Summary
כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.
Abstract
הניתוח של זיהומים חלבון ברמה נמוכה (1-100 ppm) (למשל, התא המארח חלבונים (HCPs)) חברת חלבון הוא assay מאתגר הדורשים רגישות גבוהה ויכולת טווח דינמי רחב. מבחני כימות מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים כרוך בדרך כלל לעיכול חלבון ואחריו התגובה ניטור/ריבוי סלקטיבי התגובה ניטור (רלוקטנציה ממותג/MRM) כימות של פפטידים באמצעות זוגיים (Rs ~ 1000) ברזולוציה נמוכה פאול ספקטרומטר מסה. אחת המגבלות של גישה זו היא התופעה להפרעה נצפו כאשר פפטיד עניין יש את קודמן "אותו" ואת קטע המוני (מבחינת ערכים מ/z) כמו פפטידים eluting שיתוף אחרים נוכח המדגם (בתוך חלון 1-Da). כדי למנוע תופעה זו, אנו מציעים גישה spectrometric המוני חלופיים, וזמינותו MRM סלקטיביות גבוהה (HS) שמשלב ההפרדה ניידות יון של פפטיד סימנים מקדימים ברזולוציה גבוהה (Rs ~ 30,000) MS זיהוי של פפטיד קטעים. חרשנו את היכולות של גישה זו לכמת סטנדרטים נמוכים-שפע פפטיד עלה בתקציר נוגדנים חד שבטיים (mAb) ולא הוכיח כי יש את הרגישות ואת טווח דינמי (לפחות 3 סדרי גודל) שהושגה בדרך כלל HCP ניתוח. כל תקני פפטיד 6 זוהו בריכוזים המתחילים 0.1 nM (טעון על עמודה כרומטוגרפי של מזהה 2.1 מ מ 1 femtomole) בנוכחות פפטיד גבוהה-שפע רקע (2 µg של mAb תקציר טעון בעמודה). כאשר בוחנים את MW של ארנב phosphorylase (97.2 kDa), שממנו נשאבו של פפטידים מחודדים, LOQ של assay זו הוא נמוך יותר מאשר 50 ppm. סטיות תקן יחסית (RSD) של שיא אזורים (n = 4 משכפל) היו פחות מ 15% על-פני הטווח ריכוז כל חקירה (0.1-100 ננומטר או ppm 1-1, 000) במחקר זה.
Introduction
כימות של מולקולות גדולות (חלבונים) בהגדרות תעשייתי מבוסס כרגע על immunoassays (למשל, ELISAs), בעיקר בזכות מספר יתרונות: רגישות, תפוקה גבוהה, נוחות השימוש ועלות נמוכה עבור דגימה. בעת החלת לנתח חלבון נמוכה-שפע הטומאה (1-100 ppm של התא המארח חלבונים (HCPs)) נוכח חלבון הרפוי, מבחני ביולוגיים אלה מספקים בדרך כלל ריכוז HCP מוחלט (בדרך כלל לידי ביטוי ppm או ng HCP/mg mAb), אבל הם אין אפשרות לזהות ומדידת מזהמים HCP בודדים. לאחרונה פותחו מספר מבחני מבוססי MS כהשלמה ELISAs או לספק מידע ELISAs להיכשל מציעים1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. בגלל המורכבות של הדגימה ואת הדרישה לזהות פפטידים HCP על פני טווח דינמי רחב בריכוז (לפחות 3 סדרי גודל), יש רב-ממדי שיטות כרומטוגרפיות נכנס נרחב מדגם fractionation באופן מסורתי כבר מועסקים כדי לסייע בזיהוי נמוכה-שפע HCPs1,2,3,4,5,6,7.
טבעי צעד בעקבות זיהוי HCP והוא באימות HCP מעקב (מעקב) על פני קבוצות מרובות של תכשירי ביו. במצב זה, הוצעו שיטות LC/MS יחיד-מימד כדי לשפר את הדגימה תפוקה8,9. עם זאת, הדיוק ואת טווח דינמי של HCP מדידות עשוי להיות מושפע ב assay LC/MS 1 י על ידי נוכחות המכריע של פפטידים ביולוגיות. לעומת פרידה רב-ממדי, הפוטנציאל של האות הפרעה19,20,21,22 גדל בפרידה כרומטוגרפי יחיד-מימד כי ההסתברות מבשרי פפטיד יותר להיות שותף eluting הוא גדל. שילוב של אמצעים אורתוגונלית המפריד בין פפטיד מבשרי ללא הארכת הזמן ההפרדה כרומטוגרפי בבירור יהיה יתרון. מטיילים גל-יון-ניידות (TWIM)-10 יש את היכולת לפתור גדוש ספקטרה MS באלפיות שניה. כ-500 ניידות הפרדות יכול להתבצע במהלך • תנאי של פפטיד יחיד, בהנחה ברוחב מלא כרומטוגרפי שיא של 10 s ובהתחשב בעובדה זמן הריצה של ההפרדה IM על הכלי ניידות יון היא 20 ms.
מבחני spectrometric מסה על כימות חלבון פותחו בהצלחה במהלך העשור שימוש מקובל היטב נבחר התגובה (מספר) פיקוח על הגישה (שיטת רלוקטנציה ממותג/MRM) מיושמת טנדם ספקטרומטרים המונים11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 22, ,23. אחת המגבלות של assay המוני spectrometric ברזולוציה נמוכה זו היא הפרעה תופעה19,20,21,22 נצפו פפטיד של עניין יש את "אותו" קודמן פרגמנט פפטידים משותפת eluting מסה אחרים להציג את המדגם (בתוך חלון 1-Da). קיימות שתי דרכים כדי לשפר את הדיוק של השיטות רלוקטנציה ממותג/MRM: אפשרות אחת כרוכה שלב הפרדה נוספת ברמת קודמן כדי להסיר יונים קודמן מפריעות, ואילו האפשרות האחרת היא להגדיל את הרזולוציה MS של זיהוי קודמן/פרגמנט כדי הימנע אותות MS חופפים. מצב רכישה (HS) MRM סלקטיביות גבוהה שתואר כאן לוקח את היתרונות של שתי גישות אלה על ידי צימוד ההפרדה ניידות יון של סימנים מקדימים פפטיד עם ברזולוציה גבוהה (Rs ~ 30,000) MS זיהוי של פפטיד קטעים. וזמינותו המתוארים כאן מכסה לפחות שלושה סדרי גודל, שהוא בדרך כלל את הטווח הדינמי שנצפתה רלוקטנציה ממותג/MRM פרוטאומיקס ניסויים17,18,24.
השירות של HS-MRM וזמינותו על כימות HCP הודגם על-ידי ניטור על ליניאריות של אותות המיוצר על ידי סטנדרטים פפטיד 6 עלה בריכוזים שונים (טווח 0.1 - ל 100 ננומטר) בתקציר נוגדנים חד שבטיים.
Protocol
1. הכנת התקציר רמיקייד (הליך ~ 24 h)
- להכין טרי פתרונות של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט, 1% anionic חומרים פעילי שטח 50 מ מ NH4HCO3, 500 מ מ dithiothreitol (DTT) ב- 50 מ מ NH4HCO3ו- 500 מ מ iodoacetamide (IAM) HCO4NH 50 מ מ3.
- כדי µL 750 של 50 מ מ NH4HCO3, להוסיף 200 µL של mAb רמיקייד (10 mg/mL) ו- 50 µL של 1% פתרון anionic חומרים פעילי שטח, denature החלבון למשך 15 דקות ב 60 מעלות צלזיוס בנוכחות חומרים פעילי שטח anionic 0.05%.
- להוסיף 40 µL של 500 מ מ DTT ולהפחית את הדגימה עבור 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס בנוכחות 20 מ מ DTT.
- הוסף 20 µL של 500 מ מ IAM ' alkylate המדגם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך בנוכחות ~ 10 מ"מ יאם.
- להוסיף את התוכן של הצינור microcentrifuge בקבוקון זכוכית המכיל 20 µg של MS רצף-כיתה Lys C/טריפסין ולעכל את הדגימה עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף השני אנזים aliquot (20 µg) על-ידי העברת המדגם מתעכל בקבוקון זכוכית אחר המכיל 20 µg של MS רצף-כיתה Lys C/טריפסין..., תקציר המדגם בן לילה (12-15 h) ב 37 º C.
- לאחר proteolysis לילה, מוסיפים 5 µL של 100% חומצה פורמית (FA), דגירה לעכל את למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי לפרק את החומצה יציב anionic חומרים פעילי שטח.
- ספין למטה לעכל את למשך 15 דקות ב g x 4,000 ומפרידה, כדי לזרז את הרכיב קשי תמס של חומרים פעילי שטח anionic.
- לשחזר ~ 1,000 µL של התקציר רמיקייד ולמקם אותו המבחנה אוטומטי-סמפלר LC; ריכוז תקציר צריך להיות ~ 2 מ"ג/מ"ל. לאחסן את התקציר במקפיא ב-20 ° C עד שהמערכת LC/MS מוכן לניתוח.
2. עולה של פפטיד סטנדרטים (~ 30 דקות)
- להפשיר את התקציר רמיקייד על-ידי הצבת המדגם קפוא בבקבוקון זכוכית על ספסל בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 1 מ"ל של 0.1% פא ב H2O על אחד ארנב phosphorylase b (PHO) תקציר המבחנה להכין 1-מיקרומטר מלאי פתרונות עבור כל הסטנדרטים פפטיד 6 מ הטלפונים הכלול המבחנה (המבחנה מכילה nmol 1 של כל פפטיד).
- להכין 4 x 1-mL דילולים של הפתרון מניות PHO להשגת פתרונות המכיל 0.1, 1, 10 ו- 100 ננומטר פפטידים, באמצעות 0.1% פא כמו הממס דילול. להכין כל דילולים בצלוחיות זכוכית (בקבוקונים אוטומטית-סמפלר LC) ולהוסיף µL 100 של תקציר רמיקייד כמו המטריקס רקע כל המבחנות. לטעון µg 2 תקציר רקע על-עמוד עם כל זריקה 10-µL. להכין מדגם ריק המכיל את התקציר רמיקייד מדולל (1:10 באותו דילול), עם אין פפטידים מחודדים.
3. התקנה של שיטת רכישת נתונים LC/HDMS E
הערה: זרימת העבודה המסכמת את הצעדים הדרושים כדי להגדיר נכס HS-MRM מתואר באיור 1, מתואר בפירוט ב סעיפים 3-6. רכישת dataset HDMSE נתונים ללא תלות נדרשת כדי לקבוע את משך הזמן של כל פפטיד תחת פיקוח, האב מ/z של יונים פפטיד הנפוץ ביותר בעקבות ספקטרומטריית electrospray יינון, ואת המתאימה סמ ק (קרוס collisional מקטע) נגזר מן ההפרדה ניידות יון. בנוסף, הנתונים ללא תלות הנתונים (dataset) מספק מידע בנוגע ז/ז של היונים שבר שלוש הנפוץ ביותר עבור כל קודמן פפטיד. בשלב השני של זרימת העבודה (אופטימיזציה לסה נ), הרגישות של וזמינותו מתגברת על-ידי כיוונון התנגשות תא האנרגיה כדי לקבל את העוצמה יון הגבוהה ביותר עבור כל יון פרגמנט. לבסוף, בשלב הסופי, כל הפרמטרים המתוארים לעיל הם הציגו לעורך שיטת HS-MRM עבור כל פפטיד פיקוח.
- מבצע ניסויים LC/MS פאול זמן-של-טיסה (QTOF) ספקטרומטר מסה מצמידים למערכת ביצועים אולטרה כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות שיטת רכישת נתונים ללא תלות (HDMSE).
הערה: פרטים נוספים בנוגע לתצורת כלי הנגינה כלולים בסעיף גשמי. מכשיר זה משתמש במכשיר ניידות נודדת גל יון לצורך הקמת מכשול ההפרדה של פפטיד מבשרי10. - להכין שני שלבים נייד המכיל 0.1% פא במים (הממס A) ו- 0.1% פא acetonitrile (הממס B).
הערה: השתמש עמודה סי18 טעונה פני שטח היברידי (תגובת CSH) (2.1 x 150 מ מ, ארוז עם חלקיקים 1.7-מיקרומטר) דוגל בהפרדה בין מעכל mAb מחודדים. - בתוכנה רכישת נתונים, לחץ על "צור/ניתוח בשיטת" ובחר באפשרות "ליצור נכס ועיבוד שיטת". הקלד את שם פעולת השירות, דפדף אל התיקיה שיטה (מדריך) ולחץ על "הבא".
- "ניתוח בכתב," לבחור "פפטיד מפה (IMS)", "כלי מערכת" בכרטיסיה, בחר את המכשיר "מנהל הממס רבעוני". ערוך את ההגדרות מעבר צבע כדי להשיג פפטיד ההפרדה בספיקה של 200 µL לדקה שימוש מעבר צבע • תנאי בין 1 ל-40% ממס ב 30 דקות ולאחריה שטיפה עמודה 2-מין ולהציג equilibration 9-מין, עם ריצה הכולל של 50 דק אלה ניסיוני פרמטרים בעורך שיטת LC.
- "כלי מערכת" בכרטיסיה, בחר את המכשיר "מנהל". להגדיר את הטמפרטורה מדגם 10 ° C, הטמפרטורה העמודה עד 60 מעלות צלזיוס.
- מפעילים את QTOF ספקטרומטר מסה של יון חיובי במצב רגישות ESI, עם כוח פתרון אופייני של 30,000 FWHM.
הערה: LC/HDMSE הוא מצב שאינו תלוי-נתוני הרכישה (DIA) הפועלת על ידי איסוף במהירות סריקות עם מתחלפים התנגשות אנרגיות (בתא התנגשות) בין אנרגיה נמוכה (6 V עבור MS סריקות בערוץ 1), אנרגיה גבוהות (15 - 40 V הרמפה כדי לייצר ספקטרום פיצול ללא בחירה קודמן ב MS ערוץ 2).- הזן את הפרמטרים MS הקשורות מקור ברירת מחדל התוכנה רכישת נתונים: מ- "שלי בעבודה/כלי מערכת" בחר בכרטיסייה "Vion IMS Qtof", בתפריט "כלים", להזין פרמטרים אלה: 3.0 kV נימי מתח, טמפרטורת המקור 100 ° C, מקור V 100 היסט, 50 ליטר/שעה חרוט זרימת הגז, ומתח 40 V חרוט. הטמפרטורה desolvation מוגדר 250 מעלות צלזיוס קצב הזרימה של גז desolvation ל 500 ליטר/שעה, המתח נימי ייחוס 3.0 kV.
- בתוכנה רכישת נתונים, לחץ על "צור/ניתוח בשיטת" ובחר באפשרות "ליצור נכס ועיבוד שיטת". הקלד את שם פעולת השירות, דפדף אל התיקיה שיטה (מדריך) ולאחר מכן לחץ על "הבא".
- "ניתוח בכתב," לבחור "פפטיד מפה (IMS)", "כלי מערכת" בכרטיסיה, בחר את המכשיר "Vion IMS QTof". לחץ על "סיום"
הערה: השיטה LC/HDMSE החדשה שנוצרה נפתח באופן אוטומטי במסך ה-"כלי השיטה תצורה". - בכרטיסייה "הגדרות", להזין פרמטרים אלה: 3.0 kV נימי מתח 100 ° C מקור חום, 250 מעלות צלזיוס desolvation בטמפרטורה, זרימת הגז חרוט 50 ליטר/שעה, זרימת הגז desolvation 500 ליטר/שעה.
- "ניסוי" בכרטיסיה הגדרות, בחר "High Definition MSE"ובחר "ניתוח שיטת הריצה." בכרטיסיה "הגדרות סריקה", להזין פרמטרים אלה: נמוך מסה, 100; מסה גבוהה, 2000; זמן הסריקה, גב' 400 בכרטיסיה "לספירה", הקלד "6 V" עבור ההגדרה אנרגיה נמוכה ובחרו רמפה אנרגיה גבוהה בין 15 ל- 40 (פ') וודא כי יש "בטל נתונים הפחתת" בדק.
- להשרות פתרון של 50 ng/mL לאוצין enkephalin (LE) מוכן ב- 50% acetonitrile עם 0.1% פא בספיקה של µL 10/min לכיול lock-המונית במהלך איסוף הנתונים.
הערה: הנתונים lock-המונית נרכש כל 5 דקות שימוש באותו קצב רכישה על פני הטווח ההמוני אותו.
- לנתח את הדגימה 10 ננומטר, עלה-PHO באמצעות וזמינותו LC/HDMSE שתוארו לעיל על ידי שהזרקת µL 10 מדגם (כמות טעון בהטור הוא 100 fmol עבור כל פפטיד רגיל).
4. התקנה של השיטה תוף-MRM למיטוב התנגשות אנרגיה (CE)
- מ ערכת הנתונים LC/HDMSE , להשיג את זמן השמירה, מבשר את הרסיס יון מ/z עבור כל פפטיד PHO. לשמר את מ/z ואת המדינה תשלום עבור הנפוץ קודמן יון ושלושת המתאימים הנפוץ ביותר קטע יונים.
הערה: דוגמה של הספקטרום אנרגיה נמוכה, אנרגיה גבוהה בדרך כלל שהוקלט על ידי וזמינותו LC/HDMSE מוצגת באיור 2. - השתמש התנגשות אנרגיה (CE) אופטימיזציה בניסוי רלוקטנציה ממותג/MRM כדי לקבל את האות הטוב ביותר עבור כל פפטיד23.
- בתוכנה רכישת נתונים, לחץ על "צור/ניתוח בשיטת" ובחר באפשרות "ליצור נכס ועיבוד שיטת". הקלד את שם פעולת השירות, דפדף אל התיקיה שיטה (מדריך) ולחץ על "הבא".
- "סוג ניתוח", בחרו "Quantify." לבחור "Quantify Assay Tof 2D כרומטוגרפי" ולחץ "הבא." בכרטיסיה "כלי מערכת", בחר "Vion IMS QTof" ולחץ על "סיום"
הערה: השיטה תוף-MRM החדש שנוצר נפתח באופן אוטומטי במסך ה-"כלי השיטה תצורה". - בכרטיסייה "הגדרות", להזין פרמטרים אלה: 3.0 kV נימי מתח 100 ° C מקור חום, 250 מעלות צלזיוס desolvation בטמפרטורה, זרימת הגז חרוט 50 ליטר/שעה, זרימת הגז desolvation 500 ליטר/שעה.
- "ניסוי" בכרטיסיה הגדרות, בחר "פונקציית טבלה" ובחר "אחד או יותר MS, MSMS או MRM פונקציות." באמצעות החצים למטה, להגדיר פונקציה "תוף-MRM" עבור כל פפטיד על-ידי הזנת שלוש "מעברים" (שילובים של מבשר הנפוץ ביותר ועוד שלושה יונים פרגמנט הנפוץ ביותר שלה).
הערה: במצב תוף-MRM, הרגישות הגבוהה ביותר מושגת באמצעות גישה MRM מתוזמנת. - בעורך פונקציה "תוף-MRM", לבחור חלון זמן השמירה אחד עבור כל פפטיד (לפחות 1 דקות ארוכות), מסודרים לפי הסדר • תנאי פפטיד. בעורך פונקציה "תוף-MRM", הכנס פפטיד קודמן ז/ז ז ז את המוצר; בחר חלון מרובע בידוד "נמוך" (4-Da חלון) למבשר פפטיד; בחר זמן הסריקה קבועה של 100 ms; לבחור 12 ערכי אנרגיה התנגשות שונים בטווח של 14-36 V, כדלקמן: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, כפי שמוצג בדוגמה באיור 3.
הערה: עם תוף-MRM השיטה המתוארת לעיל, הנתונים לפחות 10 נקודות לכל שיא כרומטוגרפי נאספים כל מעבר על כל CE שצוין. כדי להקטין את גודל הקובץ של נתונים, בחר באפשרות "רחב" (6-Da חלון) עבור האות של יונים פרגמנט. דוגמאות הערכים הממוטבים CE מוצגות בטבלה מס ' 2. - לנתח את הדגימה 10 ננומטר, עלה-PHO באמצעות וזמינותו תוף-MRM שתוארו לעיל על ידי שהזרקת µL 10 מדגם (כמות טעון בהטור הוא 100 fmol עבור כל פפטיד רגיל).
5. ההתקנה של פעולת רכישה HS-MRM הסופי על כימות פפטיד באמצעות יון ניידות הפרדת פפטיד מבשרי
- בתפריט "Investigate" של התוכנה רכישת נתונים, להציג כל עקבות כרומטוגרפי 11 שנוצר עבור כל CE עבור כל פפטיד ולשלב את הפסגות באמצעות לחצן "לשלב" מסרגל הכלים "עיבוד אפשרויות/פעולות"; אזור הפסגה הגבוהה ביותר יציין את לסה נ הטוב ביותר עבור כל המעבר.
- מבחינה חזותית להשוות בין האזורים שיא הטוב ביותר עבור שברי כל פפטיד 3 ולשמר רק הטוב ביותר "מעבר" (קטע יונים שמייצר את האות האינטנסיבי ביותר); בטבלה 2 מציג את הטוב ביותר, "מעברים" המתקבל פפטידים PHO ארבע.
- תוכנית ההתקנה של שיטה HS-MRM המכילות יון קטע אחד בלבד לכל פפטיד. השתמש בערכים מיליגרם של כל פפטיד קודמן החל ערכת הנתונים LC/HDMSE .
- לשנות את שיטת תוף-MRM שנוצר בסעיף הקודם (סעיף 4) על-ידי בחירה בפונקציה "HS-MRM" במקום בפונקציה "תוף-MRM".
- העורך פונקציה "HS-MRM", הזן את הפרמטרים הבאים הקשורים קודמן: m/z, פאול רזולוציה: נמוך (4 Da), לחייב את המדינה, ערך CCS קודמן ורזולוציה CCS קודמן: נמוכה. עבור המוצר יונים, הזן שלו מ/z, התנגשות אופטימום האנרגיה, לבחור זמן סריקה של 0.4 s ובחר הגדרה ספקטרום "רחב" (6 Da) כדי לכלול את כל האיזוטופים שלו. דוגמה של שיטת הרכישה HS-MRM הסופי עבור כל פפטידים ארבע מוצג באיור 4.
- לנתח כל הדגימות באמצעות השיטה HS-MRM, החל לעכל את mAb ריק (דוגמה עלה), ואחריו 4 זריקות שכפל (10 µL כל) של ריכוז הבאים: 0.1, 1, 10 ו- 100 ננומטר PHO פפטידים.
6. יצירת שיטת עיבוד הניתוח של ערכת נתונים HS-MRM
- צור שיטת עיבוד הניתוח של ערכת נתונים HS-MRM.
- ניתוח בשיטת שנוצרו עבור שיטת רכישת נתונים "HS-MRM", לחץ על הכרטיסייה "מטרה" ובחרו ' "רכיבי ניהול."
- בתפריט הנפתח תחת 'סוג ניסוי', בחר באפשרות "HS MS/MS/HS-MRM".
- לחץ על "צור/ניו כניסה" ולהציג את הפרמטרים הבאים בעורך שיטת עיבוד: זמן השמירה פפטיד (RT), קודמן חיוב המדינה, קודמן מ/z ושעת להיסחף קודמן (DT). עבור יונים פרגמנט, הזן למצבו מ/z ודמי וציין המעקב "XIC" כמו מצב החילוץ.
- בכרטיסיה "מטרה" של שיטת הרכישה "HS-MRM" זהה, לחץ על "כמויות ברירת מחדל" והזן את ריכוזי הבאים: 0.1, 1, 10 ו- 100 ננומטר PHO פפטידים.
- הזן את הפרמטרים הבאים "הגדרות עיבוד/חילוץ": רגישות מסה ברירת המחדל, 10 עמודים לדקה (עבור m/z של כל שבר יונים), ברירת המחדל להיסחף הזמן, 5%; דוגמה של שיטת עיבוד פפטיד PHO מוצג באיור 5.
- הקלד כיול, בחר את התאמת עקומה ליניארית 1 / X2 שקלול.
- לעבד את הנתונים HS-MRM כדי לשלב את כל chromatograms והן לבנות. את עקומות כיול של כל פפטיד PHO.
Representative Results
רצפים נפרדים של שישה phosphorylase b פפטיד סטנדרטים הכלול התערובת פפטיד PHO יוצגו בטבלה 1, זמני השמירה שלהם ולהתנסות שלהם מבשרי הנפוץ ביותר שנצפתה על HDMSE . השלב הראשון בפיתוח של assay (HS) MRM סלקטיביות גבוהה הוא הרכישה של ערכת נתונים HDMSE להקים את הזמנים • תנאי של כל פפטיד PHO, יחד עם המתאימים ביותר קודמן שופע, שלושה שברי הנפוץ ביותר. איור 2 מציג את ספקטרום HDMSE רכשה עבור אחד פפטידים PHO (עידוד 6) עלה ב"דייגיסט רמיקייד. לאחר הקמת 3 הכי טוב "מעברים" (שילובים של ההמונים קודמן, פרגמנט) עבור כל פפטיד, ניסוי תוף-MRM מתבצע כדי למצוא את אנרגיית התנגשות אופטימלית על מנת למקסם את האותות עבור כל פפטיד. התוצאות של הניסוי אופטימיזציה CE מסוכמות בטבלה 2. הסופית assay HS-MRM (ראה איור 4) שומרת רק את הטוב ביותר "מעבר" עבור כל פפטיד והיא משמשת לניתוח כל דוגמאות מחודדים. דוגמאות chromatograms HS-MRM שנוצר עבור 4 PHO פפטידים על פני כל הריכוזים חקר מוצגים באיור 7. ארבעת העקומות כיול השיג עבור כל הבאים פפטיד השילוב של הפסגות HS-MRM מודגש איור 7 מוצגים באיור 8. בנוסף, שיא באזור יחסית סטיית התקן, זריקות מחושב בהתבסס על שכפל 4, מסוכם ב 4 הטבלאות המוצגות בטבלה 3.
| פפטיד | פפטיד | שמירה | תשלום הברית | ||||
| מזהה | רצף | הזמן (דקות) | + 1 | + 2 | + 3 | + 4 | |
| עידוד 1 | VLYPNDNFFEGK | 19.4 | 1442.6951 | 721.8512 | 481.5699 | 361.4292 | |
| עידוד 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16.0 | 1874.9065 | 937.9569 | 625.6404 | 469.4821 | |
| עידוד 3 | IGEEYISDLDQLRK | 18.9 | 1678.8646 | 839.9360 | 560.2931 | 420.4716 | |
| עידוד 4 | LLSYVDDEAFIR | 21.1 | 1440.7369 | 720.8721 | 480.9172 | 360.9397 | |
| עידוד 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19.7 | 1890.0080 | 945.5076 | 630.6742 | 473.2574 | |
| עידוד 6 | VFADYEEYVK | 17.7 | 1262.5939 | 631.8006 | 421.5362 | 316.4039 | |
טבלה 1. PHO פפטיד סטנדרטים הכלול המיקס מסה הכנה עלה ב"דייגיסט רמיקייד. פפטיד השמירה פעמים שלהם מבשרי הנפוץ ביותר (מסומן באותיות מודגשות) מוצגים בתבנית טבלאית.
| פפטיד | פפטיד | שמירה | פפטיד קודמן | יונים פרגמנט הנפוץ ביותר/טעינה... | אופטימום | ||||
| מזהה | רצף | הזמן (דקות) | מ/z & תשלום | הסחף זמן (אלפיות שניה) | . אני | II | III | לסה נ (V) | |
| עידוד 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16.0 | 625.6404 (+3) | 6.2 | 714.3781 (+1) | 807.4177 (+2) | 827.4621 (+1) | 24 | |
| עידוד 4 | LLSYVDDEAFIR | 21.1 | 720.8721 (+2) | 7.5 | 865.4050 (+1) | 964.4734 (+1) | 1214.5688 (+1) | 22 | |
| עידוד 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19.7 | 630.6742 (+3) | 6.3 | 642.3570 (+1) | 689.8391 (+2) | 832.4236 (+2) | 20 | |
| עידוד 6 | VFADYEEYVK | 17.7 | 631.8006 (+2) | 7.0 | 830.3931 (+1) | 945.4200 (+2) | 1016.4571 (+1) | 24 | |
בטבלה 2. תוצאות הניסוי אופטימיזציה תוף-MRM: שלושה שברי הנפוץ ביותר כל פפטיד PHO לכמת במחקר זה נקובים, יחד עם האנרגיה התנגשות ממוטבת המתאימים.
| ריכוז או משחק | כמות | פפ שיא 2 אזורים (טבלה 3 א) | |||||
| (אן אם) | (fmoles) על עמודות | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | זאת אומרת | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 490 | 439 | 462 | 431 | 456 | 5.8 |
| 1 | 10 | 5121 | 4842 | 5198 | 4842 | 5001 | 3.7 |
| 10 | 100 | 63853 | 64279 | 66111 | 62509 | 64188 | 2.3 |
| 100 | 1000 | 612392 | 605553 | 613229 | 611004 | 610545 | 0.6 |
| ריכוז או משחק | כמות | פפ שיא 4 אזורים (טבלה 3B) | |||||
| (אן אם) | (fmoles) על עמודות | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | זאת אומרת | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 275 | 359 | 325 | 288 | 312 | 12.2 |
| 1 | 10 | 3559 | 3694 | 3287 | 3754 | 3574 | 5.8 |
| 10 | 100 | 45259 | 45775 | 42976 | 45548 | 44890 | 2.9 |
| 100 | 1000 | 459374 | 467927 | 436272 | 458994 | 455642 | 3.0 |
| ריכוז או משחק | כמות | פפ שיא 5 אזורים (טבלה 3C) | |||||
| (אן אם) | (fmoles) על עמודות | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | זאת אומרת | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 3194 | 3243 | 3202 | 3257 | 3224 | 1.0 |
| 1 | 10 | 31464 | 31150 | 31464 | 31433 | 31378 | 0.5 |
| 10 | 100 | 313638 | 320712 | 311943 | 311943 | 314559 | 1.3 |
| 100 | 1000 | 2845736 | 2840031 | 2882006 | 2864052 | 2857956 | 0.7 |
| ריכוז או משחק | כמות | פפ שיא 6 אזורים (טבלה 3D) | |||||
| (אן אם) | (fmoles) על עמודות | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | זאת אומרת | RSD (%) |
| 0.1 | 1 | 490 | 583 | 440 | 440 | 488 | 13.8 |
| 1 | 10 | 6429 | 6429 | 6848 | 6623 | 6582 | 3.0 |
| 10 | 100 | 71295 | 70400 | 71563 | 70400 | 70915 | 0.9 |
| 100 | 1000 | 707640 | 707640 | 694461 | 729490 | 709808 | 2.0 |
בטבלה 3. הטבלה המכילה את מרב תחומי chromatograms HS-MRM הקליט עבור PHO 4 פפטידים (מרץ 2, 4, 5 ו- 6) עבור כל זריקה LC/MS (16 ריצות LC/MS ו- 4 בריכוזים שנבדקו).
סטיית התקן היחסי היה טוב יותר מאשר 15% עבור כל פפטידים על פני הטווח ריכוז כל חקירה.
איור 1. דיאגרמת זרימת עבודה המסכמת את שלושת הצעדים הנדרשים לקביעת שיטת הרכישה HS-MRM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. דוגמאות של נתונים HDMSE:
(א) אנרגיה נמוכה ספקטרום מציג את יון קודמן העידוד 6. (ב) בעל אנרגיה גבוהה פיצול הספקטרום של פפטיד זהה, הצגת top 3 הנפוץ ביותר פרגמנט היונים (מסומן בעיגול) שנבחר עבור תוף-MRM התנגשות אנרגיה אופטימיזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. פרמטרים המשמש להגדרת אופטימיזציה של תוף-MRM הניסוי.
מעבר לכל, נבדקו 11 אנרגיות התנגשות (בטווח של 16 עד 36 V). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. דוגמה של השיטה HS-MRM הסופי.
מספר פרמטרים נדרשים עבור כל "המעבר," כולל פפטיד קודמן ז/ז, את מצב הטעינה שלו, יון ניידות להיסחף זמן, מ/z של יונים פרגמנט הנפוץ ביותר, התנגשות אופטימום האנרגיה, ואת הזמן רכישה MS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. הגדרות בשימוש בשיטת עיבוד ניתוח את ערכת הנתונים HS-MRM.
כל פפטיד מנוטרת על ידי יחיד "מעבר" מתוארת על ידי פפטיד קודמן ז/ז, לחייב את המדינה, צפוי זמן השמירה, לאורך הדרך עם m/z של השבר הנפוץ ביותר ואת מצבו תשלום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. דיאגרמה של ספקטרומטר מסה ניידות יון.
במצב רכישה HS-MRM, סימנים מקדימים של פפטיד זה הוא להיות לכמת מופרדים מבשרי פפטיד (מפריעות) eluting שיתוף אחרים בתא ניידות יון, מבודדת על ידי פאול ולאחר מפוצל עם אנרגיה התנגשות קבוע תא התנגשות. האות המיוצר על ידי היונים פרגמנט פפטיד מועצמת על ידי התאמת התדר דוחס, כימות פפטיד מתבצעת באמצעות גבוהה-MS-הרזולוציה (> 30,000) אותות המיוצר על ידי יונים פרגמנט האינטנסיבי ביותר של כל פפטיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. Chromatograms HS-MRM הקליטה עבור 4 פפטידים PHO בריכוזים שונים 4 המתפרסות על-פני 3 סדרי גודל (0.1, 1, 10 ו- 100 ננומטר).
(א) chromatograms עידוד 2, 4 (ב) Pep chromatograms, chromatograms (ג) עידוד 5 ו 6 (ד) Pep chromatograms. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8. עקומות כיול עבור 4 פפטידים PHO על פני 4 ריכוזים שונים (0.1, 1, 10 ו- 100 ננומטר).
הטבלאות תחת כל עקומה להציג את האזורים שיא בודדים (ערכי-Y) נרשם עבור כל זריקה, בזמן העמודה השניה של כל טבלה מציגה את אחוז סטייה התגובה הליניארי הצפוי. (א) עידוד 2 כיול, 4 (ב) עידוד כיול, כיול (ג) עידוד 5 ו 6 (ד) עידוד כיול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
ברזולוציה גבוהה (ר' > 20,000) ספקטרומטר מסה משמש באופן שגרתי אפיון מבניים של חלבונים טיפולית על מגוון פלטפורמות כלי נגינה. לעומת זאת, כימות חלבון מבוססי MS מבוצעת בדרך כלל על ידי רלוקטנציה ממותג/MRM על ברזולוציה נמוכה (Rs ~ 1000) טנדם פאול המוני ספקטרומטרים באמצעות פפטידים החתימה שנוצר על ידי המחשוף אנזימטי של החלבונים11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. כפי הפרדות כרומטוגרפי יחיד-מימד לא לפתרון מלא תערובות פפטיד מורכב המיוצר על ידי עיכול אנזימטי, • שותף תנאי פפטיד הוא תופעה שכיחה, גם במקרה של תקציר יחיד-חלבון. על מעכל חלבון מורכב מאוד (למשל, עבור כימות של ppms 1-100 של HCPs בנוכחות רקע עשיר פפטיד המיוצר על ידי החלבון טיפולית), רגישות, הדיוק, או ליניאריות של רלוקטנציה ממותג/MRM assay יכול להיות מושפע . אני רציני.
מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM יש סלקטיביות unidimensional, להסתמך רק על שילוב "ייחודי" של ההמונים קודמן/פרגמנט. מסיבה זו, מבחני אלה נכשלים במצבים כאשר ברקע פפטיד משתנה באופן בלתי צפוי (למשל, עבור דגימות ביולוגיות המתקבל תהליכי טיהור שונים). כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנו מציעים כאן סלקטיביות גבוהה (HS) MRM assay מיושם על יון מאופשר ניידות פאול ברזולוציה גבוהה זמן-של-טיסה (QTOF) היברידית ספקטרומטר מסה (עבור כלי הדיאגרמה, ראה איור 6).
הכלי מפריד את סימנים מקדימים של פפטיד עניין בין מבשרי פפטיד (מפריעות) eluting שיתוף אחרים בתא ניידות יון, מבודד מעטפת מלאה איזוטרופי למבשר ב פאול, קטעים זה עם CE קבוע ב- תא התנגשות. האות המיוצר על ידי שבר פפטיד הנפוץ ביותר שלה היא משופרת נוספת על ידי התאמת התדר דוחס (שיפור היעד), אשר באופן סלקטיבי דוחף אזורים המוני עניין לתוך הצינור טיסה, יותר מאשר כל יונים, כמו עם סריקה מלאה. פפטיד כימות מתבצעת באמצעות את האותות גבוהה-MS-רזולוציה (Rs ~ 30,000) המיוצר על ידי יון קטע זה. בהשוואה של מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM, וזמינותו HS-MRM מציע שתי רמות נוספות של סלקטיביות: אחד מסופק על ידי ההפרדה ניידות קודמן ברמת יון, בעוד השני מוצע על ידי הרזולוציה המוני מוגברת במנתח TOF. התוצאות על-ידי השיפורים סלקטיביות גלויים ב- chromatograms HS-MRM המוצגת באיור 7, אשר הינם ללא הפרעות על-פני שלושה סדרי גודל.
בניגוד מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM, קיימים מספר פרמטרים שניתן לכוונן כדי למטב את מבחני HS-MRM: החלון RT סביב למבשר פפטיד (בדרך כלל מוגדר ב- 0.2 דקה), החלון בידוד פאול (4 Da), חלון הזמן הסחף המקיפים קודמן (± FWHM השיא קודמן מ mobilogram התואמת יון), את הרזולוציה MS של יונים פרגמנט (20,000-40,000). מבחני HS-MRM רגישים מאוד: הסכום שזוהו הנמוך ביותר עבור כל פפטידים PHO הוא 1 femtomole על עמודות (או 0.1 nM מבחינת ריכוז פפטיד). כאשר בוחנים MW פפטידי (ראה טבלה 1 MWs מדויק), הסכום זוהה על עמודות הוא גודל עמוד 1-2, בעוד העמודה היא עמוסה סכום גבוה משמעותית (2 µg) של פפטידים רקע מן התקציר mAb.
על ידי בוחנים את המשקל המולקולרי של חלבון PHO באורך מלא (97.2 kDa) שממנו נשאבו של פפטידים מחודדים, וזמינותו הוא מסוגל לזהות 50 ppm של טומאה חלבון בנוכחות גבוהה-שפע רקע יונים. מהגבולות התחתונים של זיהוי (5-10 ppm) השגה עבור משקל מולקולרי נמוך יותר HCPs (10-20 kDa). וזמינותו מכסה שלושה סדרי גודל (כפי שמוצג את עקומות כיול של איור 8), מה שאומר כי זה יכול למדוד HCPs בטווח 1-1, 000 דפים לדקה. כמו כן, הפארמצבטית של מבחני HS-MRM, מאויר בטבלה 3, תואמת היטב הפארמצבטית של מבחני רלוקטנציה ממותג/MRM מולקולה קטנה, עם שיא אזור RSDs יותר מ- 15%.
אנחנו בחנו את היכולות של assay הרומן על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדנים חד-שבטיים (mAb) תקציר והפגינו את הרגישות ואת השירות כדי לכסות את טווח דינמי רחב (לפחות שלושה סדרי גודל) בדרך כלל המערכת נתקלה בניתוח HCP. כל תקני פפטיד 6 זוהו בריכוזים המתחילים 0.1 nM (טעון על עמודה כרומטוגרפי של מזהה 2.1 מ מ 1 femtomole) בנוכחות פפטיד גבוהה-שפע רקע (2 µg של mAb תקציר טעון בעמודה). על ידי שילוב HRMS יישוב וגם יון ניידות קודמן ההפרדה, וזמינותו HS-MRM פוטנציאל גדול להפוך assay ניטור מהיר, תפוקה גבוהה עבור HCPs מרובות מעבר למספר אצוות של תכשירי ביו.
Disclosures
כל המחברים הם עובדי תאגיד המים, אשר הוא המפיק של מספר ריאגנטים, כלים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות לסלי Malouin, טוני Catlin מתאגיד המים עבור הכנת איור 6 של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
| Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
| Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
| Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
| 2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
| Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
| LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
| Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
| Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50) | Eppendorf | 22431102 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
| Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |
References
- Doneanu, C. E., et al. Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry. MAbs. 4, 24-44 (2012).
- Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).
- Zhang, Q., et al. Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6, 659-670 (2014).
- Farrell, A., et al. Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E). Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).
- Zhang, Q., et al. Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification. Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).
- Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise. Anal Biochem. , 1-6 (2014).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis. MAbs. 7, 1128-1137 (2015).
- Giles, K., et al. Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).
- Anderson, V., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).
- Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).
- Picotti, P., et al. High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods. 7, 43-46 (2010).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. (53), (2011).
- Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry. Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification. J Vis Exp. (102), (2015).
- Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate. Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).
- Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics. Cell. 138, 795-806 (2009).
- Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy. Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring. Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).
- Bao, Y., et al. Detection and correction of interference in SRM analysis. Methods. 61, 299-303 (2013).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Mbasu, R. J., et al. Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis. Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).
