Summary
הפרוטוקול עבור קיטוב ריכוז יון רומן (ICP) פלטפורמה שיכולה לעצור את ההתפשטות של אזור ICP, ללא תלות בתנאי ההפעלה מתוארת. יכולת הייחודית זו של הפלטפורמה נמצאת בשימוש של התמזגות דלדול יון והעשרה, שהן שני קטבים של תופעת ICP.
Abstract
קיטוב ריכוז היון (ICP) תופעה באחת מהשיטות השכיחות ביותר preconcentrate דגימות ביולוגיות נמוך שפע. ICP משרה באזור פולשנית עבור ביומולקולות טעונים (כלומר, אזור דלדול יון), ומטרות ניתן preconcentrated על הגבול באזור זה. למרות הופעות preconcentration גבוהות עם ICP, קשה למצוא את תנאי ההפעלה של אזורי דלדול יון הלא ומתפשט. כדי להתגבר על חלון הפעלה הצר הזה, פתחנו לאחרונה פלטפורמה חדשה preconcentration קבוע spatiotemporally. בניגוד שקדם שיטות שרק להשתמש דלדול יון, פלטפורמה זו משתמשת גם הקוטביות ההפוכה של ICP (כלומר, העשרה יון) כדי לעצור את ההתפשטות של אזור דלדול יון. על ידי עימות עם אזור העשרה עם אזור הדלדול, שני האזורים למזג יחד ולעצור. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול הניסוי מפורט לבנות ICP spatiotemporally הגדיר זאת platfORM ולאפיין את דינמיקת preconcentration של הפלטפורמה החדשה על ידי ההשוואה לאלו של המכשיר הקונבנציונלי. פרופילי ריכוז יון איכותיים ותגובות בזמן הנוכחי בהצלחה ללכוד את הדינמיקה השונה בין ICP הממוזגת ואת ICP העצמאי. בניגוד לזו המקובלת שיכול לתקן את מיקום preconcentration רק ב ~ 5 V, הפלטפורמה החדשה יכולה לייצר תוסף מרוכז-יעד במיקום מסוים בטווחים הרחבים של תנאי הפעלה: מתח (0.5-100 V), כוח יוני (1-100 מ"מ), ו- pH (3.7-10.3).
Introduction
יון קיטוב ריכוז (ICP) מתייחס תופעה המתרחשת במהלך עשרת יוני דלדול יונים על קרום permselective, ותוצאה היא ירידה פוטנציאלית נוספת עם מילויים לריכוז יוני 1, 2. מפל ריכוזים זה הוא ליניארי, והוא הופך להיות תלול יותר כמו מתח גבוה מוחל (משטר ohmic) עד לריכוז יוני על הממברנה שואף לאפס (משטר להגביל). בתנאי דיפוזיה מוגבלת זו, שיפוע (ושטף יון המקביל) כבר ידוע להיות מוגדל / רווי 1. מעבר הבנה מקובלת זה, כאשר המתח (או נוכחי) הוא גדל עוד יותר, זרם overlimiting הוא ציין, עם אזורי דלדול שטוחים והדרגות ריכוז חדות מאוד בגבול האזור 1, 3. האזור השטוח יש ריכוז יון נמוך מאוד, אבל הולכת שטח, אלקטרו-osmoti זרימת ג (EOF), ו / או חוסר יציבות האוסמוטי-אלקטרו לקדם שטף יוני להשרות 3 overlimiting הנוכחי, 4, 5. מעניין לציין, כי אזור דלדול השטוח משמש כמחסום אלקטרוסטטי, אשר מסנן 6, 7, 8, 9 ו / או preconcentrates מטרות 10, 11. מאז יש כמות מספקת של יונים להקרין את האשמות השטח של חלקיקים טעונים (עבור electroneutrality סיפוק), החלקיקים לא יכולים לעבור דרך אזור דלדול זה ולכן בשורה ליד גבולה. אפקט ICP הקוי זוהי תופעה גנרית בסוגים שונים של ממברנות 10, 11, 12, 13,> 14 ו גיאומטריות 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; זו הסיבה מדוע חוקרים הצליחו לפתח סוגים שונים של סינון 6, 7, 8, 9 ו preconcentration 10, 11 מכשירים באמצעות קווי ICP.
גם עם גמישות וחוסנם גבוהים כאלה, זה עדיין אתגר מעשי להבהיר את תנאי הפעלה עבור מכשירי ICP הקויים. המשטר קוי של ICP במהירות מסיר קטיונים דרך קרום קטיוני, הגורמת עקירה של אניונים נע לכיוון האנודה. כמכך, אזור הדלדול השטוח מתפשט במהירות, אשר מזכירה התפשטות הלם 22. מאני et al. קרא לזה דינמי deionization (או דלדול) לזעזע 23. כדי preconcentrate מטרות בעמדת חישה מיועדת, למנוע את ההתפשטות של אזור דלדול יון יש צורך, למשל, על ידי החלת EOF או זרימת לחץ מונע נגד הרחבת אזור 24. Zangle et al. 22 הבהיר קריטריוני התפשטות ICP במודל חד ממדי, וזה מאוד תלוי ניידות electrophoretic 17, כוח יוני 18, pH 25, וכן הלאה. זה מצביע על כך תנאי הפעלה תקינים ישתנו בהתאם לתנאי המדגם.
כאן, אנו מציגים תכנון מפורט ופרוטוקולים ניסיוניים עבור פלטפורמת ICP רומן preconcentrates מטרות בתוך spatiotempדרך הפה מוגדר עמדה 26. הרחבת אזור דלדול היון חסומה על ידי אזור עשרת יון, עוזבת תקע preconcentration נייח לעבר עמדה שהוקצתה, ללא תלות בזמן ההפעלה, מתח מיושם, כוח יוני, ו- pH. פרוטוקול וידאו מפורט זה נועד להראות את השיטה הפשוטה לשלב ממברנות קטיוני לתוך מכשירי microfluidic וכדי להדגים את ביצועי preconcentration של פלטפורמת ICP החדשה בהשוואה לזו המקובלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ייצור 1. של חילוף קטיונים ממברנה משולב שבב microfluidic
- הכנת אדוני סיליקון
- עיצוב שני סוגים של אדוני סיליקון: אחד עבור דפוסי שרף קטיוני והשני לבניית microchannel עם polydimethylsiloxane (PDMS).
הערה: גיאומטרית הפרט שתפורט בשלבי 1.3.1 ו 1.4.1. - לפברק מאסטרי סיליקון באמצעות אחת photolithography הקונבנציונלית או יון תגובתי עמוק תחריט 27.
- Silanize המאסטרים סיליקון micropatterned עם trichlorosilane (~ 30 μL) בצנצנת ואקום למשך 30 דקות.
זהירות: trichlorosilane הוא נוזל pyrophoric כי הוא דליק ויש לו רעילות חריפה (שאיפה, בליעה דרך הפה).
- עיצוב שני סוגים של אדוני סיליקון: אחד עבור דפוסי שרף קטיוני והשני לבניית microchannel עם polydimethylsiloxane (PDMS).
- הכנת תבניות PDMS
- מערבבים בסיס אלסטומר סיליקון עם סוכן ריפוי בכל 10: יחס 1 ומניחים את הכוס עם PDMS דפוקה זה(30-40 מ"ל עבור שכפול microstructures על פרוסות סיליקון 4-סיליקון) בצנצנת ואקום במשך 30 דקות כדי להסיר בועות.
הערה: בסיס סיליקון מכיל oligomers siloxane סיום עם קבוצות ויניל זרז פלטינה מבוססת. סוכן הריפוי מכיל crosslinking oligomers שיש שלושה קשרי סיליקון-הידריד 28. - יוצקים את PDMS דפוקה על אדונים סיליקון, להסיר את הבועות באמצעות מפוח, ולרפא את PDMS על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות בתנור הסעה.
- לנתק את PDMS נרפא מן המאסטרים סיליקון כמו שצריך לעצב את PDMS עם סכין (צורות בריבוע, כפי שמוצג-ב איור 2 א, ד).
- מערבבים בסיס אלסטומר סיליקון עם סוכן ריפוי בכל 10: יחס 1 ומניחים את הכוס עם PDMS דפוקה זה(30-40 מ"ל עבור שכפול microstructures על פרוסות סיליקון 4-סיליקון) בצנצנת ואקום במשך 30 דקות כדי להסיר בועות.
- דפוסי הקרומים קטיוני
- חותך חצי עובש PDMS בניצב לשני microchannels המקביל מחוררים בקצות ערוצי PDMS עם ביופסית 2.0 מ"מ.
הערה: עובש PDMS עבור patterning הממברנה קטיון סלקטיבית יש שתי בנותallel microchannels (רוחב: 100 מיקרומטר; גובה: 50 מיקרומטר; המרחק interchannel: 100 מיקרומטר; איור 1 א). הצורה המקורית של העובש שניתן לדמיין ידי שיקוף העובש הפרוס לאורך קו החיתוך. microchannels בצורת L המומלצים על חבטות שני החורים ללא חפיפה. - נקה שקופית זכוכית עובש PDMS עם קלטת מפוח ולשים את התבנית על גבי שקופיות הזכוכית כדי ליצור קובץ מצורף הפיך ביניהם.
- על פי טכניקת דפוסי microflow 29, שחרור ~ 10 μL של שרף קטיוני בסוף הפתוח של הערוץ היה פרוס בשלב 1.3.1 (איור 1b). מניח את ראש המזרק על חורי האגרוף ולמשוך את הבוכנה (חיצים שחורים באיור 1b); לחץ שלילי עדין ימשוך שרף קטיוני, ואת השרף ימלא את שני ערוצים.
הערה: מומלץ כי גובה של microchannel בשיעור העולה על 1581; מ ', בגלל הצמיגות הגבוהה של השרף דורשת בלחץ גבוה כדי למלא את הערוצים. מצד השני, עדיף כי הגובה אינו עולה על 100 מיקרומטר, כי הממברנה סלקטיבית היון בדוגמת תהפוך עבה יותר 1 מיקרומטר; כזה קרום עבה עשוי ליצור פער בין הממברנה ואת PDMS ערוץ 13. - לנתק את תבנית PDMS בלי לגעת השרף בדוגמת במקום להחליק זכוכית על הדוד ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות להתאדות ממס השרף.
הערה: עובי הקרום בדוגמת הוא בדרך כלל פחות מ <1 מיקרומטר. העובש הוא מנותק בעדינות על ידי להתלות את התבנית לצד הפתוח (הקו המקווקו חץ באיור 1b). עדיף לנתק את התבנית פחות מ 1 דקות לאחר מילוי השרף. אם העובש מנותק כמה דקות מאוחר יותר, ממברנות עבות יכולות להיות מושגות, אבל הם יצטרכו צורה קעורה בשל השפעת הנימים. - קלף את המיותרתחלק הממברנה בדוגמת עם סכין גילוח, מה שהופך שני דפוסי קו פרודים (איור 1 ג ').
הערה: חומר קטיוני משמש כאן יש perfluorinated קבוצות, כלומר התבנית לא מלוכד בחריפות את הכוס. לכן, השיטה blading פשוט יכול להסיר את החלק מיותר בקלות של הממברנה.
- חותך חצי עובש PDMS בניצב לשני microchannels המקביל מחוררים בקצות ערוצי PDMS עם ביופסית 2.0 מ"מ.
- אינטגרציה של microchannel ואת המצע בדוגמת-קרום
- פאנץ שני חורים בקצות microchannels ועוד שני חורים שבהם דפוסי קרום ימוקם לאחר מליטה את ערוץ PDMS למצע בדוגמת קרום מפוברק בשלב 1.3.
הערה: microchannel PDMS יש ערוץ אחד (רוחב: 50-100 מיקרומטר; גובה: 10 מיקרומטר), אך הוא קשור הקצים (1D האיור) הערוץ השכן. - איגרות החוב microchannel PDMS למצע בדוגמת קרום מיד לאחר הטיפול פלזמה חמצן במשך 40 שניות ב -100 W ו- 50 mTorr.
הערה: מניח את הקרום בדוגמת בניצב על באמצע microchannel.
- פאנץ שני חורים בקצות microchannels ועוד שני חורים שבהם דפוסי קרום ימוקם לאחר מליטה את ערוץ PDMS למצע בדוגמת קרום מפוברק בשלב 1.3.
2. ICP Preconcentration
- הכנה הניסוי
- הכינו פתרונות הבדיקה השונות, כולל 1-100 KCl מ"מ, 1 מ"מ NaCl (pH ~ 7), תערובת של 1 מ"מ NaCl ו -0.2 מ"מ HCl (pH ~ 3.7), תערובת של 1 מ"מ NaCl ו -0.2 מ"מ NaOH (pH ~ 10.3), ואת פוספט שנאגר מלוחים 1x.
- הוספת צבע פלואורסצנטי טעון שלילי (~ 1.55 מיקרומטר) כדי פתרונות הבדיקה.
הערה: הריכוז של הצבע הוסיף צריכה להיות נמוכה בהרבה מזה של יוני מלח (<10 מיקרומטר) כך הצבעים הטעונים לא לתרום 30 זרם חשמלי, 31. - טען את הפתרון המדגם במאגר אחד של הערוץ להפעיל לחץ שלילי למאגר האחר כדי למלא את הערוץ עם הפתרון. חיבור שני המאגרים hydrodynamically ידי releasing טיפה גדול כדי לחסל את הפרש לחצים לאורך ערוץ (איור 2 א).
- מלאו את שני מאגרי מים, אשר מחוברים דפוסי קטיוני, עם תמיסות בופר (1 M KCl או 1 M NaCl) באמצעות מזרק או pipet כדי לפצות על ההשפעה ICP במאגרים.
- מניח את החוטים על מאגרי המים, על פני שני הקרומים בדוגמת (האנודה על המאגר ואת קתודת השמאל מימין), ולחבר אותם עם יחידת מדידת מקור (איור 2 א).
- ויזואליזציה של התופעה ICP ו ICP preconcentration
- טען את מכשיר ICP על מיקרוסקופ epifluorescence הפוך. החלת מתח (0.5100 V) ולמדוד את התגובה הנוכחית עם יחידת מדידת מקור.
- צלמו תמונות ניאון עם המצלמה במכשיר תשלום מצמידים ולנתח את עוצמת פלורסנט באמצעות תוכנת הדמיה 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלבי ייצור סכמטי של preconcentrator microfluidic משולב-קרום מוצגים באיור 1. תיאור מפורט של הייצור ניתן בפרוטוקול. העיצובים ותמונות התקן של preconcentrator מוגדר spatiotemporally 26 הם בניגוד לאלה של קונבנציונאלי preconcentrator 11 (איור 2). תופעת ICP ב preconcentrator המוגדר spatiotemporally נחקרה מבחינת תגובות נוכחי מתח בזמן ופרופילים עוצמים פלורסנט (איור 3-4). דומה לתופעת ICP עם חד הממברנה preconcentrator 3, 11, שלושה משטרים שונים (ohmic, הגבלה, ו overlimiting) נצפו עקומת המתח הנוכחי: 0.5-1 V (ohmic והגבלה) ו -5 V (overlimiting) . עם זאת, התאוששות נוכחית לא קונבנציונלית הייתהזוהה בעקום הנוכחי-זמן כמו העשרת יון ואת אזורי דלדול יון התמזגו. בשלב הבא, preconcentration ICP נבדק בזמנים במתחים שונים עם preconcentrator המוגדר spatiotemporally (איור 5) והמכשיר חד הממברנה הקונבנציונלי (איור 6). דינמיקת preconcentration כומתו על ידי תמונות קרינה, תגובות נוכחיות אמת, וגרפים עוצמים פלורסנט פני מרחקים וזמנים שונים. כאשר משווים את שתי פלטפורמות, פלטפורמה ICP חדש מראה יתרון תמיד אוסף מטרות (צבעי ניאון) בין דפוסי קרום בררני שני קטיון. בנוסף, הוא אשר כי תקע preconcentration נשאר זהה עוצמות יוניות שונות (1-100 המ"מ NaCl) וערכי pH (3.7-10.3), המאשר את הזמינות הגבוהה של preconcentrator ICP המתמזג בטווחים רחבים של תנאי הפעלה (איור 7). באיור 8, preconcentr חלבון 10,000 פיגם ation הודגם.
איור 1. צעדי המצאה של קטיוני שבב microfluidic קרום משולב. לאחר עובש PDMS מתמלא שרף קטיוני בטכניקת דפוסי microflow (א - ג) 29, מצע בדוגמת הזכוכית-הקרום הוא ערובה עם microchannel PDMS ידי טיפול פלזמת חמצן (ד). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שרטוטים של preconcentrator המוגדר spatiotemporally (א) ו- preconcentrator הקונבנציונלי (ב). (א) הדואר פלטפורמה חדשה, בין שני דפוסים הממברנה (i), דלדול יון / אזורי העשרת המפותחים התמזגו יחד עם ליניארי (ohmic והגבלת שלטון; ii) או קוי (overlimiting משטר; iii) פרופילי ריכוז. בכל שלושת המשטרים הנוכחיים, אובניים אזור עשרת יון ההתפשטות של אזור הדלדול ויעדים (עיגולים חלולים; i) הם preconcentrated על הממשק של אזורי הדלדול והעשרת יון (מעוקל, קו מקווקו; i). הקיר של ערוץ PDMS טעון שלילית, וזה מייצר תזרים אלקטרו-האוסמוטי (EOF) בין ממברנות חילופי שני קטיון תחת שדה חשמלי. EOF מספק מטרות ללא הפסקה לכיוון הממשק של אזורי דלדול והעשרה. (ב) בשנת הפלטפורמה הקונבנציונלית, רק באזור דלדול היון מפותח ליד הממברנה עם ליניארי (ohmic והגבלת שלטון; ii) ו קוי (overlimiting משטר; iii) הדרגתי ריכוז. כמו EOF מספק את המטרות, אל preconcentrationכך מתרחש בגבול דלדול אזור, אך אזור זה (ואת תקע preconcentrated) מתרחק מן הקרום קטיוני (חץ שחור; i). יצוין, כי אין עלייה בריכוז היון כאן ללא אזור עשרת יון (II-III). ב (ab), תמונות המכשיר מוצגות (iv). C 0 מייצג את ריכוז היון הראשוני. V + ו- G לציין את האנודה ואת הקתודה, בהתאמה. נדפס מן 26T הפניה באישור האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מוזג תופעת ICP בין שני קרומים קטיוני. (א) העקומה הנוכחי המתח מראה שלושה regim ברוריםes (ohmic, הגבלה, ו overlimiting). התגובה הנוכחית נמדדה על ידי ramping את המתח במרווחים דיסקרטיים של 0.25 V כל 40 שניות, אשר חוזרות על עוצמה שלוש פעמים. הבר שגיאה מציין את סטיית התקן של התגובות הקיימות. (ב, ג) השלושה המשטרים, תמונות קרינה (ב) ופרופילים עוצמים יחד AA 'באמצע התעלה (ג) התקבלו. תיבות צהובות, מנוקדות לציין את מיקומם של ממברנות סלקטיבי קטיון. פתרון 1 KCl מ"מ עם 1.55 מיקרומטר (1 מיקרוגרם / מ"ל) צבע פלואורסצנטי טעונים שלילית היה בשימוש. נדפס מן ההפניה 26 באישור האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4.
איור 5. spatiotemporally קבוע preconcentration ב 5, 10, ו -20 V. (א - ג) תמונות הקרינה של ICP התמזגה והתגובות-השעה הנוכחית (ד - ו) לאורך זמן (0-100 ים). הקווים הצהובים, מנוקד לציין את המיקום של ממברנות קטיוני. (ז) פרופילים עוצמים פלורסנט זמן לשגות הם זממו לאורך microchannel (AA '). עוצמות השיא להגדיל ככל שחולף הזמן, עם במקומות קבועים. (ח) לקפל עוצמת שיא (כלומר, כמה פעמים יותר מאשר עוצמת פלורסנט הראשוני). במתח גבוה יותר, מהר יותר EOF מספק מטרות לקראת הממשק של אזורי הדלדול והעשרת יון, ולכן מגביר מהירות preconcentration. ספייק ב 20 V הוא מושרה על ידי הלם הדלדול (
תופעת ICP איור 6. ב preconcentrator ICP הקונבנציונלי ב 5, 10, ו -20 V. (א - ג) תמונות קרינה של אזור דלדול יון ואת התגובה הנוכחית האמת (ד - ו) לאורך זמן (0-100 הים). הפצת אזור הדלדול ואת תקע preconcentration היא דמיינה בבירור תמונות הקרינה. בהתאם לכך, המערבולות אינן מוגבלות, כך ההתאוששות הנוכחית אינה מתרחשת, גם במשטר overlimiting. קווי זהב, מנוקדים לסמן את המיקום של ממברנות קטיוני. (ז) פרופילים עוצמים פלורסנט זמן לשגות הם זממו לאורך microchannel (AA '). עוצמות השיא להגדיל ככל שחולף הזמן, אך המיקום מתרחק מן הקרום. (ח) שיא פי עוצמת מכשיר ICP הקונבנציונלי. בניגוד למכשיר ICP הממוזג (איור 5 שעות), אין ספייק עוצמת ללא הכליאה של אזורי ICP, כי עוצמת הניאון מוגברת כפי שהצבע היה preconcentrated. הגידול של tהוא לשיא של פי עוצמת דומה לזה של מכשיר ICP התמזגה בעת ובעונה אחת (במתח נתון). זה מצביע על כך את משך הזמן שתקע preconcentrated מוחזק במקום חיוני לביצועי preconcentration. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. spatiotemporally מוגדר preconcentration בעוצמות יוניים שונים (1-100 מ"מ NaCl) וערכים pH (3.7-10.3). (א) תמונות הקרינה המתקבל לאחר 100 שניות של המבצע ב -50 V. כפי שניתן לראות, את המיקומים של אטמי preconcentration עדיין בין ממברנות חילופי שני קטיון (צהוב, קווים מקווקווים), למרות עוצמת נחלשת תחת גבוה יוניים כוח בתוך חומצי או בסיסי חזקיםפִּתָרוֹן. (ב, ג) מיקומו של עוצמת שיא פי עוצמתו (כלומר., כמה פעמים יותר מאשר עוצמת הראשונית), ממופה מתחת לגיל 10, 20, 50, ו -100 V. עבור מצב יחיד (1, 10, 100 מ"מ ו / או 3.7 pH, 7, ו -10), יש ארבע נקודות הנתונים המתאימים לארבעת התנאים מתח. במתח גבוה, יש פסגה גבוהה יותר להגביר לקפל בכל המקרים. 100 V לא נבדקו 1 mM NaCl (pH 7) בגלל עוצמת השיא כבר נגעה הערכים הגבוהים ביותר (בשל הרוויה של המצלמה) ב -50 V. מהפרופיל העוצם שיא, באזור השיא מזוהה גם, עם 1 % מתחת עוצמת השיא, המיוצגת על ידי סרגלי שגיאות (ב, ג). מתח גבוה לבין חזק EOF מסיט את מיקומו השיא ימינה, עם קפל בעצמה גבוה יותר ואת תוספת preconcentration חדה. תיבות אפורות לציין את מיקומם של ממברנות קטיוני. המרחק 0 (א) מייצג את מקורו של ציר x (b, c), שהינהעל הקצה הימני של קרום קטיוני שמאל. מקורו של המרחק הוא הקצה הימני של הקרום עזב. נדפס מן ההפניה 26 באישור האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8. הפגנה של preconcentration חלבון קבוע spatiotemporally. FITC-אלבומין (1 מיקרוגרם / מ"ל) ב תמיסת מלח פוספט שנאגרו 1x היה בשימוש. 0.1% Tween 20 נוסף גם למנוע מחייב ספציפי. מאז preconcentration מושג בקושי בכל כוח יוני גבוה (איור 7), הכפלנו את רוחב דפוס Nafion (200 מיקרומטר) ומשמש ערוץ PDMS צר (50 מיקרומטר). בדרך זו, את הביצועים של preconcentration ICP הועצם על ידיהרחבת מסלול היון והפחתת הסכום המוחלט של יונים בערוץ. במכירה מתח להחיל של 100 וולט, השיא והעמידה ממוצעים בעוצמות פלורסנט אותרו בתוך קופסה לבנה, מנוקד, שבו הוא האזור בין ממברנות חילופי שני קטיון. בתוך 10 דקות של פעולה, החלבונים היו preconcentrated עד 10 מ"ג / מ"ל (שיא) ו ~ 0.1 מ"ג / מ"ל (בממוצע), המציין 10,000 ו preconcentrations פי 100, בהתאמה. תמונות קרינת ההבלעה התקבלו ב 0, 10, ו -20 דקות. בעבודה זו, מבצע 20 דקות היה מספיק כדי preconcentrate מולקולות היעד, ולכן אנחנו לא לכסות יותר פעמי הפעלה. נדפס מן ההפניה 26 באישור האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תארנו פרוטוקול הייצור ואת הביצועים של preconcentrator המוגדר spatiotemporally במגוון של המתח המיושם (0.5-100 V), כוח יוני (1-100 מ"מ), ו- pH (3.7-10.3), השגתי 10,000 פי preconcentration של צבעים וחלבון בתוך 10 דקות. כמו כמו התקני ICP קודמים, לתפקוד preconcentration הופך להיות טוב יותר במתח גבוה יותר ובמחיר הכח יוני נמוך. אחת פרמטר נוסף אנחנו יכולים לשקול כאן הוא המרחק בין שני קרומים קטיוני. אם נגדיל את מרחק הקרום-יתר, השדה החשמלי פוחת באותם מתח המיושם, וכתוצאה מכך הירידה של מהירות preconcentration 26.
טכניקת דפוסי microflow 29 המשמשת בעבודה זו היא שיטה חזקה שרפי חילוף קטיון דפוסים, אז זה כבר באחת משיטות תקן זהב עבור שילוב חומרי חילוף היונים לתוך מערכות microfluidic. Nevertheless, יש צורך לפברק שתי ממברנות קטיוני חופפים עם מרחק intermembrane קצר (קטן יותר מאשר כמה מאות מיקרומטרים). בצעדים 1.3.3-1.3.4, שרף קטיוני נמצא בשלב נוזלי. לכן, שרפו בשנתי microchannels ניתן התמוטט, וירידת השרף הנותרת בסוף הפתוח של הערוצים גם יכולה להציף במהלך ניתוק העובש (שלב 1.3.4.). כדי לבנות שתי ממברנות קטיוני עם נאמנות דפוס גבוה, השתמשנו השרף עם צמיגות גבוהה יחסית (20% של החומר קטיוני ב הממסים) ולהגדיר את תהליך ההתרחקות בזהירות עם כיוון ניתוק מיועד.
למרות הגמישות התפעולית הגבוהה של הפלטפורמה הזו הודגמה, הקורא יכול להיות מודאג לגבי קביעת התנאים האופטימליים מתוך המגוון הרחב בתוך חלון ההפעלה. אחת trade-off המייצג בין מהירות preconcentration ואת היציבות של אפקט ICP. סריקהלראות באיור 5 ב ואח 'קוואק. 26, מתח מיושם גבוה (> 50 V) יכולים להתעבות מטרות במהירות; עם זאת, זה גם גורם מערבולות חזקות באזור דלדול (1 מ"מ / pH 7 באיור א 7), אשר מקטין את היציבות של המדגם preconcentration. לפיכך, את מהירות preconcentration הופכת קשה לנבא 33. בשלב הנוכחי, אנו ממליצים תנאי הניסוי עם מתח נמוך יחסית (<30 V) וכוח יוניים (<10 מ"מ) עבור preconcentration יציב, צפוי וכן spatiotemporally קבוע. תחלופה-זה בין מהירות preconcentration ואת היציבות של תקע preconcentrated גם קשורה למקורות ICP הקוי (הולכת שטח, EOF, וחוסר יציבות האוסמוטי-אלקטרו). המקור העיקרי של ICP הקוי במתח קטן יחסית (<50 V) הוא EOF, יצירת זוג מערבולת קוהרנטית באזור הדלדול (איור 3 ב), אשר leמודעות על preconcentration יציב. במתח גבוה יחסית (> 50 V), המקור העיקרי של ICP הקוי משתנה אלקטרו-האוסמוטי חוסר יציבות, וכתוצאה מכך מערבולות מרובות כאוטי, אשר להקטין את היציבות של preconcentration.
לאחרונה, פלטפורמות ICP מבוססי נייר פותחו על ידי פאן et al. 34, גונג et al. 19, והאן et al. 21. מכשירי נייר אלה עם מבני microporous יכולים לדכא אי יציבות אלקטרו-האוסמוטי 4, 35 ו להקל על בעית היציבות. עם זאת, הגדלים של ערוצי נייר בדרך כלל על 0.5-5 מ"מ, שהוא הרבה יותר גדול ערוץ microfluidic קונבנציונאלי. הרחב זה ערוץ נייר עם רשתות סיבים אקראיות גורם תנועות חריגות תקעי preconcentrated. זה כבר בלתי נמנע preconcentrators ICP מבוסס נייר, כיוון שזו תכונת המינימוםגודל חיתוך נייר דפוסים ושעווה (כלומר, שיטות ייצור לבנות ערוצי נייר) הוא על כמה מאות מיקרומטרים.
Preconcentrator ICP נעשה שימוש במגוון רחב של פלטפורמות biomicrofluidic עבור preconcentrating-סוכנים ביו שונים; הגברת האותות של מבחנים שונים; ואת גילוי מטרות, כגון חלבונים תרופתיים 36, פפטידים 37, aptamers 17, ואנזימים 38. עבודות קודמות אלו ממוקדות ביומולקולות שכותרתו פלואורסצנטי. הסיבה לכך היא כי אנחנו לא יכולים לציין את תנאי הפעלה המדויקים (כלומר, מתח וספיקה) כדי לשמר את אתר preconcentration, ולכן אנחנו צריכים קודם כל למצוא את התנאים המתאימים עבור מטרות preconcentrator. יוצא מהעבודה קודמת, תופעת ICP הממוזגת מאפשרת לנו תמיד כדי לתקן את מצתי preconcentrated בטווח רחב של תנאי הפעלה תוך שמירה על הגמישות הגבוהה שלהתקני ICP. לדוגמא, אנו יכולים לווסת את מערכת ICP התמזגה עם זרימת נוזל משיקה, ולהפעיל אותו במצב הזרימה הרציפה 39. זה מצביע על כך שאנו יכולים כעת להרחיב את היישומים של preconcentrators ICP לתייג ללא שיטות לזיהוי ללא שימוש במכשירים להדמית קליעים נותבים. יתרון ייחודי זה של יכולת השליטה spatiotemporal מספק הזדמנות מסחרית חזקה לשלב את מכשיר ICP עם פלטפורמות המעבדתיים גנריות, כגון מכונית תגובת שרשרת פולימראז ספקטרומטרים ההמוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | ||
| Trichlorosilane | Sigma Aldrich | 175552 | Highly toxic |
| Nafion perfluorinated resin, 20 wt% | Sigma Aldrich | 527122 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 71394 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | 60121 | |
| Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20000 | |
| Isothiocyanate-conjugated albumin | Sigma Aldrich | A9771 | |
| Phosphate buffer saline, 1x | Wengene | LB004-02 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | IX-71 | |
| Charged-coupled device camera | Hamamtsu Co. | ImageEM X2 | |
| Source measurement unit | Keithley Instruments | 2635A | |
| Covance-MP | Femto Science |
References
- Probstein, R. F. Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction. , Wiley-Interscience. New York. (2003).
- Strathmann, H. Ion-Exchange Membrane Separation Processes. , Elsevier. Amsterdam. (2004).
- Dydek, E. V., et al.
- Kwak, R., Pham, V. S., Lim, K. M., Han, J. Y. Shear flow of an electrically charged fluid by ion concentration polarization: scaling laws for electroconvective vortices. Phys. Rev. Lett. 110 (11), 114501 (2013).
- Rubinstein, I., Zaltzman, B. Electro-osmotically induced convection at a permselective membrane. Phys. Rev. E. 62 (2), 2238-2251 (2000).
- Kwak, R., Kim, S., Han, J. Continuous-flow biomolecule and cell concentrator by ion concentration polarization. Anal. Chem. 83 (19), 7348-7355 (2011).
- Jeon, H., Lee, H., Kang, K. H., Lim, G. Ion concentration polarization-based continuous separation device using electrical repulsion in the depletion region. Sci.Rep. 3, 3483 (2013).
- Kim, S. J., Ko, S. H., Kang, K. H., Han, J. Direct seawater desalination by ion concentration polarization. Nat. Nanotechnol. 5 (4), 297-301 (2010).
- MacDonald, B. D., Gong, M. M., Zhang, P., Sinton, D. Out-of-plane ion concentration polarizationfor scalable water desalination. Lab Chip. 14 (4), 681-685 (2014).
- Schoch, R. B., Han, J. Y., Renaud, P. Transport phenomena in nanofluidics. Rev.Mod. Phys. 80 (3), 839-883 (2008).
- Kim, S. J., Song, Y. A., Han, J. Nanofluidic concentration devices for biomolecules utilizing ion concentration polarization: theory, fabrication, and applications. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 912-922 (2010).
- Mai, J. Y., Miller, H., Hatch, A. V. Spatiotemporal mapping of concentration polarization Induced pH changes at nanoconstrictions. ACS Nano. 6 (11), 10206-10215 (2012).
- Kim, B., et al. Tunable ionic transport for a triangular nanochannel in a polymeric nanofludic system. ACS Nano. 7 (1), 740-747 (2013).
- Mangano Syed, A., Mao, L., Han J, P., Song, Y. -A. Creating sub-50 nm nanofluidic junctions in a PDMS microchip via self-assembly process of colloidal silica beads for electrokinetic concentration of biomolecules. Lab Chip. 14, 4455-4460 (2014).
- Wang, Y. C., Stevens, A. L., Han, J. Y. Million-fold preconcentration of proteins and peptides by nanofluidic filter. Anal. Chem. 77 (14), 4293-4299 (2005).
- Lee, J. H., Cosgrove, B. D., Lauffenburger, D. A., Han, J. Microfludic concentration-enhanced cellular kinase activity assay. J. Am. Chem. Soc. 131 (30), 10340-10341 (2009).
- Cheow, L. F., Han, J. Y. Continuous signal enhancement for sensitive aptamer affinity probe electrophoresis assay using electrokinetic concentration. Anal. Chem. 83 (18), 7086-7093 (2011).
- Ko, S. H., et al. Nanofluidic preconcentration device in a straight microchannel using ion concentration polarization. Lab Chip. 12 (21), 4472-4482 (2012).
- Gong, M. M., Nosrati, R., Gabriel, M. C. S., Zini, M., Sinton, D. Direct DNA analysis with paper-based ion concentration polarization. J. Am. Chem. Soc. 137 (43), 13913-13919 (2015).
- Hong, S., Kwak, R., Kim, W. Paper-based flow fractionation system applicable to preconcentration and field-flow separation. Anal. Chem. 88 (3), 1682-1687 (2016).
- Han, S. I., Hwang, K. S., Kwak, R., Lee, J. H. Microfluidic paper-based biomolecule preconcentrator based on ion concentration polarization. Lab Chip. 16, 2219-2227 (2016).
- Zangle, T. A., Mani, A., Santiago, J. G. Theory and experiments of concentration polarization and ion focusing at microchannel and nanochannel interfaces. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 1014-1035 (2010).
- Mani, A., Bazant, M. Z.
- Slouka, Z., Senapati, S., Chang, H. C. Microfluidic systems with ion-selective membranes. Annu. Rev.Anal. Chem. 7, 317-335 (2014).
- Kirby, B. J., Hasselbrink, E. F. Zeta potential of microfluidic substrates: 1. Theory, experimental techniques, and effects on separations. Electrophoresis. 25 (2), 187-202 (2004).
- Kwak, R., Kang, J. Y., Kim, T. S. Spatiotemporally defining biomolecule preconcentration by merging ion concentration polarization. Anal. Chem. 88 (1), 988-996 (2016).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Campbell, D. J., et al. Replication and compression of surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537-541 (1999).
- Lee, J. H., Song, Y. A., Han, J. Y. Multiplexed proteomic sample preconcentration device using surface-patterned ion-selective membrane. Lab Chip. 8 (4), 596-601 (2008).
- Kwak, R., Guan, G., Peng, W. K., Han, J. Microscale electrodialysis: concentration profiling and vortex visualization. Desalination. 308, 138-146 (2013).
- Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81, 3022-3028 (2009).
- Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
- Minerick, A. R., Ostafin, A. E., Chang, H. C. Electrokinetic transport of red blood cells in microcapillaries. Electrophoresis. 23 (14), 2165-2173 (2002).
- Phan, D. -T., Shaegh, S. A. M., Yang, C., Nguyen, N. -T. Sample concentration in a microfluidic paper-based analytical device using ion concentration polarization. Sens. Actuators B. 222, 735-740 (2016).
- Rubinstein, S. M. Direct observation of a nonequilibrium electro-osmotic instability. Phys. Rev. Lett. 101, 236101 (2008).
- Ouyang, W., et al. Microfluidic platform for assessment of therapeutic proteins using molecular charge modulation enhanced electrokinetic concentration assays. Anal. Chem. 88, 9669-9677 (2016).
- Cheow, L. F., Sarkar, A., Kolitz, S., Lauffenburger, D., Han, J. Detecting kinase activities from single cell lysate using concentration-enhanced mobility shift assay. Anal. Chem. 86, 7455-7462 (2014).
- Chen, C. -H., et al. Enhancing protease activity assay in droplet-based microfluidics using a biomolecule concentrator. J. Am. Chem. Soc. 133, 10368-10371 (2011).
- Kwak, R., Pham, V. S., Kim, B., Lan, C., Han, J. Enhanced salt removal by unipolar ion conduction in ion concentration polarization desalination. Sci. Rep. 6, 25349 (2016).
