Summary
여기, 우리 뒤에 고해상도 (~ 30000) MS-탐지 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체에의 정량화에 대 한 펩 티 드 파편의 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리와 결합 하 여 크로마 분석 결과 설명 다이제스트입니다.
Abstract
낮은 레벨 (1-100 ppm) 단백질 불순물 (예: 호스트 세포 단백질 (HCPs)) 단백질 biotherapeutics의 분석은 도전 분석 결과 높은 감도 넓은 동적 범위를 필요로 합니다. 질량 분석 기반 정량화 분석 실험 단백질에 대 한 일반적으로 뒤에 선택적 반응 모니터링/다중 반응 감시 (SRM/MRM) 정량화 저해상도 (Rs ~ 1000) 탠덤을 사용 하 여 펩 티 드의 단백질 소화를 포함 4 극 자 질량 분 서 계입니다. 이 방법의 제한 사항 중 하나 때 관심의 펩타이드는 "동일한" 전조와 조각 질량 (m/z 값)에서 다른 공동 eluting 펩 티 드 (1-다 창) 내에서 샘플에 관찰 하는 간섭 현상입니다. 이 현상을 방지 하려면 다른 대량 spectrometric 접근, 고해상도 (rs ~ 30000) 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리 결합 하 여 높은 선택도 (HS) MRM 분석 결과 제안 한다 펩 티 드 파편의 MS 검출. 우리는 낮은 풍부 펩타이드 표준 단일 클론 항 체 (mAb) 다이제스트에 아군과 감도 및 동적 범위 (최소 3 배나) 일반적으로 HCP에 달성 있다는 증명 계량에이 방법의 기능 탐구 분석입니다. 모든 6 개의 펩 티 드 기준 0.1로 낮은 농도에서 발견 된 높은 풍부 펩 티 드 배경 (mAb 다이제스트 로드에-열 2 µ g) 존재 nM (1 femtomole 2.1 m m ID 컬럼에 열에 로드 된). 토끼 phosphorylase (97.2 kDa), 아군된 펩 티 드 파생 했다 MW를 고려할 때이 분석 결과의 LOQ는 50 ppm 보다 낮습니다. 피크 넓이의 상대 표준 편차 (RSD) (n = 4 복제) 조사 전체 농도 범위에 걸쳐 15% 미만 했다 (0.1-100 nM 또는 1-1000 ppm)이이 연구에서.
Introduction
산업 설정에서 큰 생체 (단백질)의 정량화는 현재 기반 immunoassays (예를 들어, ELISAs), 여러 장점으로 인해 주로: 감도, 높은 처리량, 사용의 용이성 및 샘플 당 낮은 비용. 하지만 그들은 일반적으로 제공 총 HCP 농도 (일반적으로 ppm 또는 표현 ng HCP/mg mAb)을이 생물학 분석 실험 단백질 치료제에 낮은 풍부한 단백질 불순물 (호스트 세포 단백질 (HCPs)의 1-100 ppm) 분석에 적용 하면, 식별 하 고 개별 HCP 오염 물질을 측정할 수 없습니다. 여러 MS 기반 분석 최근 ELISAs를 보완 하거나 ELISAs 실패1,2,3,4,,56 을 제공 하는 정보를 제공 하도록 개발 되었습니다. , 7 , 8 , 9. 샘플 복잡성과 HCP 펩 티 드 농도 (적어도 3 배나)에 넓은 동적 범위에 걸쳐 검색 요구 사항, 때문에 광범위 한 샘플 분류를 입찰 하는 다차원 크로마 방법 있다 전통적으로 낮은 풍부 HCPs1,2,3,,45,6,7을 식별 하는 데 고용 되었다.
자연 HCP 식별 다음 단계와 검증은 HCP 추적 (모니터링) 바이오의 여러 일괄 처리에서. 이 상황에서 단일 차원 LC/MS 방법 샘플 처리량8,9를 개선 하기 위해 제안 되었습니다. 그러나, 정확도 HCP의 동적 범위 측정 수도 영향을 받을 1 D LC/MS 분석 결과에서 의약품 펩 티 드의 압도적인 존재. 다차원 별거에 비해, 신호 간섭19,20,,2122 에 대 한 잠재적인 증가 차원 컬럼에 분리에서 때문에 대 한 확률 공동 eluting 되도록 더 많은 펩 티 드 선구자 증가 된다. 펩 티 드 선구자 컬럼에 분리 시간을 연장 하지 않고 분리 직교 의미의 명확 하 게 유리할 것 이다. 여행 웨이브 이온 이동성 (TWIM)10 밀리초에 혼잡 한 MS 스펙트럼을 해결 하는 기능이 있다. 약 500 이동성 분판 한 단일 펩 티 드의, 10의 전체 크로마 피크 폭 가정 차입 기간 동안 실행 될 수 있다 s 그리고 이온 이동성 악기에 IM 분리의 런타임 20 ms는 고려.
단백질 정량화에 대 한 대량 spectrometric 분석 지난 성공적으로 개발 되었습니다 10 년 잘 허용 사용 하 여 선택 (여러) 반응 모니터링 방법 (SRM/MRM 방법) 탠덤 질량 분석기11, 구현 12,13,14,15,,1617,18,19,20,21 ,,2223. 이 저해상도 대량 spectrometric 분석 결과의 한계 중 하나는 간섭 현상19,20,21,22 의 펩 티 드 "같은" 때 관찰은 전조와 조각 대량 다른 공동 eluting 펩 티 드 (1-다 창) 내에서 샘플에 존재. SRM/MRM 방법의 정확성을 개선 하는 방법은 두 가지: 1 옵션 포함 다른 옵션을 전조/조각 검출의 MS 해상도 증가 하는 동안 방해 선구자 이온을 제거 하는 전조 수준 추가 분리 단계 겹치는 MS 신호를 하지 마십시오. 높은 선택도 (HS) MRM 획득 모드 설명 여기 활용 방법 모두 고해상도 (rs ~ 30000) 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리 결합 하 여 펩 티 드 파편의 MS 검출. 분석 결과 설명 여기 커버 최소한 3 개의 크기 순서, 동적 범위를 일반적으로 SRM/MRM proteomics 실험17,,1824에서 관찰.
HCP 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과의 유틸리티는 단일 클론 항 체 다이제스트에서 다양 한 농도 (0.1-100 nM 범위)에서 아군 6 펩 티 드 기준 생산 신호의 선형성을 모니터링 하 여 시연 했다.
Protocol
1. infliximab 다이제스트 (~ 24 h 절차)의 준비
- 50mm 염화 중 탄산염, 1% 음이온 계면 활성 제 50mm NH4HCO3, 500 m m dithiothreitol (DTT) 50mm NH4HCO3, 및 50 mM NH4HCO3500 m m iodoacetamide (IAM)의 신선한 솔루션을 준비 합니다.
- 50mm NH4HCO3의 750 µ L에 infliximab mAb (10mg/mL)의 200 µ L와 1%의 음이온 계면 활성 제 용액의 50 µ L을 추가 하 고 0.05% 음이온 계면 활성 제 존재 60 ° C에서 15 분 동안 단백질을 변성.
- 500 mM DTT의 40 µ L을 추가 하 고 20mm DTT의 면 전에 서 60 ° C에서 60 분에 대 한 샘플을 줄일.
- 500 mM IAM의 20 µ L을 추가 하 고 ~ 10 mM IAM의 어둠 속에서 실 온에서 30 분에 대 한 샘플을 알.
- MS 시퀀싱 급 리스 C/trypsin의 20 µ g를 포함 하는 유리 유리병에 microcentrifuge 튜브의 내용을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 소화
- MS 시퀀싱 급 리스 C/트립 신 다이제스트 샘플 하룻밤 (12-15 h) 37 ° c.에서의 20 µ g를 포함 하는 다른 유리 유리병을 소화 샘플을 전송 하 여 두 번째 효소 aliquot (20 µ g)를 추가
- 하룻밤 베이스 후 100% 포 름 산 (FA)의 5 µ L을 추가 하 고 산 성 정한 음이온 계면 활성 제를 분해를 37 ° C에서 30 분에 대 한 다이제스트를 품 어.
- 음이온 계면 활성 제의 불용 성 구성 요소 침전을 원심 분리기에 4000 x g에서 15 분에 대 한 다이제스트 아래로 회전 합니다.
- ~ 1000 µ L infliximab 다이제스트의 복구를 액정 자동 샘플러 유리병; 다이제스트 농도 ~ 2 mg/mL 해야 합니다. LC/MS 시스템 분석에 대 한 준비가 될 때까지는-20 ° C에서 냉동 실에 다이제스트를 저장 합니다.
2. 급상승 펩타이드 표준 (~ 30 분)
- 실 온에서 벤치에 유리 유리병에 냉동된 샘플을 배치 하 여 infliximab 다이제스트를 녹여.
- 유리병 (유리병 각 펩 티 드의 1 nmol 포함)에 포함 된 FA H 한 토끼 phosphorylase b (포)2O 다이제스트 유리병에 1 µ M 포 라고에서 모든 6 개의 펩 티 드 표준에 대 한 재고 솔루션을 준비 하는 0.1%의 1 mL를 추가 합니다.
- 0.1, 1, 10, 및 100 nM 펩 티 드, 0.1%를 사용 하 여 포함 하는 솔루션을 얻기 위해 포 재고 솔루션의 4 x 1 mL 희석 준비 희석 용 매로 FA. 유리 튜브 (LC 자동 샘플러 튜브)에 모든 희석을 준비 하 고 모든 튜브에 배경 매트릭스로 infliximab 다이제스트의 100 µ L를 추가 합니다. 각 10 µ L 주입으로 열에 다이제스트 배경 2 µ g를 로드 합니다. 희석된 infliximab 다이제스트를 포함 하는 빈 샘플 준비 (동일한 1시 10분 희석), 아무 아군된 펩 티 드와 함께.
3. LC/HDMS 전자 데이터 수집 방법의 설정
주: HS MRM 인수를 설정 하는 데 필요한 단계를 요약 하는 워크플로 그림 1에 묘사 되 고 섹션 3-6에 자세히 설명 되어. 데이터 독립적인 HDMS전자 데이터 집합의 수집 각 모니터링된 펩 티 드, 분무 이온화, 다음 가장 풍부한 펩 티 드 이온의 부모 m/z의 보존 기간을 설정 하는 데 필요한 및 해당 CCS (collisional 크로스 섹션) 이온 이동성 분리에서 파생. 또한, 데이터 독립적인 집합 각 펩 티 드 선구자에 대 한 3 개의 가장 풍부한 조각 이온의 m/z에 관한 정보를 제공합니다. 워크플로 (CE 최적화)의 두 번째 단계에서는 분석 결과의 감도 조정 각 조각 이온에 대 한 높은 이온 강도를 충돌 세포 에너지 증가 됩니다. 마지막으로, 마지막 단계에서 위에서 설명한 모든 매개 변수 모니터링 각 펩 티 드에 대 한 HS MRM 기가에 소개.
- 4 중 극 비행 시간 (QTOF) 질량 분석기 (HDMSE) 독립적인 데이터 수집 방법을 사용 하 여 울트라 고성능 액체 크로마토그래피 시스템에 결합에 LC/MS 실험을 수행 합니다.
참고: 악기 구성에 관한 자세한 내용은 소재 섹션에 포함 됩니다. 이 악기는 펩 티 드 선구자10의 분리에 대 한 여행 파 이온 이동성 장치를 사용합니다. - 0.1% 물 (용 매 A)에서 FA와 0.1%를 포함 하는 두 모바일 단계 준비 이기 (용 매 B)에서 FA.
참고: 아군된 mAb 다이제스트의 분리에 대 한 청구 표면 하이브리드 (CSH) C18 열 (2.1 x 150 m m, 1.7 µ m 입자와 포장)를 사용 합니다. - 데이터 수집 소프트웨어에서 "만들기/분석 방법"에 클릭 하 고 선택 "인수를 생성 하 고 처리 하는 방법." 메서드 이름을 입력, 방법 폴더 (디렉토리)를 탐색 하 고 "다음"을 클릭
- "분석 유형"에 대 한 "펩 티 드 지도 (IMS),"를 선택 하 고 "악기 시스템" 탭에서 "제 사기 용 매 관리자" 악기를 선택 합니다. 200 µ L/분 사용 용 매 B 30 분에서 뒤에 2 분 열 세척과 9 분 평형 40 %1에서 그라데이션 차입의 유량에서 펩 티 드 분리를 달성, 50 분의 총 런타임은 이러한 실험 소개 그라데이션 설정 편집 LC 메서드 편집기에서 매개 변수입니다.
- "악기 시스템" 탭에서 "샘플 관리자" 악기를 선택 합니다. 샘플 온도 10 ° C와 60 ° c 열 온도를 설정합니다
- 긍정적인 이온 30000 FWHM의 전형적인 해결 능력으로 ESI 감도 모드에서에서 QTOF 질량 분석기를 작동 합니다.
참고: 낮은 에너지 (MS 채널 1 스캔에 대 한 6 V)와 높은 에너지 (15-40 V 경사로 사이 LC/HDMSE 는 빠르게 검사 (충돌 셀)에 충돌 에너지를 교류를 수집 하 여 운영 하는 독립적인 데이터 수집 (디 아) 모드 MS 채널 2에서에서 전조 선택 없이 조각화 스펙트럼 생성).- 데이터 수집 소프트웨어에 기본 소스 관련 MS 매개 변수를 입력: "내 작품/악기 시스템,"에서 "Vion IMS Qtof" 탭을 선택 하 고 "도구" 메뉴에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 100 ° C 소스 온도, 100 V 소스 오프셋, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 40 V 콘 전압. Desolvation 온도 250 ° C, 500 L/h, desolvation 가스 유량 및 설정 3.0 기준 모 세관 전압 kV.
- 데이터 수집 소프트웨어에서 "만들기/분석 방법"에 클릭 하 고 선택 "인수를 생성 하 고 처리 하는 방법." 메서드 이름을 입력 하 고 메서드 폴더 (디렉토리)를 이동한 다음 클릭 합니다 "다음."
- "분석 유형"에 대 한 "펩 티 드 지도 (IMS),"를 선택 하 고 "악기 시스템" 탭에서 "Vion IMS QTof" 악기를 선택 합니다. 마침 클릭 합니다 "."
참고: 새로 만든된 LC/HDMSE 방법 "악기 방법 구성" 화면에서 자동으로 열립니다. - "설정" 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 소스 온도 100 ° C, 250 ° C desolvation 온도, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 500 L/h desolvation 가스 흐름.
- "실험" 탭 설정에서 "높은 정의 MSE"를 선택 하 고 선택 "분석 방법은 런타임입니다." "검색 설정" 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 낮은 질량, 100; 높은 질량, 2000; 그리고 검색 시간, "CE" 탭에서 400 양 낮은 에너지 설정에 대 한 "6 V"를 입력 하 고 "사용 안 함 데이터 감소" 체크를 확실히 확인 대 40 15에서 에너지 램프를 선택.
- 50 ng/mL, 신 enkephalin (르) 0.1%와 50% 이기에 준비의 솔루션에 주입 잠금 질량 캘리브레이션 데이터 수집 중에 10 µ L/min의 유량에서 FA.
참고: 잠금-대량 데이터 같은 대량 범위 같은 획득 율을 사용 하 여 모든 5 분 획득 됩니다.
- (열에 로드 하는 금액은 각 펩 티 드 표준에 대 한 100 fmol) 샘플의 10 µ L를 주입 하 여 위에서 설명한 LC/HDMSE 분석 결과 사용 하 여 10 nM, 포 아군 샘플을 분석 합니다.
4. 충돌 에너지 (CE) 최적화를 위한 Tof MRM 방법의 설정
- LC/HDMS전자 데이터 집합에서 보존 기간, 선구자, 및 각 포 펩 티 드에 대 한 조각 이온 m/z를 얻을. M/z와 가장 풍부한 대 한 충전 상태를 유지 선구자 이온 및 가장 풍부한 해당 3 조각 이온.
참고: 일반적으로 LC/HDMSE 분석 결과 의해 기록 된 낮은 에너지 및 에너지 스펙트럼의 예는 그림 2에 표시 됩니다. - SRM/MRM 실험에서 충돌 에너지 (CE) 최적화를 사용 하 여 각 펩 티 드23에 대 한 최고의 신호를 얻으려면.
- 데이터 수집 소프트웨어에서 "만들기/분석 방법"에 클릭 하 고 선택 "인수를 생성 하 고 처리 하는 방법." 메서드 이름을 입력, 방법 폴더 (디렉토리)를 탐색 하 고 "다음"을 클릭
- "분석 유형," 선택 "계량" "계량 분석 결과 크로마 Tof 2D"를 선택 하 고 클릭 합니다 "." "악기 시스템" 탭에서 "Vion IMS QTof"를 선택 하 고 마침 클릭 합니다 "."
참고: 새로 만든된 Tof MRM 메서드는 "악기 방법 구성" 화면에서 자동으로 열립니다. - "설정" 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 소스 온도 100 ° C, 250 ° C desolvation 온도, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 500 L/h desolvation 가스 흐름.
- "실험" 탭 설정에서 "함수 테이블"을 선택 하 고 선택 "하나 이상의 MS, MSM 또는 MRM 기능." 아래쪽 화살표를 사용 하 여, 3 "전환" (가장 풍부한 전조와 그것의 가장 풍부한 조각 이온의 3의 조합)를 입력 하 여 각 펩 티 드에 대 한 "Tof-MRM" 기능을 설정 합니다.
참고: Tof MRM 모드에서 높은 감도 달성 예정 된 MRM 접근을 사용 하 여. - "Tof-MRM" 함수 편집기에서 선택 각 펩 티 드 (적어도 1 분 긴), 대 한 보존 시간 창 펩 티 드 차입 순서에 따라 정렬 합니다. "Tof-MRM" 함수 편집기에서 삽입 펩 티 드 선구자 m/z와 제품 m/z; 펩 티 드 선구자;에 대 한 "낮은" (창 4 다) 쿼드 격리 창 선택 100 밀리초; 고정된 검색 시간을 선택 14-36 V의 범위에서 12 개의 다른 충돌 에너지 값을 다음과 같이 선택 하 고: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 그리고 36, 그림 3에서 예제 에서처럼.
참고: 위에서 설명한 Tof MRM 방법으로 크로마 피크 당 적어도 10 데이터 포인트 각 전환에 지정 된 각 CE에 대해 수집 됩니다. 데이터 파일 크기를 줄이려면 조각 이온의 신호 (창 6-다) "넓은" 옵션을 선택 합니다. CE 최적화 값의 예는 표 2에 표시 됩니다. - (열에 로드 하는 금액은 각 펩 티 드 표준에 대 한 100 fmol) 샘플의 10 µ L를 주입 하 여 위에서 설명한 Tof MRM 분석 결과 사용 하 여 10 nM, 포 아군 샘플을 분석 합니다.
5. 펩 티 드 선구자의 이온 이동성 분리를 사용 하 여 펩 티 드 정량화에 대 한 최종 HS MRM 수집 방법의 설정
- 데이터 수집 소프트웨어의 "조사" 메뉴에서 모든 펩 티 드에 대 한 각 CE에 대해 생성 된 모든 11 크로마 흔적을 표시 하 고 봉우리는 "처리 옵션/작업" 도구 모음;에서 "통합" 버튼을 사용 하 여 통합 높은 피크 지역 각 전환에 대 한 최고의 CE 표시 됩니다.
- 시각적으로 각 펩 티 드의 3 조각에 대 한 최고의 피크 넓이 비교 하 고 유지만 최고 "전환" (조각 이온 가장 강한 신호를 생성 하는); 표 2는 최고 4 개의 포 펩 티 드에서 얻은 "전환"이 표시 됩니다.
- 펩 티 드 당 하나의 조각 이온을 포함 하는 HS MRM 메서드를 설치. LC/HDMS전자 데이터 집합에서 각 펩 티 드 선구자의 CCS 값을 사용 합니다.
- "Tof-MRM" 기능 대신 "HS-MRM" 기능을 선택 하 여 이전 섹션 (제 4)에서 만든 Tof MRM 메서드를 수정 합니다.
- "HS-MRM" 함수 편집기에서 다음과 같은 전조 관련 매개 변수를 입력: m/z, 4 중 극 해상도: 낮은 (4 다), 충전 상태, 전조 CCS 값 및 전조 CCS 해상도: 낮은. 제품 이온의 m/z, 최적의 충돌 에너지 입력, 0.4 s와 선택의 검색 시간을 선택 "" 광범위 한 설정 (6 다) 그것의 동위의 모든 포함 하도록. 모든 4 개의 펩 티 드에 대 한 최종 HS MRM 수집 방법의 예는 그림 4에 표시 됩니다.
- 모든 샘플 mAb 다이제스트 빈 시작 HS MRM 방법을 사용 하 여 (비 아군 샘플), 뒤에 다음과 같은 농도의 4 복제 주사 (10 µ L 각) 분석: 0.1, 1, 10, 및 100 nM 포 펩 티 드.
6. 창조의 HS MRM 데이터 집합의 분석에 대 한 처리 방법
- HS-MRM 데이터 집합의 분석에 대 한 처리 메서드를 만듭니다.
- 분석 방법 "HS-MRM" 데이터 수집 방법에 대 한 생성, "목적" 탭을 클릭 하 고 선택 "관리 구성 요소."
- "실험 유형" 드롭다운 메뉴에서 "HS MS/MS/HS-MRM" 옵션을 선택 합니다.
- "만들기/새 항목"을 클릭 하 고 처리 메서드 편집기에서 다음 매개 변수를 소개: 펩 티 드 보존 시간 (RT), 전조 충전 상태, 전조 m/z, 그리고 전조 드리프트 시간 (DT). 조각 이온에 대 한 m/z 및 충전 상태를 입력 하 고 "XIC" 추적 추출 모드를 지정 합니다.
- 같은 "HS-MRM" 수집 방법의 "목적" 탭에서 "기본 금액"에 클릭 하 고 다음 농도 입력: 0.1, 1, 10, 및 100 nM 포 펩 티 드.
- "처리/추출 설정"에서 다음 매개 변수를 입력: 기본 대량 관용, 10 ppm (모든 조각 이온의 m/z)에 대 한 기본 시간, 5%; 드리프트 포 펩타이드 처리 방법의 예는 그림 5에 표시 됩니다.
- 교정 유형에 대 한 선형 커브 피팅 1 /2 가중치 X를 선택 합니다.
- 모든 chromatograms를 통합 하 고 각 포 펩 티 드의 보정 곡선을 건설 하기 위하여 HS MRM 데이터를 처리 합니다.
Representative Results
6 phosphorylase b 펩타이드 표준 포 펩 티 드 혼합물에 포함 된 개별 시퀀스 보존 시간을 함께 표 1에 표시 되 고 그들의 가장 풍부한 선구자 HDMSE 에서 관찰 실험. 높은 선택도 (HS) MRM 분석 결과의 개발의 첫 번째 단계는 해당 가장 함께 각 포 펩타이드의 차입 시간 설정 하 HDMS전자 데이터 집합의 인수 풍부한 전조와 3 개의 가장 풍부한 조각. 그림 2 HDMS전자 스펙트럼 중 포 펩 티 드 (Pep 6) infliximab 다이제스트에 아군에 대 한 인수를 표시 합니다. 3 최고 각 펩 티 드에 대 한 "전환" (선구자 및 조각 질량의 조합)을 설정한 후 Tof MRM 실험 각 펩 티 드에 대 한 발생 하는 신호를 극대화 하기 위해 최적의 충돌 에너지를 찾기 위해 수행 됩니다. CE 최적화 실험의 결과 표 2에 요약 되어 있습니다. 최종 HS MRM 분석 결과 최고 각 펩 티 드에 대 한 "전환"을 유지 하 고 모든 아군된 샘플을 분석 하는 데 사용 됩니다 (그림 4 참조). HS-MRM chromatograms 조사 모든 농도에서 4 포 펩 티 드에 대 한 생성의 예는 그림 7에 표시 됩니다. 4 교정 곡선 얻은 각 펩 티 드 다음 그림 7에서 강조 하는 HS MRM 봉우리의 통합 그림 8에 표시 됩니다. 또한, 피크 지역 상대 표준 편차, 계산된에 따라 4 복제 주사는 4 테이블 표 3에 표시 된 요약.
| 펩 티 드 | 펩 티 드 | 보존 | 충전 상태 | ||||
| ID | 시퀀스 | 시간 (분) | + 1 | + 2 | + 3 | + 4 | |
| 흠 1 | VLYPNDNFFEGK | 19.4 | 1442.6951 | 721.8512 | 481.5699 | 361.4292 | |
| 흠 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16.0 | 1874.9065 | 937.9569 | 625.6404 | 469.4821 | |
| 흠 3 | IGEEYISDLDQLRK | 18.9 | 1678.8646 | 839.9360 | 560.2931 | 420.4716 | |
| 흠 4 | LLSYVDDEAFIR | 21.1 | 1440.7369 | 720.8721 | 480.9172 | 360.9397 | |
| 흠 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19.7 | 1890.0080 | 945.5076 | 630.6742 | 473.2574 | |
| 흠 6 | VFADYEEYVK | 17.7 | 1262.5939 | 631.8006 | 421.5362 | 316.4039 | |
표 1입니다. 포 펩타이드 표준 infliximab 다이제스트에 아군 질량 준비 믹스에 포함 된. 펩 티 드 보존 시간과 그들의 가장 풍부한 선구자 (굵게 강조 표시)를 테이블 형식으로 표시 됩니다.
| 펩 티 드 | 펩 티 드 | 보존 | 펩 티 드 선구자 | 가장 풍부한 조각 이온/충전 | 최적 | ||||
| ID | 시퀀스 | 시간 (분) | m/z 및 충전 | 드리프트 시간 (밀리초) | 난 | 2 세 | 3 세 | CE (V) | |
| 흠 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16.0 | 625.6404 (+ 3) | 6.2 | 714.3781 (+ 1) | 807.4177 (+ 2) | 827.4621 (+ 1) | 24 | |
| 흠 4 | LLSYVDDEAFIR | 21.1 | 720.8721 (+ 2) | 7.5 | 865.4050 (+ 1) | 964.4734 (+ 1) | 1214.5688 (+ 1) | 22 | |
| 흠 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19.7 | 630.6742 (+ 3) | 6.3 | 642.3570 (+ 1) | 689.8391 (+ 2) | 832.4236 (+ 2) | 20 | |
| 흠 6 | VFADYEEYVK | 17.7 | 631.8006 (+ 2) | 7.0 | 830.3931 (+ 1) | 945.4200 (+ 2) | 1016.4571 (+ 1) | 24 | |
표 2입니다. Tof MRM 최적화 실험의 결과: 해당 최적화 된 충돌 에너지와 함께이 연구에서 계량 하 각 포 펩 티 드의 3 개의 가장 풍부한 조각 표시 됩니다.
| 광 | 금액 | 흠 2 피크 지역 (표 3A) | |||||
| (nM) | 열에 (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | 평균 | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 490 | 439 | 462 | 431 | 456 | 5.8 |
| 1 | 10 | 5121 | 4842 | 5198 | 4842 | 5001 | 3.7 |
| 10 | 100 | 63853 | 64279 | 66111 | 62509 | 64188 | 2.3 |
| 100 | 1000 | 612392 | 605553 | 613229 | 611004 | 610545 | 0.6 |
| 광 | 금액 | 흠 4 피크 넓이 (테이블 3B) | |||||
| (nM) | 열에 (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | 평균 | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 275 | 359 | 325 | 288 | 312 | 12.2 |
| 1 | 10 | 3559 | 3694 | 3287 | 3754 | 3574 | 5.8 |
| 10 | 100 | 45259 | 45775 | 42976 | 45548 | 44890 | 2.9 |
| 100 | 1000 | 459374 | 467927 | 436272 | 458994 | 455642 | 3.0 |
| 광 | 금액 | 흠 5 피크 넓이 (테이블 3C) | |||||
| (nM) | 열에 (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | 평균 | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 3194 | 3243 | 3202 | 3257 | 3224 | 1.0 |
| 1 | 10 | 31464 | 31150 | 31464 | 31433 | 31378 | 0.5 |
| 10 | 100 | 313638 | 320712 | 311943 | 311943 | 314559 | 1.3 |
| 100 | 1000 | 2845736 | 2840031 | 2882006 | 2864052 | 2857956 | 0.7 |
| 광 | 금액 | Pep 6 피크 넓이 (차원 테이블) | |||||
| (nM) | 열에 (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | 평균 | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 490 | 583 | 440 | 440 | 488 | 13.8 |
| 1 | 10 | 6429 | 6429 | 6848 | 6623 | 6582 | 3.0 |
| 10 | 100 | 71295 | 70400 | 71563 | 70400 | 70915 | 0.9 |
| 100 | 1000 | 707640 | 707640 | 694461 | 729490 | 709808 | 2.0 |
표 3입니다. HS-MRM chromatograms의 피크 넓이 포함 하는 테이블 4 포 펩 티 드 (2, 4, 5, 및 6 Pep)에 대 한 각 LC/MS 주입 (16 LC/MS 실행 및 테스트 4 농도)에 대 한 기록.
상대 표준 편차 조사 전체 농도 범위에서 모든 펩 티 드에 대 한 15% 보다 더 나 았다.
그림 1입니다. HS-MRM 인수 메서드를 설정 하는 데 필요한 세 단계를 요약 하는 워크플로 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. HDMSE 데이터의 예:
(A) 낮은 에너지 스펙트럼 Pep 6 선구자 이온을 보여주는. (상위 3 가장 풍부한 조각 이온 (동그라미) Tof MRM 충돌 에너지 최적화 선택 표시 같은 펩 티 드의 B) 고 에너지 조각화 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 매개 변수는 Tof MRM 최적화 설정에 사용 되는 실험.
각 전환에 대 한 11 개의 충돌 에너지 (16 ~ 36 V의 범위)에서 테스트 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 최종 HS MRM 방법의 예입니다.
여러 매개 변수는 각 "전환" 펩 티 드 선구자 m/z, 충전 상태 및 이온 이동성 드리프트 시간, 가장 풍부한 조각 이온, 최적의 충돌 에너지와 MS 획득 시간의 m/z를 포함 하 여 필요 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. HS-MRM 데이터 집합을 분석 하기 위한 처리 방법에서 사용 하는 설정입니다.
각 펩 티 드 단일 "전환" 펩 티 드 선구자 m/z에 의해 기술에 의해 모니터링 하 고 충전 상태, 가장 풍부한 조각 및 충전 상태로의 m/z와 함께 보존 기간, 예상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 이온 이동성 질량 분석기의 다이어그램입니다.
HS-MRM 수집 모드에서 계량 되는 펩 티 드의 선구자 이온 이동성 셀, 4 중 극에 의해 분리 하 고 고정된 충돌 에너지에 조각에 다른 공동 eluting (간섭) 펩 티 드 선구자에서 분리는 충돌 셀입니다. 신호 펩 티 드 파편 이온에 의해 생산은 미는 주파수를 조정 하 여 향상 및 펩 티 드 정량화 높은 MS 해상도 사용 하 여 수행 됩니다 (> 30000) 각 펩 티 드의 가장 강렬한 단편 이온 생성 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. HS-MRM chromatograms 4 다른 농도 3 배나 확장에 4 포 펩 티 드에 대 한 기록 (0.1, 1, 10, 및 100 nM).
(A) 흠 2 chromatograms, (B) 흠 4 chromatograms, (C) 흠 5 chromatograms, 그리고 (D) 흠 6 chromatograms. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8입니다. 4 다른 농도 걸쳐 4 포 펩 티 드에 대 한 교정 곡선 (0.1, 1, 10, 및 100 nM).
각 곡선 아래 테이블은 각 테이블에서 두 번째 열에서 예상된 된 선형 응답 백분율 편차를 보여 각 주입에 대 한 기록 개별 피크 넓이 (Y-값)를 표시 합니다. (A) 흠 2 교정, (B) 흠 4 교정, (C) 흠 5 교정, 및 (D) 흠 6 교정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
고해상도 (Rs > 20000) 질량 분석 악기 플랫폼의 다양 한 치료 단백질의 구조적 특성에 대 한 정기적으로 사용 됩니다. 반면, MS 기반 단백질 정량화는 일반적으로에 의해 수행 SRM/MRM 저해상도 (Rs ~ 1000) 협동 사중 극 자 질량 분석기 서명 펩 티 드 단백질11,12 의 효소 분열에 의해 생성 된 사용 하 여 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 단일 차원 컬럼에 분판 완전히 복잡 한 펩 티 드 혼합물 효소 소화에 의해 생산을 확인할 수 없습니다, 펩 티 드 공동 차입은 단일 단백질 다이제스트의 경우에 일반적인 발생. (예를 들어, 1-100 ppms HCPs의 치료 단백질에 의해 생성 하는 펩 티 드-풍부한 배경 앞의 정량화에 대 한) 매우 복잡 한 단백질 다이제스트, 감도, 정확도, 또는 SRM/MRM의 선형성에 대 한 분석 결과 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 합니다.
SRM/MRM 분석 전조/조각 중의 "독특한" 결합에만 의존 하는 unidimensional 선택 도가 있다. 이러한 이유로,이 분석 실험 실패 상황에서 펩 티 드 배경 예기치 않게 변경 될 때 (예를 들어, 의약품 샘플에 대 한 다른 정화 절차에서 얻은). 이러한 한계를 극복 하기, 우리 제안 여기는 이온 이동성 기반 고해상도 4 중 극 비행 시간 (QTOF) 하이브리드 질량 분석기에 구현 높은 선택도 (HS) MRM 분석 결과 (악기 다이어그램 그림 6 참조).
악기 관심의 펩 티 드의 선구자 이온 이동성 셀에 다른 공동 eluting (간섭) 펩 티 드 선구자에서 분리, 4 중 극에 선구자의 전체 동위 봉투를 격리 하 고 고정 ce에 조각 된 충돌 셀입니다. 그것의 가장 풍부한 펩 티 드 조각에 의해 생성 하는 신호는 선택적으로 못 살게 굴지의 대량 지역 모든 이온, 보다는 오히려 비행 튜브로 전체 검사와 마찬가지로 미는 주파수 (대상 향상), 조정 하 여 더 향상 됩니다. 펩 티 드 부 량이 조각 이온에 의해 생성 하는 높은-MS-해상도 (Rs ~ 30000) 신호를 사용 하 여 수행 됩니다. SRM/MRM 분석 실험과 비교해, HS MRM 분석 결과 선택도의 두 개의 추가 수준을 제공 합니다: 두 번째 TOF 분석기의 증가 대량 해결책에 의해 제공 하나 전조 수준 이온 이동성 분리에 의해 제공 됩니다. 이러한 선택도 개선에 의해 가져온 결과 그림 7에 표시 된 3 개의 크기 순서에서 방해의 무료는 HS MRM chromatograms에서 볼 수 있습니다.
SRM/MRM 분석 달리는 HS MRM 분석 실험을 최적화 하기 위해 조정 될 수 있는 몇 가지 매개 변수: (일반적으로 0.2 분 설정) 펩 티 드 선구자, 4 극 자 격리 창 (4 다), 드리프트 시간대 RT 창 주위는 전조 (± 해당 이온 mobilogram에서 전조 피크의 FWHM), 그리고의 조각 이온 (20000-40000) MS 해상도. HS-MRM 분석 실험은 매우 민감한: 검색 된 각 포 펩 티 드에 대 한 최저 금액은 1 femtomole에 열 (또는 0.1 nM 펩 티 드 농도 점에서). 펩 티 드 MW를 고려할 때 (정확한 MWs 표 1 참조), 양을 발견에 열 1-2 페이지, 순서 열 mAb 다이제스트에서 배경 펩 티 드의 상당히 높은 금액 (2 µ g)와 함께 로드 되는 동안.
아군된 펩 티 드 파생 했다 전장 포 단백질 (97.2 kDa)의 분자량을 고려 하 여 분석 결과 고 풍요 배경 이온의 존재는 단백질 불순물의 50 ppm 검출 수 있다. (5-10 ppm) 검출의 더 낮은 한계 더 낮은 분자량 HCPs (10-20 kDa)에 대 한 달성할 수 있다. 분석 결과 3 개의 크기 순서 (에서 같이 보정 곡선 그림 8에서), 그것은 1-1000 ppm 범위에서 HCPs를 측정할 수 있는 즉 다룹니다. 또한, 표 3에 나와 있는 HS MRM 분석 실험의 재현성 피크 면적 RSDs 15% 보다 더 작은 분자 SRM/MRM 분석 실험의 재현성 매우 잘 일치 합니다.
우리 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체 (mAb) 소화에서의 정량화에 대 한 새로운 분석 결과의 기능을 탐색 하 고 그것의 감도 넓은 동적 범위 (적어도 3 개의 크기 순서)를 일반적으로 커버 하는 유틸리티 설명 HCP 분석에서 발생 했습니다. 모든 6 개의 펩 티 드 기준 0.1로 낮은 농도에서 발견 된 높은 풍부 펩 티 드 배경 (mAb 다이제스트 로드에-열 2 µ g) 존재 nM (1 femtomole 2.1 m m ID 컬럼에 열에 로드 된). 통합 함으로써 타겟된 HRMS와 이온 이동성 전조 분리, HS MRM 분석 결과 바이오의 여러 일괄 처리에서 여러 HCPs에 대 한 빠르고, 높은 처리량 모니터링 분석 결과 되기 위한 큰 잠재력이 있다.
Disclosures
모든 저자는 여러 가지 시 약 및이 문서에서 사용 된 계기의 생산 물 법인의 직원.
Acknowledgments
저자는 레슬리 Malouin 및 바다 기업에서 토니 Catlin 그림 6의 원고를 준비 하 고 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
| Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
| Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
| Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
| 2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
| Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
| LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
| Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
| Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50) | Eppendorf | 22431102 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
| Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |
References
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