여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.
측근근 형태 형성과 같은 식물 발달의 여러 측면은 며칠의 시간 간격으로 발생합니다. 기본 세포 및 subcellular 프로세스를 연구하기 위해서는 생리 조건을 보존하는 고해상도 시간 경과 현미경 전략이 필요합니다. 식물 조직은 충분한 양분과 물 공급을 유지하면서 가스 교환이 이루어져야하지만 커버 슬립 아래에 잠겨 고정되어 있으면 특히 무산소에 취약합니다. 성공적으로 사용 된 전략 중 하나는 산소와 영양분의 지속적인 공급을 유지하기 위해 재관류 시스템을 사용하는 것입니다. 그러나 이러한 장치는 복잡하고 성가 시며 특수 장비가 필요합니다. 침지 매질로서 퍼플 루오로 데칼린을 사용하는 단순 이미징 시스템에 대한 대안적인 전략이 제시된다. 이 시스템은 설치가 쉽고 장비가 최소한으로 필요하며 현미경 스테이지에 쉽게 장착 할 수있어 몇 개의 이미징 챔버를 설정하고 동등하게 촬영할 수 있습니다allel. 이 시스템에서 첫 번째 이틀 동안 한천 평판에서 표준 성장 조건과 비교하면 측부 뿌리의 성장률은 구별 할 수 없으며 적어도 하루 후에는 뿌리 뿌리의 성장이 계속 감소합니다. 식물 조직은 한천 슬래브를 통해 영양분과 함께 공급되어 약리학 화합물을 투여 할 수 있습니다. 이 시스템은 측부 뿌리 발달을 모니터하기 위해 설립되었지만, 배축 및 일차 뿌리와 같은 다른 식물 기관을 이미지화하기 쉽습니다.
식물 개발의 기초가되는 세포 및 세포 아래의 과정을 연구하기 위해, 고해상도의 장기간 경과 영상 전략에 대한 요구가 증가하고있다. 이러한 영상 실험에서 중요한 과제는 충분한 기체 교환과 물과 영양소 1 , 2 , 3 의 공급을 포함한 생리적 조건의 유지입니다. 최적의 광학 해상도를 위해 높은 개구 수를 가진 대상을 사용하려면, 시편을 coverslip에 근접하여 근접하게 배치해야합니다. x, y, z 방향으로의 움직임은 이상적으로 이미징하는 동안 최소화해야합니다.
묘목은 단기 이미징을 위해 종종 물 또는 수용액에 장착되지만, 물은 CO 2 와 O 2 (20 ℃, 0.1 MPa에서 각각 1.54 mg / mL 및 0.04 mg / mL)를 용해시키는 능력이 낮습니다 4 , 그것은장시간 저속 실험에는 적합하지 않습니다. 산소와 양분의 일정한 수준을 유지하는 관류 시스템은이 문제에 대한 하나의 해결책이며 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 1 , 2 , 3 및 광 시트 현미경 (LSM) 5 용으로 개발 되었습니다. RootChip 2 및 RootArray 3 와 같은 시스템은 뿌리 개발의 시간 경과 이미징을 위해 특별히 설계되었으며 사용자 정의 빌드 멀티 표본 장치에서 씨앗을 발아시킵니다. 이러한 배열은 최소한의 기계적 섭동을 보장하며 여러 묘목의 병행 분석을 위해 설계되었지만 세포 아래 구조의 이미징에 최적화되어 있지 않습니다. Calder와 동료들은 표본이 메쉬에 의해 제 위치에 고정되어있는 세포 아래 구조의 이미징에 최적화 된보다 복잡한 관류 기반 이미징 챔버를 설계했습니다고배율 침지 렌즈 1 의 사용을 허용합니다.
여기에 관류 시스템을 기반으로하지는 않지만 perfluorodecalin (PFD)이라는 퍼 플루오르 카본 (perfluorocarbon)을 사용하는이 문제에 대한 대안적이고 간단한 해결책이 제시되었다.이 퍼 플루오르 카본은 최근 Arabidopsis 영상 6 , 7 , 8 의 장착 매체로 인기를 얻고있다. 이러한 응용에서, CO 2 와 O 2 (물에서 0.04 mg / mL와 비교하여 PFD에서 O 2 에 대해 1.9 g / mL)를 용해시키는 PFD의 높은 용량은 침지 된 조직에 의한 기체 교환을 허용한다. 또한 PFD는 비 형광이며 굴절률 (1.313)은 물 (1.333)과 비슷하며 공기 (1.000)보다 세포질 (~ 1.4)에 가깝다. 퍼플 루오로 카본은 다양한 식물 및 식물에 대해 최소한의 생리적 효과를 나타냄PFD에 잠수 시켰을 때 쉽게 자라는 무우 씨앗과 물 공급시 적어도 2 일 동안 정상적인 성장과 발달을 보이는 문제 6 . 유사한 관찰이 Arabidopsis 종자를 발아 시키기 위해 만들어졌다. 리틀 존 (Littlejohn) 연구팀은 침윤 후 애기 장대 잎 조직에서 PFD의 분포를 직접적으로 이미지화하기 위해 유도 된 라만 산란을 기반으로 PFD가 살아있는 세포에 의해 흡수되지 않을 것이라고 결론 지었다. PFD는 이전에 공중 조직을 이미지화하는 데 주로 사용되어 낮은 표면 장력으로 인해 공기 공간에 쉽게 침투하여 이미징 깊이가 크게 증가합니다. 여기에서, PFD는 개발 측면 뿌리의 장기 공 촛점 이미징에 채택됩니다. 이 구성에서 한 개 이상의 묘목을 한천으로 응고시키고 PFD에 담근 성장 배지의 슬래브 위에 놓습니다. PFD는 g이미징 챔버에서의 비 교적 교환. 무산소 방지. PFD는 매우 휘발성이므로 폴리 (디메틸 실록산) 껌 가스켓 (높은 가스 투과성 (CO 2 의 경우 1.5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11)으로 유지 됩니다. 영양분과 물은 한천으로 고형화 된 배지의 슬래브에 의해 공급됩니다. 동시에,이 한천 슬랩은 coverslip에 대해 뿌리를 부드럽게 가압하여 이미지 챔버에서의 상대적 위치를 고정시키고 고해상도 수침 렌즈의 사용을 허용합니다. 또한 한천 슬라브는 dexamethasone, oryzalin 및 isoxaben을 비롯한 다양한 약리학 적 치료를 관리하는 데 사용할 수 있습니다. 이미징 챔버는 최소한의 장비를 사용하여 표준 현미경 슬라이드에서 대량으로 조립할 수 있습니다. 이미징 챔버는 측부 뿌리 발달을 연구하기 위해 개발되고 특징 지어졌지만 1 차 뿌리 끝과 같은 다른 모종 장기를 이미징하는 데 적용 가능하며배축.
여기에 제시된 방법은 2 ~ 3 일 동안 외측 근을 개발하는 고해상도 공 촛점 영상을위한 간단한 전략입니다. 최대 48 시간 동안, 측부 뿌리 발달에 대한 영상 시스템의 부작용이 관찰되지 않았다. 48 시간 후, 뿌리의 상당 부분 집합 (37 %)이 평판에서의 평균 뿌리 성장과 비슷한 속도로 계속 성장했지만, 평균 측근근 성장은 느려지기 시작했다. 따라서, 충분히 많은 수의 뿌리를 영상화함으로써, 48 시간 후에 성장이 느려지는 뿌리가 배제 될 수있다. 이미징 챔버의 체계적인 테스트는 72 시간보다 오래 수행되지는 않았지만 연장 된 이미징 기간이 필요한 경우 대체 전략을 권장합니다. 이미징 챔버는 적절한 환경 조건이 제공되거나 성장 시설로 옮겨지고 주기적으로 현미경으로 되돌려지면 현미경 스테이지에 지속적으로 방치 될 수 있습니다. 이것은 다수의 챔버가 평행하게 묘화되도록한다./ p>
여기에 설명 된 챔버의 장점 중 하나는 측부 뿌리가 그 위치에 고정되어 있으며 고해상도 수침 렌즈를 사용하여 이미지화 할 수 있다는 점입니다. 공간 안정성은지지 용 한천 슬랩에 사용 된 한천 농도에 따라 결정됩니다. 처음에는 0.8 % 한천에서 2 % 한천까지 다양한 농도 범위에서 시험했는데이 범위의 고농도는 공간에서 안정적으로 고정되었지만 뿌리 성장은 더디게 느려지 며 일부 뿌리는 감소 된 세포 신장을 포함하여 기계적 스트레스의 징후를 나타냈다. 대조적으로, 한천 농도가 낮 으면 이미징하는 동안 x, y 및 z로 표류하는 뿌리가 필요하지 않습니다. 최적의 1.5 % 한천 슬랩은 부작용없이 시험편의 위치를 고정합니다. 이러한 조건에서 처음 30 분 정도 정착 한 후 몇 시간 동안 뿌리가 안정되어 밤새 데이터 수집이 가능합니다. 4D 데이터를 수집하는 동안 z 스택 범위는 일반적으로 b5 ~ 10 μm의 추가 두께가 있었지만, 이것은 주로 Z- 드리프트 또는 흔들림보다는 측면 뿌리의 면외 성장을 수용하기위한 것이 었습니다. 표준 한천 농도가 침투에 대해 약간의 저항을 제공하지만, 중력에 의해 뿌리가 한천에 침투하게됩니다. 그러나 이미징 챔버의 사소한 수정을 통해 뿌리 성장은 coverslip과 평행하게 유지 될 수 있으므로 오래된 측근과 주 뿌리를 이미지화 할 수 있습니다. 또한 기본 이미징 챔버는 배축에 맞게 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 나팔꽃은이 시스템에서 더 자유롭게 떠 다니므로 이미지 수집을위한 z 축 브래킷이 일반적으로 약 20 μm로 증가합니다. 이 연구에서 직립 현미경을 사용하여 기판 특성을 제어 할 수있었습니다. 이미징 챔버는 거꾸로 현미경 구성에 적응할 수 있지만 요격 인터럽트 기관에 대한 coverslip의 시간 의존 영향을 평가해야합니다. </p>
리틀 존 (Littlejohn) 연구팀은 PFD 자체가 생물학적 분자를 쉽게 용해시키지 못하므로 약리학 적 화합물 전달에 직접적으로 사용될 수 없다는 것을 지적했다. 이 문제는 한천 슬래브가 놓여있는 응고 된 성장 배지의 슬래브를 통해 그러한 화합물을 공급함으로써 극복되었다. 관류 시스템이 세척 실험을위한 선택 방법으로 남아 있지만, 이미징 챔버는 dexamethasone 12 및 기타 화합물의 투여에 성공적으로 사용되었습니다. 한 노트,이 기사는 준비 중이었습니다. Wagenheim과 동료들은 가벼운 시트 현미경을 사용하여 측부 뿌리 발달을 영상화하기위한 챔버를 설명했습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 브리티시 컬럼비아 대학의 Geoffrey Wasteneys 교수에게 RFP-TUB6을 씨앗으로 표현하고 익명의 평론가에게 도움이되는 수정에 대해 감사드립니다. 휴 디킨슨 (Hugh Dickinson) 교수는 셀룰로오스 필름을 기계적 지지물로 사용하고 존 베이커 (John Baker)가 사진 촬영에 사용함을 알려 주신 데 대해 감사드립니다. 이 연구는 BBSRC의 연구 보조금 인 BB / G013993 / 1 및 BB / D004055 / 1의 IM 및 BBSRC 박사 교육 상 및 Clarendon Scholarship of CK
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |