وهنا يصف لنا تحليل الكروماتوغرافي مقترنة بفصل الحراك أيون السلائف الببتيد تليها عالية الدقة (~ 30,000) مرض التصلب العصبي المتعدد-الكشف عن شظايا الببتيد للتحديد الكمي لمعايير الببتيد ارتفعت في جسم [مونوكلونل] خلاصة.
تحليل لمستوى منخفض (1-100 جزء في المليون) البروتين الشوائب (مثلاً بروتينات الخلية المضيفة (الأطراف المتعاقدة السامية)) في بيوثيرابيوتيكس البروتين مقايسة صعبة التي تحتاج إلى حساسية عالية ودينامية واسعة نطاق. عادة ما تشمل فحوصات الكمي الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي للبروتينات هضم البروتين يتبعه رد فعل رد فعل انتقائي رصد متعددة الرصد الكمي (SRM/MRM) من الببتيدات ذات الدقة منخفضة (Rs ~ 1,000) جنبا إلى جنب باستخدام مطياف كتلة الرباعي. أحد أوجه القصور في هذا النهج هو ظاهرة التدخل لاحظ عندما ببتيد الاهتمام قد السلائف “نفس” والجماهيري يفتت (من حيث القيم m/z) الببتيدات التينج المشترك الأخرى الموجودة في العينة (ضمن إطار 1-دا). لتجنب هذه الظاهرة، فإننا نقترح نهجاً بديلاً والمطيافيه الجماعية، مقايسة الآلية انتقائية عالية (HS) الذي يجمع بين فصل الحراك أيون السلائف الببتيد مع عالية الدقة (Rs ~ 30,000) الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد من الشظايا الببتيد. وبحثنا في قدرات هذا النهج لتحديد معايير الببتيد وفرة المنخفضة ارتفعت في خلاصة [مونوكلونل] جسم (ماب)، وأثبتت أن لديها حساسية والنطاق الديناميكي (على الأقل 3 أوامر من حجم) عادة ما يتحقق في المندوبية تحليل. تم الكشف عن جميع المعايير الببتيد الستة بتركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر (محملة على 2.1 ملم معرف عمود الكروماتوغرافي 1 فيمتومولي) وجود خلفية ببتيد وفرة عالية (2 ميكروغرام ماب هضم محملة على-عمود). عند النظر في ميغاواط من الأرانب فوسفوريلاز (97.2 كاتشين)، التي تستمد منها الببتيدات ارتفعت لوق من هذا التحليل أقل من 50 جزء من المليون. النسبي الانحرافات المعيارية (RSD) من مناطق الذروة (n = 4 replicates) كانت أقل من 15% عبر تركيز كامل نطاق التحقيق (0.1-100 نانومتر أو 1 1,000 جزء في المليون) في هذه الدراسة.
يستند التقدير الكمي للجزيئات الحيوية الكبيرة (البروتينات) في إعدادات الصناعية حاليا تحديدكم (مثلاً، الساس)، أساسا بسبب العديد من المزايا: حساسية والإنتاجية العالية وسهولة الاستخدام ومنخفضة التكلفة لكل عينة. عندما يطبق على تحليل الشوائب وفرة منخفضة البروتين (1-100 جزء من المليون من الخلية المضيفة البروتينات (الأطراف المتعاقدة السامية)) موجودة في البروتين المداواة، هذه الاختبارات البيولوجية توفر عادة التركيز الكلي المندوبية (يعبر عنها عادة في جزء في المليون أو نغ ماب المندوبية/mg)، لكنها لا يمكن تحديد وقياس الملوثات المندوبية الفردية. ووضعت مؤخرا عدة فحوصات المستندة إلى MS لتكملة الساس أو لتوفير المعلومات التي تفشل في الساس لتقديم1،2،3،4،،من56 , 7 , 8 , 9-بسبب تعقيد عينة واشتراط الكشف عن الببتيدات المندوبية عبر مجموعة واسعة ديناميكية في تركيز (3 على الأقل من حيث الحجم)، يكون متعدد الأبعاد الكروماتوغرافي أساليب المناقصة وجود عينة واسعة النطاق استخدمت تقليديا للمساعدة في تحديد وفرة منخفضة الأطراف المتعاقدة السامية1،2،3،4،5،،من67.
خطوة طبيعية بعد تحديد المندوبية والتحقق من الصحة يتم تتبع المندوبية (الرصد) عبر عدة دفعات من صيدلية. في هذه الحالة، قد تم أحادية البعد LC/MS الأساليب المقترحة لتحسين العينة الإجمالية8،9. ومع ذلك، دقة وقياسات النطاق الديناميكي للمندوبية قد تتأثر في مقايسة LC/MS د 1 وجود الساحقة من الببتيدات الصيدلانية البيولوجية. مقارنة بفصل متعددة الأبعاد، يتم زيادة إمكانات إشارة تدخل19،20،،من2122 في فصل الكروماتوغرافي أحادية البعد لأن الاحتمال يتم زيادة السلائف الببتيد أكثر أن يكون المشترك التينج. ومن الواضح سيكون من المفيد إدراج الوسائل متعامد للفصل سلائف الببتيد دون تمديد الوقت الفصل الكروماتوغرافي. السفر الموجه أيون التنقل (سيارتك)10 لديها القدرة على حل ازدحام مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف بالمللي ثانية. يمكن أن يؤديها حوالي 500 التنقل الفواصل أثناء شطف من الببتيد واحد، على افتراض عرض كامل الكروماتوغرافي ذروة من 10 s والنظر إلى أن وقت التشغيل فصل الدردشة على الصك التنقل أيون 20 مللي ثانية.
وضعت كتلة والمطيافيه فحوصات لتحديد مقدار البروتين بنجاح على مدى العقد استخدام مقبولة تماما تحديد رد الفعل (متعددة) رصد النهج (أسلوب SRM/الآلية) تنفذ جنبا إلى جنب مطيافات الشامل11، 12،13،،من1415،16،17،،من1819،20،21 ،،من2223. أحد أوجه القصور في هذا التحليل الشامل والمطيافيه منخفضة الدقة هو تدخل الظاهرة19،20،21،22 لاحظت عند الببتيد لمصلحة له “نفس” السلائف ويفتت الببتيدات التينج المشاركة الجماعية الأخرى الموجودة في العينة (ضمن إطار 1-دا). هناك طريقتان لتحسين دقة أساليب إدارة المخاطرة الاستراتيجية/الآلية: خيار واحد ينطوي على خطوة فصل إضافي على مستوى السلائف لإزالة الأيونات السلائف التدخل، في حين أن الخيار الآخر لزيادة دقة مرض التصلب العصبي المتعدد للكشف عن السلائف/يفتت إلى تجنب تداخل إشارات مرض التصلب العصبي المتعدد. الانتقائية العالية الآلية (HS) اقتناء الموصوفة هنا يستفيد الوضع كل من هذين النهجين باقتران فصل الحراك أيون السلائف الببتيد مع عالية الدقة (Rs ~ 30,000) الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد من الشظايا الببتيد. المقايسة وصف هنا تغطي على الأقل ثلاثة أوامر من حجم، وهو النطاق الديناميكي عادة لاحظت في إدارة المخاطرة الاستراتيجية/الآلية البروتيوميات تجارب17،،من1824.
الأداة المساعدة للمقايسة HS-الآلية للقياس الكمي المندوبية تجلى رصد الخطي للإشارات التي تنتجها ستة معايير الببتيد ارتفعت تركيزات مختلفة (0.1 إلى 100 نانومتر النطاق) في خلاصة [مونوكلونل] جسم.
عالية الدقة (Rs > 20,000) تستخدم الطيف الكتلي بشكل روتيني لتوصيف الهيكلية للبروتينات العلاجية على مجموعة متنوعة من المنصات الصك. على النقيض من ذلك، تحديد مقدار البروتين المستندة إلى MS عادة يؤديها SRM/إليه الرصد والإبلاغ على دقة منخفضة (Rs ~ 1,000) جنبا إلى جنب الرباعي الشامل مطيافات استخدام التوقيع الببتيدات الناتجة عن الانقسام الانزيمية للبروتينات11،12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23-كما لا يمكن حل فصل الكروماتوغرافي أحادية البعد الكامل خلائط الببتيد المعقدة التي تنتجها الهضم الأنزيمي، شطف المشارك الببتيد أمر شائع، وحتى في حالة خلاصة البروتين وحيد. يمكن أن تتأثر للنبذ البروتين معقدة جداً (مثلاً، للتحديد الكمي للتجهيز 1-100 من الأطراف المتعاقدة السامية حضور خلفية الببتيد الغنية التي تنتجها البروتينات العلاجية)، وحساسية، ودقة أو الخطي SRM/إليه الرصد والإبلاغ بالانزيم التدخل.
وقد فحوصات SRM/الآلية الانتقائية الأحادي البعد، والاعتماد فقط على الجمع بين الجماهير السلائف/بلغة “فريدة من نوعها”. ولهذا السبب، تفشل هذه الاختبارات في الحالات عند تغيير الخلفية الببتيد بشكل غير متوقع (مثلاً للعينات الصيدلانية البيولوجية الحصول عليها من إجراءات تنقية مختلفة). للتغلب على هذه القيود، فإننا نقترح هنا مقايسة (HS) الآلية انتقائية عالية نفذت في أيون تمكين التنقل الرباعي عالية الدقة وقت طيران (قطوف) هجين شامل مطياف (للرسم التخطيطي الصك، انظر الشكل 6).
الصك يفصل على سلائف ببتيد الفائدة من السلائف الأخرى الببتيد التينج المشترك (التدخل) في الخلية التنقل أيون ويعزل المغلف كامل النظائر من السلائف في الرباعي وشظايا أنه مع م ثابتة في خلية الاصطدام. كما تم تعزيز الإشارات التي تنتجها، بلغة الببتيد الأكثر وفرة بضبط تردد دافع (تعزيز الهدف)، الذي يدفع بشكل انتقائي المناطق ذات الاهتمام الجماهيري في الأنبوب الرحلة، بدلاً من أيونات كافة، كما هو الحال مع فحص كامل. الببتيد الكمي تتم باستخدام إشارات عالية–مرض التصلب العصبي المتعدد-القرار (Rs ~ 30,000) التي تنتجها هذه الشظايا أيون. مقارنة مع فحوصات SRM/إليه الرصد والإبلاغ، والمقايسة HS-الآلية يقدم اثنين من مستويات إضافية من الانتقائية: واحدة يتم توفيرها من قبل فصل أيون السلائف-مستوى التنقل، في حين تقدم الثاني بالقرار الجماعي المتزايد من محلل TOF. النتائج الناجمة عن هذه التحسينات الانتقائية مرئية في تشروماتوجرامس HS-الآلية المعروضة في الشكل 7، وخالية من التدخلات عبر ثلاثة أوامر من حجم.
خلافا لفحوصات SRM/إليه الرصد والإبلاغ، وهناك العديد من المعلمات التي يمكن تعديلها لتحسين فحوصات HS-الآلية: الإطار RT حول السلائف الببتيد (عادة تعيين في 0.2 دقيقة)، نافذة العزلة الرباعي (دا 4)، الإطار الزمني الانجراف المحيطة السلائف (± FWHM الذروة السلائف من موبيلوجرام أيون المقابلة)، وحل مرض التصلب العصبي المتعدد أيون يفتت (20,000-40,000). فحوصات HS-الآلية حساسة جداً: أدنى مبلغ الكشف لكل الببتيدات بو 1 فيمتومولي في عمود (أو 0.1 نانومتر من حيث تركيز الببتيد). عند النظر في الببتيد ميغاواط (انظر الجدول 1 لدقة موس)، تم الكشف عن المبلغ في العمود أمر pg 1-2، بينما يتم تحميل العمود بمبلغ أعلى بكثير (2 ميكروغرام) من الببتيدات الخلفية من هضم الإنسان والمحيط الحيوي.
بالنظر في الوزن الجزيئي للبروتين بو كامل طول (97.2 كاتشين) التي تستمد منها الببتيدات ارتفعت، التحليل قادراً على الكشف عن 50 جزءا من المليون شوائب البروتين حضور أيونات الخلفية وفرة عالية. الحدود الدنيا للكشف عن (5-10 جزء في المليون) قابلة للوزن الجزيئي أقل الأطراف المتعاقدة السامية (كاتشين 10-20). ويغطي المقايسة ثلاثة أوامر من حجم (كما هو موضح في المنحنيات المعايرة من الشكل 8)، مما يعني أنه يمكن قياس الأطراف المتعاقدة السامية في النطاق 1 1,000 جزء في المليون. أيضا، إمكانية تكرار نتائج لفحوصات HS-الآلية، يتضح في الجدول 3، تطابق جيد جداً مع إمكانية تكرار نتائج لفحوصات SRM/الآلية جزيء صغير، مع ذروة منطقة رسدس أفضل من 15%.
نحن استكشاف قدرات التحليل رواية للتحديد الكمي لمعايير الببتيد ارتفعت في خلاصة [مونوكلونل] جسم (ماب) وقد أظهرت حساسية والأداة المساعدة لتغطية النطاق الديناميكي الواسع (على الأقل ثلاثة أوامر من حجم) عادة واجه في تحليل المندوبية. تم الكشف عن جميع المعايير الببتيد الستة بتركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر (محملة على 2.1 ملم معرف عمود الكروماتوغرافي 1 فيمتومولي) وجود خلفية ببتيد وفرة عالية (2 ميكروغرام ماب هضم محملة على-عمود). من خلال دمج نظام إدارة الموارد البشرية المستهدفة وفصل أيون التنقل السلائف، مقايسة HS-الآلية إمكانات كبيرة لكي تصبح مقايسة رصد السريع، الفائق لمتعددة الأطراف المتعاقدة السامية عبر عدة دفعات من صيدلية.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب يود أن يشكر مالين ليزلي وتوني كاتلين من شركة المياه لإعداد الرقم 6 المخطوطة.
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |