Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone

Published: February 23, 2017 doi: 10.3791/55313
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1
1Center for BioMicrosystems, Korea Institute of Science and Technology, 2Department of Mechanical Engineering, Seoul National University, 3Department of Industrial Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign

Summary

Das Protokoll für eine neuartige Ionenkonzentrationspolarisation (ICP) Plattform, die die Ausbreitung der ICP Zone stoppen kann, unabhängig von den Betriebsbedingungen beschrieben. Diese einzigartige Fähigkeit der Plattform liegt in der Verwendung von Ionenerschöpfungs und Anreicherung verschmelzenden, die zwei Polaritäten des ICP Phänomen sind.

Abstract

Die Ionenkonzentrationspolarisation (ICP) Phänomen ist einer der vorherrschenden Methoden Niedrigfluss biologischen Proben vorzukonzentrieren. Die ICP induziert eine noninvasive Region für geladene Biomoleküle können (dh die Ionenverarmungszone) und Targets auf dieser Bereichsgrenze vorkonzentriert werden. Trotz der hohen preconcentration Auftritte mit ICP, ist es schwierig, die Betriebsbedingungen der Nichtausbreitungsionenverarmungszonen zu finden. Um diesen engen Arbeitsfenster zu überwinden, haben wir vor kurzem eine neue Plattform für räumlich-zeitlich fixiert preconcentration. Im Gegensatz zu Verfahren , die nur vorhergehenden Ionenabreicherungskammern verwenden, diese Plattform verwendet auch die entgegengesetzte Polarität der ICP (dh Ionenanreicherungs) , um die Ausbreitung der Ionenverarmungszone zu stoppen. Durch die Konfrontation mit der Anreicherungszone mit der Verarmungszone, verschmelzen die beiden Zonen miteinander und zu stoppen. In diesem Papier beschreiben wir ein ausführliches Versuchsprotokoll dieses räumlich-zeitlich definiert ICP Plattf zu bauenorm und die Vorkonzentration Dynamik der neuen Plattform charakterisieren indem man sie mit denen der herkömmlichen Vorrichtung verglichen wird. Qualitative Ionenkonzentrationsprofile und aktuelle Zeit Antworten erfolgreich erfassen die unterschiedliche Dynamik zwischen der fusionierten ICP und der Stand-alone-ICP. Spannung (0,5 bis 100 V), der Ionenstärke: Im Gegensatz zu den herkömmlichen, die die preconcentration Lage nur ~ 5 V beheben können, kann die neue Plattform eine ziel kondensiert Stecker an einer bestimmten Stelle in den weiten Bereichen der Betriebsbedingungen erzeugen (1-100 mM) und pH (3,7 bis 10,3).

Introduction

Ionenkonzentrationspolarisation (ICP) bezieht sich auf ein Phänomen , das während der Ionenanreicherungs und Ionenverarmungs auf einer permselektiven Membran auftritt, was zu einem zusätzlichen Spannungsabfall mit Ionen Konzentrationsgradienten 1, 2. Dieser Konzentrationsgradient ist linear, und es wird steiler als eine höhere Spannung (Ohmsche Regime), bis die Ionenkonzentration auf der Membran aufgebracht wird, gegen Null geht (Begrenzungsregelung). An dieser diffusionsbegrenzten Zustand, der Gradient (und entsprechende Ionenfluß) ist bekannt, 1 maximiert / gesättigt. Jenseits dieser herkömmlichen Verständnis, wenn die Spannung (oder Strom) weiter erhöht wird, wird ein overlimiting Strom beobachtet, mit flachen Verarmungszonen und sehr scharfe Konzentrationsgradienten an der Zonengrenze 1, 3. Die flache Zone hat eine sehr niedrige Ionenkonzentration, aber mit Oberflächenleitfähigkeit, elektro-osmoti c Strömung (EOF), und / oder elektroosmotischen Instabilität Ionenfluss fördern und ein overlimiting Strom 3, 4, 5 induzieren. Interessanterweise dient die flache Verarmungszone als eine elektrostatische Barriere, die 6 herausfiltert, 7, 8, 9 und / oder Vorkonzentraten 10 Ziele, 11. Da es eine unzureichende Menge an Ionen ist, die Oberflächenladungen von geladenen Teilchen (für die Befriedigung der Elektro) zu screenen, können die Partikel nicht durch diese Verarmungszone passieren und deshalb an seiner Grenze ausrichten. Diese nichtlineare ICP - Effekt ist ein Phänomen generic in verschiedenen Arten von Membranen 10, 11, 12, 13,> 14 und Geometrien 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; Dies ist , warum Forscher verschiedene Arten von Filtrations 6, 7, 8, zu entwickeln , konnten 9 und preconcentration 10, 11 Geräte , die nicht - lineare ICP.

Selbst mit so hoher Flexibilität und Robustheit, ist es immer noch eine praktische Herausforderung, die Betriebsbedingungen für die nichtlinearen Vorrichtungen ICP zu klären. Die nichtlinearen Bereich des ICP entfernt schnell Kationen durch einen Kationenaustauschmembran, die die Verschiebung von Anionen in Richtung der Anode bewirkt, bewegt. Als einDadurch breitet sich die flache Verarmungszone schnell, was Schockausbreitung 22 erinnert. Mani et al. genannt 23 schocken diese Dynamik der Entionisierung (oder Erschöpfung). Auf Ziele in einer bestimmten Abtastposition vorzukonzentrieren, die Ausdehnung des Ionenverarmungszone verhindern , ist erforderlich, beispielsweise um 24 EOF oder druckbetriebenen Anströmung des Expansionszone aufgebracht wird . Zangle et al. 22 verdeutlicht die Kriterien für ICP Ausbreitung in einem eindimensionalen Modell, und es hängt in hohem Maße von der elektrophoretischen Mobilität 17, der Ionenstärke 18, pH 25, und so weiter. Dies zeigt an, dass die richtige Betriebsbedingungen werden entsprechend den Probenbedingungen verändert werden.

Hier präsentieren wir detaillierte Design und experimentelle Protokolle für eine neue ICP-Plattform, die Ziele innerhalb eines spatiotemp Vorkonzentratenoral definierte Position 26. Die Expansion der Ionenverarmungszone wird durch die Ionenanreicherungszone blockiert, ein stationäres preconcentration Stecker an eine zugewiesene Position zu verlassen, und zwar unabhängig von der Betriebszeit, der angelegten Spannung, der Ionenstärke und pH. Diese detaillierte Videoprotokoll soll die einfachste Methode, um zu zeigen, Kationenaustauschmembranen in mikrofluidischen Vorrichtungen zu integrieren und die Vorkonzentration Leistung der neuen ICP-Plattform im Vergleich zu dem herkömmlichen zu demonstrieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Herstellung von Kationenaustauschermembran-integrierten mikrofluidischen Chips

  1. Herstellung von Silizium - Meister
    1. Design zwei Arten von Silizium-Mastern: eine für Strukturieren eines Kationenaustauscherharzes und die andere für den Aufbau eines Mikrokanals mit Polydimethylsiloxan (PDMS).
      HINWEIS: Die Detailgeometrie wird in den Schritten 1.3.1 und 1.4.1 beschrieben.
    2. Fabrizieren die Silizium - Master entweder durch herkömmliche Photolithographie oder Deep Reactive Ion Etching 27 verwendet wird .
    3. Silanisieren die mikrostrukturierten Silizium Meister mit Trichlorsilan (~ 30 & mgr; l) in einem Vakuumgefäß 30 min.
      ACHTUNG: Trichlorsilan ist eine pyrophore Flüssigkeit , die leicht entflammbar und hat eine akute Toxizität (Inhalation, orale Einnahme).
  2. Herstellung von PDMS Formen
    1. Mischen Sie eine Siliconelastomerbasis mit einem Härter in einem Verhältnis 10: 1 und die Tasse mit diesem nicht ausgehärteten PDMS(30-40 ml für Mikrostrukturen auf einem Wafer 4-in Silizium zu replizieren) in einem Vakuumgefäß für 30 Minuten um die Blasen zu entfernen.
      HINWEIS: Die Silikonbasis enthält Siloxanoligomerer endet mit Vinylgruppen und ein Katalysator auf Platinbasis. Das Härtungsmittel enthält Oligomere Vernetzungs das drei silicium Hydrid - Bindungen 28 haben.
    2. Gießen Sie die nicht ausgehärteten PDMS auf den Silizium Meister, entfernen Sie die Blasen mit einem Gebläse, und heilen die PDMS bei 80 ° C für 2 h in einem Umluftofen.
    3. Lösen Sie die gehärtete PDMS aus den Silizium - Master und Form richtig die PDMS mit einem Messer (squared Formen, wie in Abbildung 2a-b gezeigt, iv).
  3. Strukturieren der Kationenaustauschermembranen
    1. Schneiden Sie die Hälfte der PDMS-Form senkrecht zu den beiden parallelen Mikrokanälen und lochen an den Enden der PDMS-Kanäle mit einem 2,0-mm-Biopsie Punch.
      HINWEIS: Die PDMS-Form zur Strukturierung der kationenselektive Membran hat zwei parlel Mikrokanäle (Breite: 100 & mgr; m; Höhe: 50 & mgr; m; Inter Abstand: 100 & mgr; m; Abbildung 1a). Die ursprüngliche Form der Form kann durch Spiegelung des geschnittenen Form entlang der Schnittlinie vorstellen. L-förmige Mikrokanäle sind zum Stanzen der beiden Löcher empfohlen ohne Überlappung.
    2. Reinigen Sie einen Glasobjektträger und die PDMS-Form mit Klebeband und ein Gebläse und legen Sie die Form auf dem Glasträger reversible Bindung zwischen ihnen zu schaffen.
    3. Gemäß der Mikroströmungsstrukturierungstechnik 29, Freisetzung ~ 10 & mgr; l eines Kationenaustauscherharzes am offenen Ende des Kanals, der im Schritt 1.3.1 (Abbildung 1b) geschnitten wurde. Setzen Sie den Spritzenkopf auf die gestanzten Löcher und ziehen Sie den Kolben (schwarze Pfeile in Abbildung 1b); ein leichter Unterdruck wird das Kationenaustauschharz und das Harz füllt die beiden Kanäle zu ziehen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Höhe des Mikrokanals ist größer als 1581; m, weil die hohe Viskosität des Harzes erfordert einen hohen Druck, um die Kanäle zu füllen. Auf der anderen Seite, ist es besser, dass die Höhe nicht 100 überschreitet um, da die strukturierte ionenselektive Membran dicker als 1 & mgr; m werden wird; solch eine dicke Membran 13 einen Spalt zwischen der Membran und der PDMS - Kanal erzeugen können.
    4. Nehmen Sie die PDMS-Form, ohne das gemusterte Harz zu berühren, und legen Sie den Glasobjektträger auf die Heizung auf 95 ° C für 5 min das Lösungsmittel in dem Harz zu verdampfen.
      HINWEIS: Die Dicke der gemusterten Membran ist in der Regel weniger als <1 um. Die Form wird durch Anlenkung der Form auf der offenen Seite (gestrichelte Linie und Pfeil in Abbildung 1b) vorsichtig abgelöst. Es empfiehlt sich, die Form weniger als 1 min nach dem Einfüllen des Harzes zu lösen. Wenn die Form ein paar Minuten später abgelöst wird, dickere Membranen erhalten werden konnte, aber sie würden eine konkave Form aufgrund der Kapillarwirkung haben.
    5. Ziehen Sie die unnötigenTeil der gemusterten Membran mit einer Rasierklinge, so dass zwei getrennte Linienmuster (Abbildung 1c).
      ANMERKUNG: Das Kationenaustauschmaterial hier verwendete Gruppen perfluoriert, ist das Muster das heißt nicht stark an das Glas gebunden ist. Daher kann das einfache Verfahren leicht Beschaufelung die unnötige Teil der Membran zu entfernen.
  4. Integration des Mikrokanals und der Membran-strukturierten Substrats
    1. Stanzen zwei Löcher an den Enden der Mikrokanäle und zwei weitere Löcher, wo die Membranmuster wird nach dem Bonden des PDMS-Kanal an die Membran-strukturierten Substrats in Schritt 1.3 hergestellt befinden.
      Hinweis: Der PDMS Mikrokanal weist einen Kanal (Breite: 50-100 & mgr; m; Höhe: 10 & mgr; m), aber es wird an den Enden des benachbarten Kanals (1d) verbunden ist .
    2. Bond, die PDMS-Mikrokanal an die Membran-strukturierte Substrat unmittelbar nach der Sauerstoffplasmabehandlung für 40 s bei 100 W und 50 mTorr.
      HINWEIS: Legen Sie die gemusterten Membran senkrecht auf der Mitte des Mikrokanals.

2. ICP-Anreicherung

  1. Vorbereitung für das Experiment
    1. Bereiten verschiedener Testlösungen, einschließlich 1-100 mM KCl, 1 mM NaCl (pH ~ 7), wobei die Mischung von 1 mM NaCl und 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), der Mischung von 1 mM NaCl und 0,2 mM NaOH (pH ~ 10.3) und 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
    2. Fügen Sie einen negativ geladenen fluoreszierenden Farbstoff (~ 1,55 uM) zu den Testlösungen.
      HINWEIS: Die Konzentration des zugegebenen Farbstoffs sollte viel niedriger sein als die der Salzionen (<10 & mgr; M) , so dass die geladenen Farbstoffe tragen nicht zu einem elektrischen Strom 30, 31.
    3. Laden der Probenlösung in einem Reservoir des Kanals und gelten Unterdruck zu dem anderen Behälter um den Kanal mit der Lösung zu füllen. Verbinden Sie die beiden Reservoirs durch hydrodynamisch releasing einen großen Tröpfchen des Druckgradienten entlang des Kanals (2a) zu beseitigen.
    4. Füllt die zwei Reservoiren, die an die Kationenaustauschmuster verbunden sind, mit Pufferlösungen (1 M KCl oder 1 M NaCl) unter Verwendung einer Spritze oder einer Pipette für die ICP-Effekt in den Reservoirs zu kompensieren.
    5. Legen Sie die Drähte an den Stauseen, über die beiden strukturierten Membranen (Anode auf der linken Reservoir und Kathode auf der rechten Seite ), und verbinden sie mit einer Quelle Messeinheit (Abbildung 2a).
  2. Visualisierung des ICP Phänomen und ICP preconcentration
    1. Legen Sie das ICP-Gerät auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskope. Tragen Sie eine Spannung (0,5100 V) und messen die Stromantwort mit einer Quelle Messeinheit.
    2. Erfassen Fluoreszenzbilder mit einer Charge-Coupled Device Kamera und analysieren , um die Fluoreszenzintensität mit Bildbearbeitungssoftware 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die schematischen Herstellungsschritte eines membran integrierten mikrofluidischen Vorkonzentrator sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung ist in dem Protokoll gegeben. Das Muster und die Vorrichtungsbilder der räumlich - zeitlich definiert Vorkonzentrator 26 sind mit denen eines konventionellen Vorkonzentrator 11 (Abbildung 2) kontrastiert. Die ICP - Phänomen in der raum - zeitlich definiert Vorkonzentrator wurde hinsichtlich der Strom-Spannungs-Zeit - Verhalten und Fluoreszenzintensitätsprofile (Bild 3-4) untersucht. Ähnlich wie bei der ICP - Phänomen mit einem Single-Membran Vorkonzentrator 3, 11, drei verschiedenen Regimen (ohmsch, Begrenzen und overlimiting) in der Strom-Spannungskurve beobachtet: 0,5-1 V (Ohmsche und Begrenzung) und 5 V (overlimiting) . Allerdings war ein nonconventional aktuellen Erholungin die Strom-Zeit-Kurve erfaßt, wie die Ionenanreicherungs und die Ionenverarmungszonen verschmolzen. Als nächstes wurde die ICP Vorkonzentration zu verschiedenen Zeiten und Spannungen mit der räumlich - zeitlich definiert Vorkonzentrator (Figur 5) und der herkömmlichen Ein-Membranvorrichtung (Abbildung 6) getestet. Die preconcentration Dynamik wurden durch Fluoreszenzbilder quantifiziert, aktuelle Zeitantworten und Fluoreszenzintensität Graphen über unterschiedliche Entfernungen und Zeiten. Wenn die beiden Plattformen zu vergleichen, zeigt die neue ICP Plattform einen Vorteil in immer Sammelziele (Fluoreszenzfarbstoffe) zwischen den beiden kationenselektive Membran Mustern. Darüber hinaus wurde bestätigt , dass die preconcentration Stecker das gleiche in verschiedenen Ionenstärken (1-100 mM NaCl) und pH - Werte (3,7 bis 10,3), die Überprüfung der hohen Verfügbarkeit des Fusion ICP Vorkonzentrierer in weiten Bereichen von Betriebsbedingungen bleibt (Abbildung 7). In Figur 8 wird eine 10.000-fach Protein preconcentration wurde ebenfalls demonstriert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Herstellungsschritte einer Kationenaustauschermembran integrierten mikrofluidischen Chip. 29, die membran gemusterte Glassubstrat mit einem PDMS Mikrokanal durch Sauerstoffplasmabehandlung (d) gebunden ist - nach einem PDMS - Form ist mit einem Kationenaustauschharz unter Verwendung des Mikrodurchmusterungsverfahren (c a) gefüllt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schema der räumlich - zeitlich definiert Vorkonzentrierer (a) und konventionellen Vorkonzentrierer (b). (A) In the neue Plattform zwischen zwei Membranmuster (i), Ionenverarmungs / sind Anreicherungszonen entwickelt und zusammengeführt mit linear (Ohmsche und Regelung begrenzen; ii) oder nichtlinear (overlimiting Regime; iii) Konzentrationsprofile. In allen drei Stromsysteme, die Ionenanreicherungszone blockiert die Ausbreitung der Verarmungszone und Targets (leere Kreise; i) an der Grenzfläche der Ionenerschöpfungs und Anreicherungszonen (; i gekrümmte gepunktete Linie) vorkonzentriert. Die Wand des Kanals PDMS ist negativ geladen, und dies erzeugt elektroosmotische Strömung (EOF) zwischen den beiden Kationenaustauscher-Membranen unter einem elektrischen Feld. Der EOF liefert kontinuierlich Ziele in Richtung der Grenzfläche der Abreicherung und Anreicherungszonen. (B) Bei der herkömmlichen Plattform nur die Ionenverarmungszone in der Nähe der Membran mit linear entwickelt ist (Ohmsche und Regelung begrenzen; ii) und nicht - lineare (overlimiting Regime; iii) Konzentrationsgradienten. Da die EOF die Ziele liefert, al die preconcentrationso tritt an der Verarmungszonengrenze, aber diese Zone (und der vorkonzentrierten Stecker) bewegt sich von der Kationenaustauschmembran (schwarzer Pfeil; i). Es wird angemerkt, dass es keine Erhöhung der Ionenkonzentration ist hier ohne die Ionenanreicherungszone (ii-iii). In (ab) werden die Gerätebilder gezeigt in (iv). C 0 die anfängliche Ionenkonzentration. V + und G zeigen die Anode und die Kathode, respectively. Nachdruck aus Referenz 26t mit Genehmigung der American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Zusammengefügt ICP Phänomen zwischen zwei Kationenaustauschmembranen. (A) Die Strom-Spannungskurve zeigt drei verschiedene regimes (Ohmsche, Begrenzung und overlimiting). Die Stromantwort wird durch Hochfahren der Spannung in diskreten Abständen von 0,25 V alle 40 s gemessen, die dreimal wiederholt wird. Die Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung der aktuellen Antworten. (b, c) In den drei Regimen Fluoreszenzbildern (b) und Intensitätsprofile entlang AA 'in der Mitte des Kanals (c) erhalten. Gelb, punktierte Kästen zeigen die Stellen der kationenselektiven Membranen. 1 mM KCl-Lösung mit einem 1,55 & mgr; M (1 & mgr; g / mL) negativ geladen wurde Fluoreszenzfarbstoff verwendet. Wiedergabe aus Lit. 26 mit Genehmigung der American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Figur 4. (A, b) In der Ohmsche beschränkende Regimen die linearen Konzentrationsgradienten wachsen (<1 s) von der Kationenaustauschmembran und dann überlappen zusammen (> 1 s). (C) Im overlimiting Regime, die beiden ICP Zonen werden schneller verschmolzen (<0,6 s) mit der Verarmungs Schock (schwarzer Pfeil auf 0,2 s). (D - f) für die aktuelle Zeit Antworten zeigen , dass der Strom fiel anfänglich aufgrund des Wachstums der Niedrigkonzentrations - Verarmungszone, die zu einer geringen elektrischen Leitfähigkeit entspricht. Der Stromabfall wird dann durch Wirbel zwischen zwei Membranen begrenzt aufgrund einer konvektiven Transport erholt. Nachdruck aus referenzierten 26 mit Genehmigung der American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Abbildung 5
Abbildung 5. räumlich - zeitlich fixiert preconcentration bei 5, 10 und 20 V (a - c) Fluoreszenzbilder der fusionierten ICP und die Strom-Zeit - Verhalten (d - f) über die Zeit (0-100 s). Die gelben, gepunktete Linien zeigen die Position der Kationenaustauschmembranen. (G) Zeitraffer-Fluoreszenzintensitätsprofile entlang des Mikrokanals (AA ') aufgetragen. Die Spitzenintensitäten erhöhen, wie die Zeit vergeht, mit festen Standorten. (H) die Spitzenintensität fold (dh wie viele Male größer ist als die anfängliche Fluoreszenzintensität). Bei höheren Spannungen, liefert die schneller EOF Targets in Richtung der Grenzfläche der Ionenerschöpfungs und Anreicherungszonen, so dass die Vorkonzentration Geschwindigkeit erhöht. Eine Spitze bei 20 V wird durch die Verarmungs Schock induziert ( Figur 4c zu sehen ist, war der Peak breiter als bei 0,4 s war. Dies ist wahrscheinlich , weil die linke Seite des linken Nafion Muster (Abbildung 2a) wurde elektrisch schwebte, und die akkumulierten Farbstoffe könnten sich auszubreiten. Wiedergabe aus Lit. 26 mit Genehmigung der American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. ICP - Phänomen in der herkömmlichen ICP Vorkonzentrator bei 5, 10 und 20 V. (A - c) Fluoreszenzbilder der Ionenverarmungszone und die Zeitantwort (d - f) über der Zeit (0-100 s). Die Ausbreitung der Verarmungszone und der Anreicherungs Stecker ist in den Fluoreszenzbildern deutlich sichtbar gemacht. Dementsprechend werden die Verwirbelungen nicht beschränkt, so dass die aktuelle Wiedergewinnung nicht auftritt, selbst in der overlimiting Regimes. Gelb, gestrichelten Linien markieren die Lage der Kationenaustauschmembranen. (G) Zeitraffer-Fluoreszenzintensitätsprofile entlang des Mikrokanals (AA ') aufgetragen. Die Spitzenintensitäten erhöhen, wie die Zeit vergeht, aber die Lage sich von der Membran entfernt. (H) Spitzenintensität fache der herkömmlichen ICP - Gerät. Im Gegensatz zu der fusionierten ICP Vorrichtung (5H), gibt es keine Intensitätsspitze ohne den Einschluss von ICP Zonen, da die Fluoreszenzintensität als der Farbstoff vorkonzentriert wurde erhöht. Der Anstieg von ter Spitzenintensität fold ist ähnlich derjenigen der fusionierten ICP-Gerät gleichzeitig (bei einer gegebenen Spannung). Dies zeigt, dass die Länge der Zeit, die der vorkonzentrierten Stecker an Ort und Stelle gehalten wird, ist entscheidend für die preconcentration Leistung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7. raum - zeitlich definiert preconcentration bei verschiedenen Ionenstärken (1-100 mM NaCl) und pH - Werte (3,7 bis 10,3). (A) Fluoreszenzbildern nach 100 s Betriebs erhalten bei 50 V. Wie zu sehen ist, die Orte der Vorkonzentration Stecker sind noch zwischen den beiden Kationenaustauscher - Membranen (gelb, gepunktete Linien), auch wenn die Intensität unter hohem geschwächt ionisches Stärke und in einer starken sauren oder basischenLösung. (B, c) Die Lage des Spitzenintensität und der Intensität fold (dh., Wie viele Male größer ist als die Anfangsintensität), kartiert unter 10, 20, 50 und 100 V. Für einen Zustand (1, 10, 100 mM und / oder pH 3,7, 7 und 10) gibt es vier Datenpunkte zu den vier Spannungsbedingungen entspricht. Bei höheren Spannungen, gibt es eine höhere Spitzen in allen Fällen fold intensivieren. nicht getestet in 1 mM NaCl (pH 7), da der Spitzenintensität bereits die höchsten Werte berührt (aufgrund der Sättigung der Kamera) bei 50 V. Aus dem Peak-Intensitätsprofil 100 V wurde, wird der Spitzenbereich ebenfalls identifiziert mit 1 % unterhalb der Spitzenintensität, die durch Fehlerbalken (b, c) repräsentiert wird. Eine höhere Spannung und eine stärkere EOF Verschiebung der Scheitelpunkt auf der rechten Seite, mit einer höheren Intensität Falte und ein schärferes preconcentration Stecker. Graue Kästchen zeigen die Positionen der Kationenaustauschmembranen. Der 0-Abstand (a) stellt den Ursprung der x-Achse (b, c), dieam rechten Rand des linken Kationenaustauschermembran. Der Ursprung der Abstand der rechten Kante der linken Membran. Wiedergabe aus Lit. 26 mit Genehmigung der American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8. Nachweis der räumlich - zeitlich fixierten Protein preconcentration. FITC-Albumin (1 ug / mL) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung verwendet wurde. 0,1% Tween 20 wurde auch nicht-spezifische Bindung zu verhindern, zugegeben. Da die Vorkonzentration kaum bei einer höheren Ionenstärke (Figur 7) erreicht wird, verdoppelt man die Breite des Nafion - Muster (200 um) und verwendet , um einen schmaleren PDMS Kanal (50 um). Auf diese Weise wurde die Leistung von ICP preconcentration verbessert durchdie Ionenpfad verbreitert und die absolute Menge der Ionen in dem Kanal zu reduzieren. Bei einer angelegten Spannung von 100 V, die Spitze und gemittelte Fluoreszenzintensitäten wurden in dem weißen, gepunkteten Kasten zurückgeführt, die den Bereich zwischen den beiden Kationenaustauscher-Membranen ist. Innerhalb von 10 min des Betriebs wurden die Proteine ​​vorkonzentriert bis zu 10 mg / ml (Spitze) und ~ 0,1 mg / ml (Mittelwert), was anzeigt, 10.000- und 100fachen preconcentrations, respectively. Der Einschub Fluoreszenzbilder wurden bei 0, 10 und 20 min erhalten. In dieser Arbeit wurde ein 20-Minuten-Betrieb war genug, um die Zielmoleküle anreichern, so dass wir nicht decken längere Betriebszeiten. Wiedergabe aus Lit. 26 mit Genehmigung der American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir haben das Herstellungsprotokoll und die Leistung eines raum-zeitlich definiert Vorkonzentrator in einem Bereich der angelegten Spannung (0,5-100 V), Ionenstärke (1-100 mM) beschrieben und pH (3,7 bis 10,3), eine 10.000-fache zu erreichen preconcentration von Farbstoffen und Protein innerhalb von 10 min. Wie wie frühere ICP-Geräte wird die preconcentration Leistung besser bei höherer Spannung und bei niedrigeren Ionenstärke. Ein zusätzlicher Parameter, den wir hier zu betrachten ist, kann der Abstand zwischen zwei Kationenaustauschmembranen. Wenn wir die Intermembranabstand zu erhöhen, verringert sich das elektrische Feld unter der gleichen angelegten Spannung, was zu einer Abnahme der Geschwindigkeit preconcentration 26.

Der Mikroströmungsstrukturierungstechnik 29 in dieser Arbeit verwendet wird , ein robustes Verfahren zum Strukturieren von Kationenaustauschharzen, so hat es eine der Gold-Standardverfahren wurden für die Integration der Ionenaustauschmaterialien in mikrofluidischen Systemen. Nevertheless, ist es notwendig, zwei nebeneinander angeordneten Kationenaustauschmembranen mit einer kurzen Inter Abstand (kleiner als einige hundert Mikrometer) herzustellen. In den Schritten 1.3.3-1.3.4 ist das Kationenaustauschharz in einer flüssigen Phase. Daher kann das Harz in den beiden Mikrokanäle zusammengeklappt werden, und die verbleibende Harzabfall an dem offenen Ende der Kanäle können auch während der Formablösung Flut (Schritt 1.3.4.). Zum Bau von zwei Kationenaustauschmembranen mit hoher Strukturtreue, benutzten wir das Harz mit einer relativ hohen Viskosität (20% der Kationenaustauschmaterial in den Lösungsmitteln) und stellen Sie vorsichtig den Ablöseprozess mit einem bestimmten Löserichtung.

Auch wenn die hohe operative Flexibilität dieser Plattform demonstriert wurde, könnte der Leser besorgt über die optimalen Bedingungen aus dem breiten Spektrum innerhalb des Betriebsfensters zu bestimmen. Ein Vertreter Trade-off zwischen der preconcentration Geschwindigkeit und die Stabilität des ICP-Effekt. Ein Scanwerden in Abbildung 5 in Kwak et al gesehen. 26, eine hohe angelegte Spannung (> 50 V) können Ziele schnell kondensieren; dies jedoch induziert auch starke Wirbel in der Verarmungszone (1 mM / pH 7 in 7a), die die Stabilität der Probe preconcentration abnimmt. Dementsprechend wird die Geschwindigkeit preconcentration 33 zur Vorhersage schwierig. In der aktuellen Phase, empfehlen wir experimentellen Bedingungen mit einer relativ niedrigen Spannung (<30 V) und der Ionenstärke (<10 mM) für eine stabile, berechenbare und räumlich-zeitlich fest preconcentration. Dieser Kompromiß zwischen der Anreicherungsgeschwindigkeit und der Stabilität des vorkonzentrierten Stecker ist auch mit den Sources der nichtlinearen ICP (Oberflächenleitung, EOF und elektroosmotischen Instabilität) bezogen. Die Hauptquelle des nichtlinearen ICP mit einer relativ kleinen Spannung (<50 V) ist EOF, eine kohärente Wirbelpaar in der Verarmungszone (3b) zu schaffen, die leAnzeigen auf einen stabilen preconcentration. Bei einer relativ hohen Spannung (> 50 V), ist die Hauptquelle des nichtlinearen ICP geändert elektroosmotische Instabilität, was zu chaotischen mehrere Wirbel, die die Stabilität des preconcentration verringern.

Vor kurzem Papierbasis ICP Plattformen wurden von Phan et al entwickelt. 34, Gong et al. 19 und Han et al. 21. Diese Papier Geräte mit mikroporösen Strukturen kann elektroosmotische Instabilität 4, 35 unterdrücken und die Stabilitätsproblem zu lindern. Jedoch sind die Grßen der Papierkanäle im allgemeinen etwa 0,5-5 mm, die viel größer als bei einem herkömmlichen Mikrofluidik-Kanal ist. Diese breitere Papierkanal mit Wirrfasernetze verursacht unregelmäßige Bewegungen in den vorkonzentrierten Steckern. Dies hat in papierbasierten ICP preconcentrators unvermeidlich gewesen, da die minimale FeatureGröße der Wachs Musterung und Papierschneide (dh Herstellungsverfahren Papier Kanäle zu bauen) etwa einigen hundert Mikrometern.

Die ICP Vorkonzentrierer hat in einer breiten Palette von biomicrofluidic Plattformen für preconcentrating verschiedene Bio-Mittel verwendet wurden; die Signale verschiedener Assays zu verstärken; und Detektieren Ziele, wie therapeutische Proteine 36, 37 Peptide, Aptamere 17 und 38 enzyme. Diese früheren Arbeiten fluoreszenzmarkierte Biomoleküle gezielt. Das ist , weil wir nicht die genauen Betriebsbedingungen (dh Spannung und Durchfluss) angeben können die preconcentration Standort zu halten, so dass wir zuerst die richtigen Bedingungen für die Voranreicherungsanlage Ziele finden müssen. Ausgehend von früheren Arbeiten, ermöglicht es dem fusionierten ICP Phänomen uns immer die vorkonzentrierten Stecker an einem breiten Spektrum von Betriebsbedingungen zu beheben, während die hohe Flexibilität der AufrechterhaltungICP-Geräte. Zum Beispiel können wir die fusionierte ICP - System mit einem tangentialen Fluidfluss und den Betrieb in dem kontinuierlichen Strömungsmodus 39 modulieren. Dies zeigt, dass wir nun die Anwendungen von ICP preconcentrators erweitern Techniken Erkennung frei beschriften ohne Visualisierung Instrumente und Indikatoren verwenden. Dieser einzigartige Vorteil der räumlich-zeitliche Steuerbarkeit bietet eine starke kommerzielle Gelegenheit, die ICP-Gerät mit generischem Benchtop-Plattformen wie Polymerase-Kettenreaktion Maschinen und Massenspektrometer zu integrieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning
Trichlorosilane Sigma Aldrich 175552 Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt% Sigma Aldrich 527122
Sodium chloride Sigma Aldrich 71394
Potassium chloride Sigma Aldrich 60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20000
Isothiocyanate-conjugated albumin Sigma Aldrich A9771
Phosphate buffer saline, 1x Wengene LB004-02
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
Epifluorescence microscope Olympus IX-71
Charged-coupled device camera Hamamtsu Co. ImageEM X2
Source measurement unit Keithley Instruments 2635A
Covance-MP Femto Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Probstein, R. F. Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction. , Wiley-Interscience. New York. (2003).
  2. Strathmann, H. Ion-Exchange Membrane Separation Processes. , Elsevier. Amsterdam. (2004).
  3. Dydek, E. V., et al. Overlimiting Current in a Microchannel. Phys. Rev. Lett. 107 (11), 118301 (2011).
  4. Kwak, R., Pham, V. S., Lim, K. M., Han, J. Y. Shear flow of an electrically charged fluid by ion concentration polarization: scaling laws for electroconvective vortices. Phys. Rev. Lett. 110 (11), 114501 (2013).
  5. Rubinstein, I., Zaltzman, B. Electro-osmotically induced convection at a permselective membrane. Phys. Rev. E. 62 (2), 2238-2251 (2000).
  6. Kwak, R., Kim, S., Han, J. Continuous-flow biomolecule and cell concentrator by ion concentration polarization. Anal. Chem. 83 (19), 7348-7355 (2011).
  7. Jeon, H., Lee, H., Kang, K. H., Lim, G. Ion concentration polarization-based continuous separation device using electrical repulsion in the depletion region. Sci.Rep. 3, 3483 (2013).
  8. Kim, S. J., Ko, S. H., Kang, K. H., Han, J. Direct seawater desalination by ion concentration polarization. Nat. Nanotechnol. 5 (4), 297-301 (2010).
  9. MacDonald, B. D., Gong, M. M., Zhang, P., Sinton, D. Out-of-plane ion concentration polarizationfor scalable water desalination. Lab Chip. 14 (4), 681-685 (2014).
  10. Schoch, R. B., Han, J. Y., Renaud, P. Transport phenomena in nanofluidics. Rev.Mod. Phys. 80 (3), 839-883 (2008).
  11. Kim, S. J., Song, Y. A., Han, J. Nanofluidic concentration devices for biomolecules utilizing ion concentration polarization: theory, fabrication, and applications. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 912-922 (2010).
  12. Mai, J. Y., Miller, H., Hatch, A. V. Spatiotemporal mapping of concentration polarization Induced pH changes at nanoconstrictions. ACS Nano. 6 (11), 10206-10215 (2012).
  13. Kim, B., et al. Tunable ionic transport for a triangular nanochannel in a polymeric nanofludic system. ACS Nano. 7 (1), 740-747 (2013).
  14. Mangano Syed, A., Mao, L., Han J, P., Song, Y. -A. Creating sub-50 nm nanofluidic junctions in a PDMS microchip via self-assembly process of colloidal silica beads for electrokinetic concentration of biomolecules. Lab Chip. 14, 4455-4460 (2014).
  15. Wang, Y. C., Stevens, A. L., Han, J. Y. Million-fold preconcentration of proteins and peptides by nanofluidic filter. Anal. Chem. 77 (14), 4293-4299 (2005).
  16. Lee, J. H., Cosgrove, B. D., Lauffenburger, D. A., Han, J. Microfludic concentration-enhanced cellular kinase activity assay. J. Am. Chem. Soc. 131 (30), 10340-10341 (2009).
  17. Cheow, L. F., Han, J. Y. Continuous signal enhancement for sensitive aptamer affinity probe electrophoresis assay using electrokinetic concentration. Anal. Chem. 83 (18), 7086-7093 (2011).
  18. Ko, S. H., et al. Nanofluidic preconcentration device in a straight microchannel using ion concentration polarization. Lab Chip. 12 (21), 4472-4482 (2012).
  19. Gong, M. M., Nosrati, R., Gabriel, M. C. S., Zini, M., Sinton, D. Direct DNA analysis with paper-based ion concentration polarization. J. Am. Chem. Soc. 137 (43), 13913-13919 (2015).
  20. Hong, S., Kwak, R., Kim, W. Paper-based flow fractionation system applicable to preconcentration and field-flow separation. Anal. Chem. 88 (3), 1682-1687 (2016).
  21. Han, S. I., Hwang, K. S., Kwak, R., Lee, J. H. Microfluidic paper-based biomolecule preconcentrator based on ion concentration polarization. Lab Chip. 16, 2219-2227 (2016).
  22. Zangle, T. A., Mani, A., Santiago, J. G. Theory and experiments of concentration polarization and ion focusing at microchannel and nanochannel interfaces. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 1014-1035 (2010).
  23. Mani, A., Bazant, M. Z. Deionization shocks in microstructures. Phys. Rev. E. 84, 061504 (2011).
  24. Slouka, Z., Senapati, S., Chang, H. C. Microfluidic systems with ion-selective membranes. Annu. Rev.Anal. Chem. 7, 317-335 (2014).
  25. Kirby, B. J., Hasselbrink, E. F. Zeta potential of microfluidic substrates: 1. Theory, experimental techniques, and effects on separations. Electrophoresis. 25 (2), 187-202 (2004).
  26. Kwak, R., Kang, J. Y., Kim, T. S. Spatiotemporally defining biomolecule preconcentration by merging ion concentration polarization. Anal. Chem. 88 (1), 988-996 (2016).
  27. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  28. Campbell, D. J., et al. Replication and compression of surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537-541 (1999).
  29. Lee, J. H., Song, Y. A., Han, J. Y. Multiplexed proteomic sample preconcentration device using surface-patterned ion-selective membrane. Lab Chip. 8 (4), 596-601 (2008).
  30. Kwak, R., Guan, G., Peng, W. K., Han, J. Microscale electrodialysis: concentration profiling and vortex visualization. Desalination. 308, 138-146 (2013).
  31. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81, 3022-3028 (2009).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  33. Minerick, A. R., Ostafin, A. E., Chang, H. C. Electrokinetic transport of red blood cells in microcapillaries. Electrophoresis. 23 (14), 2165-2173 (2002).
  34. Phan, D. -T., Shaegh, S. A. M., Yang, C., Nguyen, N. -T. Sample concentration in a microfluidic paper-based analytical device using ion concentration polarization. Sens. Actuators B. 222, 735-740 (2016).
  35. Rubinstein, S. M. Direct observation of a nonequilibrium electro-osmotic instability. Phys. Rev. Lett. 101, 236101 (2008).
  36. Ouyang, W., et al. Microfluidic platform for assessment of therapeutic proteins using molecular charge modulation enhanced electrokinetic concentration assays. Anal. Chem. 88, 9669-9677 (2016).
  37. Cheow, L. F., Sarkar, A., Kolitz, S., Lauffenburger, D., Han, J. Detecting kinase activities from single cell lysate using concentration-enhanced mobility shift assay. Anal. Chem. 86, 7455-7462 (2014).
  38. Chen, C. -H., et al. Enhancing protease activity assay in droplet-based microfluidics using a biomolecule concentrator. J. Am. Chem. Soc. 133, 10368-10371 (2011).
  39. Kwak, R., Pham, V. S., Kim, B., Lan, C., Han, J. Enhanced salt removal by unipolar ion conduction in ion concentration polarization desalination. Sci. Rep. 6, 25349 (2016).

Tags

Bioengineering Ausgabe 120 Ionenkonzentration Polarisation preconcentration Ionenaustauschmembran overlimiting Strom elektro-osmotische Strömung elektroosmotische Instabilität
Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, M., Rhee, H., Kang, J. Y., Kim, … More

Kim, M., Rhee, H., Kang, J. Y., Kim, T. S., Kwak, R. Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone. J. Vis. Exp. (120), e55313, doi:10.3791/55313 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter