen de gesneden mal langs de snijlijn. L-vormige microkanalen worden aanbevolen voor ponsen de twee gaten niet overlappen.
    2. Reinig een glasplaatje en de PDMS mal met tape en een blower en zet de mal op het glaasje te omkeerbare bevestiging tussen hen te creëren.
    3. Volgens de microflow patroonvormende techniek 29, vrijgave ~ 10 pi van een kationuitwisselingshars bij het open einde van het kanaal dat is gesneden in stap 1.3.1 (Figuur 1b). Plaats de spuit hoofd op de geponste gaten en trek de zuiger (zwarte pijlen in figuur 1b); een lichte negatieve druk zal trekken de kationenwisselaarhars, en de hars zullen de twee kanalen te vullen.
      LET OP: Het wordt aanbevolen dat de hoogte van het microkanaal is groter dan 1581, m, vanwege de hoge viscositeit van de hars vereist hoge druk om de kanalen te vullen. Aan de andere kant is het beter dat niet hoger is dan 100 pm, omdat de gevormde ionen selectief membraan dikker dan 1 urn wordt; dergelijke dikke membraan kan een spleet tussen het membraan en de PDMS kanaal 13 te creëren.
    4. Maak de PDMS mal zonder het gevormde hars en plaats het glaasje de verwarming bij 95 ° C gedurende 5 minuten om het oplosmiddel in de hars verdampt.
      OPMERKING: De dikte van het gevormde membraan gewoonlijk minder dan <1 urn. De mal wordt voorzichtig losgemaakt door scharnierend de vorm om de open-ended zijde (stippellijn en pijl in figuur 1b). Het beste is om de mal los minder dan 1 minuut na het vullen van de hars. Als de mal een paar minuten later wordt losgemaakt, kunnen dikkere membranen worden verkregen, maar ze een concave vorm hebben als gevolg van de capillaire werking.
    5. Verwijder de onnodigedeel van het gevormde membraan met een scheermesje, waardoor twee afzonderlijke lijn-patroon (figuur 1c).
      Opmerking: Het kationuitwisselmateriaal hier gebruikt heeft geperfluoreerde groepen, wat betekent dat de patroon niet sterk gebonden aan het glas. Daarom kan de eenvoudige werkwijze lamellen eenvoudig verwijderen van de onnodige deel van het membraan.
  4. Integratie van het microkanaal en de membraan-patroon substraat
    1. Punch twee gaten aan de uiteinden van microkanalen en nog twee gaten waar het membraan patronen zich na hechten van de PDMS kanaal naar de membraan gevormde substraat vervaardigd in stap 1,3.
      Opmerking: De PDMS microkanaal één kanaal (breedte: 50-100 urn; hoogte: 10 um), maar het is gebonden aan de uiteinden van de naburige kanalen (figuur 1d).
    2. Binden de PDMS microkanaal naar het membraan-patroon substraat onmiddellijk na zuurstof plasmabehandeling gedurende 40 s bij 100 W en 50 mTorr.
      LET OP: Plaats de patroon membraan loodrecht op het midden van het microkanaal.

2. ICP voorconcentrering

  1. Voorbereiding voor het experiment
    1. Bereid verschillende testoplossingen, zoals 1-100 mM KCl, 1 mM NaCl (pH ~ 7), het mengsel van 1 mM NaCl en 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), het mengsel van 1 mM NaCl en 0,2 mM NaOH (pH ~ 10,3), en 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
    2. Voeg een negatief geladen fluorescente kleurstof (~ 1,55 uM) aan de testoplossingen.
      Opmerking: De concentratie van de toegevoegde kleurstof moet veel lager dan die van de zoutionen (<10 uM) zodat de geladen kleurstoffen niet bijdragen aan een elektrische stroom 30, 31.
    3. Laad de monsteroplossing in een reservoir van het kanaal en toepassen negatieve druk op het andere reservoir om het kanaal te vullen met de oplossing. Sluit de twee reservoirs hydrodynamisch door releasing een grote druppel aan de drukgradiënt langs het kanaal (figuur 2a) te elimineren.
    4. Vul de twee reservoirs, die zijn verbonden met de kationuitwisseling patronen met bufferoplossingen (1 M KCl of 1 M NaCl) met een injectiespuit of een pipet ter compensatie van de ICP effect in de reservoirs.
    5. Plaats de draden in de reservoirs, over de twee gevormde membranen (anode links reservoir en kathode rechts) en verbindt ze met een bron meeteenheid (Figuur 2a).
  2. Visualisatie van de ICP fenomeen en ICP voorconcentrering
    1. Laad de ICP-apparaat op een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Toepassen van een spanning (V 0,5100) en meet de stroomresponsie met een bron meeteenheid.
    2. Leg fluorescerende beelden met een ladingsgekoppelde inrichting camera en analyseren van de fluorescentie-intensiteit met behulp beeldverwerkingssoftware 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het schema fabricagestappen van een membraan geïntegreerde microfluïdische preconcentrator zijn weergegeven in figuur 1. Een gedetailleerde beschrijving van de vervaardiging wordt in het protocol. De ontwerpen en apparaatbeelden van de spatiotemporeel gedefinieerde preconcentrator 26 worden gecontrasteerd met die van een conventionele preconcentrator 11 (figuur 2). De ICP fenomeen in de spatiotemporeel gedefinieerde preconcentrator werd onderzocht in termen van stroom-voltage-time reacties en fluorescentie-intensiteit profielen (Afbeelding 3-4). Vergelijkbaar met de ICP fenomeen met een membraan preconcentrator 3, 11, drie verschillende regimes (ohmse, beperken en overlimiting) waargenomen in de stroom-voltage curve: 0,5-1 V (ohmse en beperken) en 5 V (overlimiting) . Echter, een niet-conventionele huidige herstel wasgedetecteerd in de huidige tijdcurve als ion verrijking en het ion depletie zones samengevoegd. Vervolgens werd de ICP preconcentratiestap getest op verschillende tijdstippen en voltages met spatiotemporeel gedefinieerde preconcentrator (figuur 5) en de conventionele membraan-inrichting (figuur 6). De voorconcentrering dynamiek werden gekwantificeerd met behulp van fluorescentie beelden, de huidige-time respons, en fluorescentie-intensiteit grafieken over verschillende afstanden en tijden. Bij vergelijking van de twee platforms, de nieuwe ISP platform toont een voordeel altijd verzamelen targets (fluorescente kleurstoffen) tussen de beide kation selectieve membraan patronen. Bovendien werd bevestigd dat voorconcentratie plug blijft hetzelfde in verschillende ionensterkte (1-100 mM NaCl) en de pH (3,7-10,3), het verifiëren van de hoge beschikbaarheid van de fuserende ICP preconcentrator in een breed bereik van bedrijfsomstandigheden (fig 7). In figuur 8, een 10.000-voudige eiwit preconcentratie werd eveneens aangetoond.

Figuur 1
Figuur 1. fabricagestappen van een kationuitwisselingsmembraan geïntegreerde microfluïdische chip. Na een PDMS mal wordt gevuld met een kationenwisselaar met de microflow patroonvormende techniek (a - c) 29, het membraan gevormde glazen substraat wordt geplakt met een PDMS microkanaal door zuurstof plasmabehandeling (d). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Schema van de spatiotemporeel gedefinieerde preconcentrator (a) en conventionele preconcentrator (b). (A) In the nieuw platform, tussen twee membraanlagen patronen (i), ion depletie / verrijking zones ontwikkeld en samengevoegd met lineaire (ohmse en beperking regime, ii) of lineaire (overlimiting regime; iii) concentratieprofielen. In alle drie de bestaande regelingen, de ionen verrijking zone blokkeert de propagatie van de uitputtingszone en targets (holle cirkels; i) worden gepreconcentreerd op het grensvlak van het ion uitputting en verrijking zones (gebogen, stippellijn; i). De wand van de PDMS kanaal negatief geladen, en dit genereert elektro-osmotische stroming (EOF) tussen de beide kation- onder een elektrisch veld. De EOF levert continu doelen in de richting van de interface van de uitputting en verrijking zones. (B) In de conventionele platform, alleen het ion depletie zone is ontwikkeld in de buurt van het membraan met lineaire (ohmse en het beperken van regime, ii) en niet-lineaire (overlimiting regime; iii) concentratie gradiënten. Zoals het EOF levert de doelstellingen, de preconcentratiestap aldat optreedt bij de depletie zonegrens, maar deze zone (en gepreconcentreerd stekker) zich van het membraan voor kationenuitwisseling (zwarte pijl; i). Opgemerkt wordt dat er geen verhoging van de ionenconcentratie hier zonder verrijking ion zone (ii-iii). In (ab), worden de afbeeldingen getoond in (iv). C 0 vertegenwoordigt de eerste ionconcentratie. V + en G geven de anode en de kathode resp. Overgenomen uit Reference 26t met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Samengevoegd ICP verschijnsel tussen twee kationenuitwisselmembranen. (A) de stroom-voltage curve toont drie verschillende regimes (ohmse, beperking, en overlimiting). De huidige respons wordt gemeten door opvoeren van de spanning op discrete intervallen van 0,25 V elke 40 s, die drie keer wordt herhaald. De fout balk geeft de standaarddeviatie van de huidige reacties. (b, c) in de drie regimes fluorescentiebeelden (b) en intensiteitprofielen langs AA 'in het midden van het kanaal (c) verkregen. Geel, gestippelde vakjes geven de locaties van de kation selectieve membranen. 1 mM KCl oplossing met 1,55 uM (1 ug / ml) negatief geladen fluorescente kleurstof werd gebruikt. Overgenomen van Reference 26 met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. (A, b) de ohmse beperkende regimes, de lineaire concentratiegradiënt groei (<1 s) vanaf het kationenuitwisselingsmembraan en overlappen elkaar (> 1 s). (C) In de overlimiting regime, worden de twee ICP zones sneller (<0,6 s) met de uitputting shock (zwarte pijl in 0,2 s) samengevoegd. (D - f) De actuele tijd reacties blijkt dat de huidige aanvankelijk is gedaald als gevolg van de groei van de lage-concentratie uitputtingszone, dat overeenkomt met lage elektrische geleidbaarheid. De huidige daling wordt dan hersteld als gevolg van een convectief transport van wervels opgesloten tussen twee membranen. Overgenomen uit referentie een 26 met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> figuur 5
Figuur 5. spatiotemporeel vaste preconcentratiestap op 5, 10, en 20 V. (a - c) Fluorescentie beelden van de gefuseerde ICP en de huidige tijd reacties (d - f) na verloop van tijd (0-100 s). De gele, gestippelde lijnen geven de plaats van het kation uitwisselende membranen. (G) Time-lapse fluorescentie-intensiteit profielen worden uitgezet langs de microkanaal (AA '). De piek intensiteit toenemen naarmate de tijd verstrijkt, met vaste locaties. (H) De piekintensiteit vouw (dat wil zeggen, hoeveel keer groter dan de initiële fluorescentie-intensiteit). Bij hogere spanningen, hoe sneller EOF levert doelen aan het grensvlak van het ion uitputting en verrijking zones, zodat de preconcentratiestap snelheid toeneemt. Een piek bij 20 V wordt geïnduceerd door de uitputting shock ( figuur 4c, op 0,8 s, de piek was breder dan aan 0,4 s. Dit komt waarschijnlijk doordat de linkerkant van de linker Nafion patroon (Figuur 2a) elektrisch werd gedreven, en de geaccumuleerde kleurstoffen konden verspreid. Overgenomen van Reference 26 met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. ICP fenomeen in de conventionele ICP preconcentrator bij 5, 10 en 20 V. (A - c) Fluorescentie beelden van de ion uitputting zone en de huidige-time respons (d - f) na verloop van tijd (0-100 s). De voortplanting van de uitputting zone en de preconcentratiestap plug is duidelijk zichtbaar in de fluorescentie beelden. Dienovereenkomstig worden de wervels niet beperkt, zodat het huidige herstel niet optreedt, zelfs in de overlimiting regime. Geel, stippellijnen markeren de locatie van het kation uitwisselende membranen. (G) Time-lapse fluorescentie-intensiteit profielen worden uitgezet langs de microkanaal (AA '). De piek intensiteit toenemen naarmate de tijd verstrijkt, maar de locatie beweegt weg van het membraan. (H) piekintensiteit vouw van het conventionele apparaat ICP. In tegenstelling tot de samengevoegde ICP-apparaat (figuur 5H), is er geen intensiteit spike zonder insluiten van ICP zones, omdat de fluorescentie-intensiteit verhoogd de kleurstof gepreconcentreerd. De toename van tHij piekintensiteit vouw is vergelijkbaar met die van de gefuseerde ICP apparaat tegelijkertijd (bij een gegeven spanning). Dit betekent dat de tijdsduur dat de gepreconcentreerd plug op zijn plaats gehouden is cruciaal voor de preconcentratiestap prestaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. spatiotemporeel gedefinieerd voorconcentratie bij verschillende ionensterkte (1-100 mM NaCl) en de pH (3,7-10,3). (A) Fluorescentie afbeeldingen verkregen na 100 s bedrijfsuren bij 50 V. Zoals blijkt, de locaties van de preconcentratiestap stekkers blijven tussen de twee kation- (geel, stippellijnen), terwijl de intensiteit wordt verzwakt onder hoge ionische sterkte en in een sterk zure of basischeoplossing. (B, c) de locatie van de piek intensiteit en de intensiteit vouw (dwz. Hoe vaak groter dan de oorspronkelijke intensiteit), toegewezen onder 10, 20, 50 en 100 V. Voor een enkele voorwaarde (1, 10, 100 mM en / of pH 3,7, 7 en 10) zijn er vier gegevenspunten die overeenkomen met de vier spanningsvoorwaarden. Bij hogere spanningen, er een hogere piek intensiveren vouw in alle gevallen. 100 V niet in 1 mM NaCl (pH 7) omdat de piekintensiteit al raakte de hoogste waarden (als gevolg van de verzadiging van de camera) bij 50 V. Uit de piekintensiteit profiel getest, wordt het piekgebied ook geïdentificeerd, met 1 % onder de piekintensiteit, dat wordt voorgesteld door foutstaven (b, c). Een hogere spanning en een sterkere EOF verschuiven de pieklocatie naar rechts, met een hogere intensiteit vouw en een scherpere preconcentratiestap plug. Grijze vakken geven de locaties van het kation uitwisselende membranen. 0 De afstand (a) geeft de oorsprong van de x-as (b, c), dieaan de rechterzijde van de linker kationenuitwisselingsmembraan. De oorsprong van de afstand van de rechterrand van het linker membraan. Overgenomen van Reference 26 met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. Demonstratie van spatiotemporeel vaste eiwit voorconcentrering. FITC-albumine (1 ug / ml) in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing werd gebruikt. 0,1% Tween 20 werd toegevoegd aan niet-specifieke binding te voorkomen. Aangezien de preconcentratiestap nauwelijks een hogere ionensterkte (figuur 7) bereikt, we verdubbelde de breedte van de Nafion patroon (200 pm) en gebruikt een smallere PDMS kanaal (50 pm). Zo zijn de prestaties van ICP preconcentratiestap was doorverbreding van de ionen weg en het verminderen van de absolute hoeveelheid ionen in het kanaal. Bij een aangelegde spanning van 100 V, de piek en gemiddelde fluorescentie-intensiteiten werden opgespoord in het witte, gestippelde doos, het gebied tussen de twee kationenuitwisselmembranen. Binnen 10 min van de werking werden de eiwitten gepreconcentreerd tot 10 mg / ml (piek) en ~ 0,1 mg / ml (gemiddeld), wat aangeeft 10.000 en 100-voudig preconcentrations respectievelijk. De inzet fluorescentiebeelden werden verkregen op 0, 10 en 20 min. In dit werk, een 20-min operatie was genoeg om de doelmoleculen preconcentraatformulering, dus we hebben geen betrekking op langere inzetduur. Overgenomen van Reference 26 met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben beschreven de vervaardiging protocol en het uitvoeren van een spatiotemporeel gedefinieerd preconcentrator in een bereik van de aangelegde spanning (0,5-100 V), ionsterkte (1-100 mM) en pH (3,7-10,3), het bereiken van een 10.000-voudige voorconcentrering van kleurstoffen en eiwitten binnen 10 min. Zoals net als vorige ICP-apparaten, de preconcentratiestap prestaties beter wordt bij een hogere spanning en tegen lagere ionsterkte. Een extra parameter kunnen we hier te overwegen is de afstand tussen twee kationenuitwisselmembranen. Als we verhoging van de inter-membraan afstand, het elektrische veld afneemt onder dezelfde aangelegde spanning, waardoor de afname van de snelheid preconcentratiestap 26.

De microflow patroonvormende techniek 29 die in dit werk is een robuuste methode voor patroonvorming kationenwisselaarhars zo is het een van de gouden standaard werkwijzen voor het integreren van de ionenuitwisselende in microfluïdische systemen geweest. Niettemin, is het noodzakelijk om twee naast elkaar gelegen kationenuitwisselmembranen fabriceren met een korte intermembrane afstand (minder dan enkele honderden micrometer). In stappen 1.3.3-1.3.4, de kationenuitwisselingshars in een vloeibare fase. Daarom kan de hars in de twee microkanalen worden ingeklapt, en de resterende hars daling aan het open uiteinde van de kanalen kan overstromen tijdens de matrijs losmaken (stap 1.3.4.). Twee kationenuitwisselingsmembranen met high fidelity patroon bouwen, gebruikten we de hars met een relatief hoge viscositeit (20% van het kationuitwisselmateriaal in de oplosmiddelen) en zorgvuldig stel de onthechting proces met een aangewezen richting los.

Hoewel de hoge operationele flexibiliteit van dit platform werd aangetoond, kan de lezer bezorgd over het bepalen van de optimale omstandigheden van de vele in het werkvenster zijn. Een vertegenwoordiger afweging is tussen de voorconcentratie snelheid en stabiliteit van de ICP effect. Een scanblijkt uit figuur 5 in Kwak et al. 26, een hoge aangelegde spanning (> 50 V) kan doelen snel condenseren; echter induceert ook een sterke wervelingen in de uitputtingszone (1 mM / pH 7 in figuur 7a), die de stabiliteit van het monster preconcentratiestap afneemt. Bijgevolg is de preconcentratiestap snelheid wordt het moeilijk om te voorspellen 33. In het huidige stadium, raden we experimentele omstandigheden met een relatief lage spanning (<30 V) en ionische sterkte (<10 mm) voor een stabiele, voorspelbare en spatiotemporeel vaste voorconcentrering. Deze wisselwerking tussen de voorconcentratie snelheid en stabiliteit van de gepreconcentreerd plug is ook gerelateerd aan de bronnen van de lineaire ICP (oppervlaktegeleiding, EOF en electro-osmotische instabiliteit). De belangrijkste bron van de niet-lineaire ICP bij een relatief kleine spanning (<50 V) EOF, een coherente draaikolkpaar in de uitputtingszone (figuur 3b), die leadvertenties op een stabiele voorconcentrering. Bij een relatief hoge spanning (> 50 V), is de belangrijkste bron van de niet-lineaire ICP veranderd elektronosmotische instabiliteit, wat resulteert chaotische meerdere vortexen, die de stabiliteit van de preconcentratiestap verminderen.

Onlangs hebben op papier gebaseerde ICP platforms ontwikkeld door Phan et al. 34, Gong et al. 19 en Han et al. 21. Deze papieren apparaten met microporeuze structuren kunnen elektro-osmotische instabiliteit 4, 35 onderdrukken en verlichten de stabiliteit kwestie. De afmetingen van het papier kanalen die in het algemeen ongeveer 0,5-5 mm, dat veel groter is dan een conventionele microfluïde kanaal. Deze bredere papieren kanaal met willekeurige glasvezelnetwerken veroorzaakt onregelmatige bewegingen in de gepreconcentreerd pluggen. Dit heeft onvermijdelijk in papieren ICP preconcentrators geweest, omdat de minimale featuregrootte van was patronen en papier snijden (dat wil zeggen, fabricage methodes om papier kanalen te bouwen) is ongeveer paar honderd micrometer.

De ICP preconcentrator is gebruikt in een breed scala van biomicrofluidic platforms voor preconcentrating verschillende bio-agenten; het versterken van de signalen van diverse methoden; en het detecteren van doelen, zoals therapeutische eiwitten 36, 37 peptiden, aptameren 17 en 38 enzymen. Deze eerdere werken gerichte-fluorescentie gelabelde biomoleculen. Dit is omdat we niet de exacte omstandigheden kunt opgeven (dat wil zeggen, de spanning en de stroomsnelheid) naar de preconcentratiestap site te onderhouden, dus moeten we eerst de juiste voorwaarden voor de preconcentrator targets te vinden. Vertrekkend vanuit eerdere werk, de gefuseerde ICP fenomeen stelt ons in staat om de gepreconcentreerd stekkers altijd vast te stellen op een breed scala van operationele omstandigheden met behoud van de hoge flexibiliteit van deICP apparaten. Zo kunnen we de gefuseerde ICP systeem met een tangentiale stroming moduleren en werken in de doorstroom-modus 39. Dit geeft aan dat we nu de toepassing van ICP preconcentrators kan uitstrekken tot detectietechnieken-vrije labelen zonder visualisatie instrumenten en tracers. Dit unieke voordeel van de spatiotemporele beheersbaarheid zorgt voor een sterke commerciële kans om de ICP-apparaat met generieke benchtop platforms, zoals polymerase kettingreactie machines en massaspectrometers integreren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning
Trichlorosilane Sigma Aldrich 175552 Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt% Sigma Aldrich 527122
Sodium chloride Sigma Aldrich 71394
Potassium chloride Sigma Aldrich 60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20000
Isothiocyanate-conjugated albumin Sigma Aldrich A9771
Phosphate buffer saline, 1x Wengene LB004-02
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
Epifluorescence microscope Olympus IX-71
Charged-coupled device camera Hamamtsu Co. ImageEM X2
Source measurement unit Keithley Instruments 2635A
Covance-MP Femto Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Probstein, R. F. Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction. , Wiley-Interscience. New York. (2003).
  2. Strathmann, H. Ion-Exchange Membrane Separation Processes. , Elsevier. Amsterdam. (2004).
  3. Dydek, E. V., et al. Overlimiting Current in a Microchannel. Phys. Rev. Lett. 107 (11), 118301 (2011).
  4. Kwak, R., Pham, V. S., Lim, K. M., Han, J. Y. Shear flow of an electrically charged fluid by ion concentration polarization: scaling laws for electroconvective vortices. Phys. Rev. Lett. 110 (11), 114501 (2013).
  5. Rubinstein, I., Zaltzman, B. Electro-osmotically induced convection at a permselective membrane. Phys. Rev. E. 62 (2), 2238-2251 (2000).
  6. Kwak, R., Kim, S., Han, J. Continuous-flow biomolecule and cell concentrator by ion concentration polarization. Anal. Chem. 83 (19), 7348-7355 (2011).
  7. Jeon, H., Lee, H., Kang, K. H., Lim, G. Ion concentration polarization-based continuous separation device using electrical repulsion in the depletion region. Sci.Rep. 3, 3483 (2013).
  8. Kim, S. J., Ko, S. H., Kang, K. H., Han, J. Direct seawater desalination by ion concentration polarization. Nat. Nanotechnol. 5 (4), 297-301 (2010).
  9. MacDonald, B. D., Gong, M. M., Zhang, P., Sinton, D. Out-of-plane ion concentration polarizationfor scalable water desalination. Lab Chip. 14 (4), 681-685 (2014).
  10. Schoch, R. B., Han, J. Y., Renaud, P. Transport phenomena in nanofluidics. Rev.Mod. Phys. 80 (3), 839-883 (2008).
  11. Kim, S. J., Song, Y. A., Han, J. Nanofluidic concentration devices for biomolecules utilizing ion concentration polarization: theory, fabrication, and applications. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 912-922 (2010).
  12. Mai, J. Y., Miller, H., Hatch, A. V. Spatiotemporal mapping of concentration polarization Induced pH changes at nanoconstrictions. ACS Nano. 6 (11), 10206-10215 (2012).
  13. Kim, B., et al. Tunable ionic transport for a triangular nanochannel in a polymeric nanofludic system. ACS Nano. 7 (1), 740-747 (2013).
  14. Mangano Syed, A., Mao, L., Han J, P., Song, Y. -A. Creating sub-50 nm nanofluidic junctions in a PDMS microchip via self-assembly process of colloidal silica beads for electrokinetic concentration of biomolecules. Lab Chip. 14, 4455-4460 (2014).
  15. Wang, Y. C., Stevens, A. L., Han, J. Y. Million-fold preconcentration of proteins and peptides by nanofluidic filter. Anal. Chem. 77 (14), 4293-4299 (2005).
  16. Lee, J. H., Cosgrove, B. D., Lauffenburger, D. A., Han, J. Microfludic concentration-enhanced cellular kinase activity assay. J. Am. Chem. Soc. 131 (30), 10340-10341 (2009).
  17. Cheow, L. F., Han, J. Y. Continuous signal enhancement for sensitive aptamer affinity probe electrophoresis assay using electrokinetic concentration. Anal. Chem. 83 (18), 7086-7093 (2011).
  18. Ko, S. H., et al. Nanofluidic preconcentration device in a straight microchannel using ion concentration polarization. Lab Chip. 12 (21), 4472-4482 (2012).
  19. Gong, M. M., Nosrati, R., Gabriel, M. C. S., Zini, M., Sinton, D. Direct DNA analysis with paper-based ion concentration polarization. J. Am. Chem. Soc. 137 (43), 13913-13919 (2015).
  20. Hong, S., Kwak, R., Kim, W. Paper-based flow fractionation system applicable to preconcentration and field-flow separation. Anal. Chem. 88 (3), 1682-1687 (2016).
  21. Han, S. I., Hwang, K. S., Kwak, R., Lee, J. H. Microfluidic paper-based biomolecule preconcentrator based on ion concentration polarization. Lab Chip. 16, 2219-2227 (2016).
  22. Zangle, T. A., Mani, A., Santiago, J. G. Theory and experiments of concentration polarization and ion focusing at microchannel and nanochannel interfaces. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 1014-1035 (2010).
  23. Mani, A., Bazant, M. Z. Deionization shocks in microstructures. Phys. Rev. E. 84, 061504 (2011).
  24. Slouka, Z., Senapati, S., Chang, H. C. Microfluidic systems with ion-selective membranes. Annu. Rev.Anal. Chem. 7, 317-335 (2014).
  25. Kirby, B. J., Hasselbrink, E. F. Zeta potential of microfluidic substrates: 1. Theory, experimental techniques, and effects on separations. Electrophoresis. 25 (2), 187-202 (2004).
  26. Kwak, R., Kang, J. Y., Kim, T. S. Spatiotemporally defining biomolecule preconcentration by merging ion concentration polarization. Anal. Chem. 88 (1), 988-996 (2016).
  27. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  28. Campbell, D. J., et al. Replication and compression of surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537-541 (1999).
  29. Lee, J. H., Song, Y. A., Han, J. Y. Multiplexed proteomic sample preconcentration device using surface-patterned ion-selective membrane. Lab Chip. 8 (4), 596-601 (2008).
  30. Kwak, R., Guan, G., Peng, W. K., Han, J. Microscale electrodialysis: concentration profiling and vortex visualization. Desalination. 308, 138-146 (2013).
  31. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81, 3022-3028 (2009).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  33. Minerick, A. R., Ostafin, A. E., Chang, H. C. Electrokinetic transport of red blood cells in microcapillaries. Electrophoresis. 23 (14), 2165-2173 (2002).
  34. Phan, D. -T., Shaegh, S. A. M., Yang, C., Nguyen, N. -T. Sample concentration in a microfluidic paper-based analytical device using ion concentration polarization. Sens. Actuators B. 222, 735-740 (2016).
  35. Rubinstein, S. M. Direct observation of a nonequilibrium electro-osmotic instability. Phys. Rev. Lett. 101, 236101 (2008).
  36. Ouyang, W., et al. Microfluidic platform for assessment of therapeutic proteins using molecular charge modulation enhanced electrokinetic concentration assays. Anal. Chem. 88, 9669-9677 (2016).
  37. Cheow, L. F., Sarkar, A., Kolitz, S., Lauffenburger, D., Han, J. Detecting kinase activities from single cell lysate using concentration-enhanced mobility shift assay. Anal. Chem. 86, 7455-7462 (2014).
  38. Chen, C. -H., et al. Enhancing protease activity assay in droplet-based microfluidics using a biomolecule concentrator. J. Am. Chem. Soc. 133, 10368-10371 (2011).
  39. Kwak, R., Pham, V. S., Kim, B., Lan, C., Han, J. Enhanced salt removal by unipolar ion conduction in ion concentration polarization desalination. Sci. Rep. 6, 25349 (2016).

Tags

Bioengineering ion concentratie polarisatie preconcentratiestap ion-exchange membrane overlimiting huidige electro-osmotische flow electro-osmotische instabiliteit
Het samenvoegen van Ion Concentratie polarisatie tussen Naast elkaar Ion Exchange membranen aan de voortplanting van de Polarisatie Zone blokkeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, M., Rhee, H., Kang, J. Y., Kim, … More

Kim, M., Rhee, H., Kang, J. Y., Kim, T. S., Kwak, R. Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone. J. Vis. Exp. (120), e55313, doi:10.3791/55313 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter