Summary
Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.
Abstract
Yanal kök morfogenezisi gibi bitki gelişiminin birkaç yönü, birkaç günün zaman aralıklarında meydana gelir. Altta yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, fizyolojik koşulları koruyan yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı mikroskopi stratejileri gereklidir. Bitki dokularında, sürekli gaz değişimi ile yeterli besin ve su temini olmalıdır; ancak lamel altına batırılmış ve hareketsiz hale getirildiğinde, anoksiye karşı özellikle hassastırlar. Başarılı bir şekilde uygulanan bir strateji, oksijen ve besin maddelerinin sürekli bir şekilde tedarik edilmesi için bir perfüzyon sisteminin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, bu gibi düzenlemeler karmaşık, hantal olabilir ve özel ekipman gerektirir. Burada, daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılan basit bir görüntüleme sistemi için alternatif bir strateji sunulmuştur. Bu sistemin kurulumu kolaydır, minimum ekipman gerektirir ve birkaç görüntüleme haznesinin kurulmasına ve eşit olarak görüntülenmesine imkân tanıyan bir mikroskop sahnesine kolayca monte edilir.allel. Bu sistemde, yanal kök büyüme oranları ilk iki gün boyunca agar plakalarında standart koşullardaki büyüme hızlarından ayırt edilemez ve yanal kök büyümesi en az bir gün daha düşük oranlarda devam eder. Bitki dokuları, aynı zamanda bir dizi farmakolojik bileşimi uygulamak için kullanılabilen bir agar plakası yoluyla besinlerle birlikte verilir. Sistem yanal kök gelişimini izlemek için kurulmuştur ancak hipokotiller ve birincil kökler gibi diğer bitki organlarına kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Bitki gelişiminin altında yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, yüksek çözünürlüklü uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme stratejileri için artan bir talep vardır. Bu tür görüntüleme deneylerinde kilit bir zorluk, yeterli gaz alışverişi artı bir su ve besin maddesi arzı 1 , 2 , 3 artı içeren fizyolojik koşulların bakımıdır. Optimum optik çözünürlük için yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip objektifleri kullanmak için, numuneler lamine camlara paralel olarak yerleştirilmelidir. Görüntüleme sırasında x, y ve z yönlerinde hareket ideal bir şekilde minimum olmalıdır.
Fide genellikle kısa süreli görüntüleme için suya veya sulu çözeltiye monte edilirken, su, CO 2 ve O 2'yi çözmek için düşük kapasiteye sahiptir (sırasıyla 20 ° C, 0.1 MPa'da 1.54 mg / mL ve 0.04 mg / mL) Hangi yaparUzun zaman atlamalı deneyler için uygun değildir. Sürekli oksijen ve besleyici seviyelerini koruyan perfüzyon sistemleri bu sorunun bir çözümündedir ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 1 , 2 , 3 ve ışık levha mikroskopisi (LSM) için geliştirilmiştir. RootChip 2 ve RootArray 3 gibi sistemler, gelişmekte olan köklerin zaman aşımı görüntülemesi için özel olarak tasarlanmış ve özel olarak inşa edilmiş çok örnekli bir aygıta çimlenen tohumları dahil etmiştir. Bu düzenlemeler minimal mekanik bozulmayı sağlar ve birden fazla fidenin paralel analizi için tasarlanmıştır, ancak subselüler yapıların görüntülenmesi için optimize edilmemiştir. Calder ve meslektaşları, alt hücreli yapıların görüntülenmesi için optimize edilmiş daha karmaşık bir perfüzyon tabanlı görüntüleme haznesi tasarladılar; buradaki örnek, bir ağ tarafından konumunda tutulduYüksek büyütmeli daldırma merceklerinin kullanılmasına izin vermek için 1 .
Burada, perfüzyon sistemlerine dayalı olmayan, ancak yakın zamanda Arabidopsis görüntüleme 6 , 7 , 8 için bir montaj aracı olarak popülerlik kazanan bir perflorokarbon olan perflorodekalin (PFD) kullanan, bu probleme alternatif, basit bir çözüm sunulmuştur . Bu tür uygulamalarda, CO 2 ve O 2'yi çözmek için PFD'nin yüksek kapasitesi (PFD'de O 2 için 1.9 g / mL, sudaki 0.04 mg / mL'ye kıyasla) 9 dalmış doku ile gaz değişimine izin verir. Ayrıca, PFD floresan değildir ve refraktif indeksi (1.313) suyun (1.333) ile karşılaştırılabilir ve hava (1.000) 6'ya göre sitosolünkine (~ 1.4) daha yakındır. Perflorokarbonların, çeşitli bitkiler ve bitki türleri üzerinde minimum fizyolojik etkisi olduğu bildirilmiştir.Çay tohumları, PFD'ye batırıldığında kolayca çimlenir ve su ile beslendiğinde en az iki tam gün normal büyüme ve gelişme gösterir. Benzer gözlemler, Arabidopsis tohumlarını çimlemek için yapılmıştır 6 . Littlejohn ve meslektaşları, sedimantasyondan sonra Arabidopsis yaprak dokularında PFD dağılımını doğrudan görüntüleyecek uyarılmış Raman saçılımına dayanarak, PFD'nin canlı hücreler tarafından alınmayacağına karar verir. PFD daha önce, düşük yüzey gerilimi nedeniyle hava boşluklarına kolayca nüfuz ederek görüntü derinliğini önemli derecede arttıran görüntü anten dokuları için ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Burada, PFD, lateral köklerin gelişiminin uzun vadeli konfokal görüntülemesi için benimsenmiştir. Bu konfigürasyonda, bir veya daha fazla fide agar ile katılaşmış ve PFD'ye batırılmış bir büyüme ortamı plakası üzerine yerleştirilir. PFD, gGörüntüleme odasında aseöz değişim, anoksi önleme. PFD, yüksek gaz geçirgenliği olan poli (dimetilsiloksan) zamk contası (CO 2 için 1.5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11 ile tutulduğu için oldukça uçucudur. Besinler ve su, agar ile katılaşmış ortam plakasıyla sağlanır. Aynı zamanda, bu agar plakası nazikçe lamel karşı kök presler, böylece görüntüleme odasında göreli konumu sabitleme ve yüksek çözünürlüklü su daldırma lenslerin kullanımına izin veriyor. Ayrıca, agar kütüğü dexamethasone, oryzalin ve isoksaben dahil bir dizi farmakolojik tedavinin uygulanmasında kullanılabilir. Görüntüleme odaları, asgari ekipman kullanılarak standart mikroskopik slaytlardan çok sayıda monte edilebilir. Görüntüleme odaları, yanal kök gelişimini incelemek üzere geliştirildi ve karakterize edildi, ancak birincil kök ipuçları gibi diğer fide organlarını görüntülemeye vehipokotilleri.
Protocol
1. Oda Oluşturma
- Bir cam kesici kullanarak, 1 mm kalınlığında bir mikroskop lamasının ucundan 3 mm genişliğinde şeritleri kesin. Bir siyanoakrilat süper yapıştırıcı veya çift taraflı bant kullanarak, bu cam şeritleri yaklaşık 45 mm uzaklıkta ikinci bir mikroskop lamı boyunca geniş tutkal edin ( Şekil 1A ). Oda başına bir slayt gereklidir, ayrıca agar plakaları dökmek için ilave slaytlar gerekir (bir slaytta 2-3 agar plak oluşur). Slaytlar tekrar kullanılabilir.
- Cam şeritler arasında, gaza nüfuz eden poli (dimetilsiloksan) zamktan aynı yükseklikte bir conta oluşturun. Slayt üzerine poli (dimetilsiloksan) sakız topu koyun ( Şekil 1B ), ikinci bir slaydı az miktarda% 100 mutlak etanol ile ıslatın ve ikinci slaytla poli (dimetilsiloksan) sakız topunu yüksekliğe ulaşıncaya kadar düzleştirin ( Şekil 1C ).
- Gerekirse fazla poly (dimeTilsiloksan) sakızın tıraş bıçağı ile yıkanması ve düzleşmenin tekrarlanması.
- Mutlak etanolde ıslatılmış uygun bir kesici veya jilet kullanarak, daha sonra fide ve agar levhayı tutacak boşluğu oluşturmak için poli (dimetilsiloksan) sakızının iç kısmını çıkarın ( Şekil 1D ).
- Yaklaşık 2 mm'lik bir son duvar kalınlığına sahip bir conta oluşturmak için jiletin dikkatli bir şekilde traş bıçağı ile düzeltilmesi ( Şekil 1E ). Gazların bir poli (dimetilsilaksan) bariyeri içerisinden geçirgenliği, 50 μm'nin üzerindeki kalınlıklardan bağımsızdır 11 .
2. Agarla Katılaşmış Büyüme Orta Levrağını Oluşturma
- İki cam şeritli mikroskopik bir slaytta, iki cam şerit üzerine oturacak şekilde lamel yerleştirin (22 mm x 50 mm).
- Elde edilen boşluğa% 1 w / v sukroz ve% 1.5 w / v agar (½ MS) içeren pipet eritilmiş yarı kuvvetli Murashige ve Skoog büyüme ortamıSonuncusu tamamen dolana kadar (yaklaşık 1 mL toplam hacim) lamelin altına yerleştirin ve agara ayarlanıncaya kadar bırakın (yaklaşık 5 dak.).
Not: Farmakolojik bileşikler, döşeme dökülmeden önce sıvı ortama uygun konsantrasyonların eklenmesiyle agar plakasından uygulanabilir. Bu, deksametazon 12 , izoksaben, 2,6-diklorobenzonitril (DCB), oryzalin ve latrunculin B için başarıyla test edildi.
3 . Oda Kurulumunun Tamamlanması
- Hava, küçük bir hacimdeki PFD'yi bir tüpte sallayarak PFD'yi dengeye çıkarır 7 . Jel contanın kuyusuna hava ile dengelenmiş küçük miktar (yaklaşık 200 mcL) hava-dengelenmiş PFD ekleyin, ancak bölmeyi tamamen doldurmayın. Bu PFD, odaya yerleştirildiğinde agar plakasının altındaki hava kabarcıklarının tıkanmasını önlemeye yardımcı olacaktır.
- Agar levhasındaki lamelleri çıkarın (yukarıdaki adım 2.2'de) ve bir kısmını kesmek için tıraş bıçağı kullanınBoyutu ve şekli. Daha sonra jel contanın kuyusuna yerleştirin ( Şekil 1F ). Contanın her yerine 2-4 mm boşluk bırakılmalıdır.
- Odayı hava ile dengelenmiş PFD ile tamamen doldurun.
- PFD'de ( Şekil 1G ) yüzen, kotiledonlar ve hipokotil kenar üzerinde asılı olan agar döşeme üzerine bir veya daha fazla A. thaliana fidanı (2-3 gün boyunca görüntüleme için 3 fide kadar) yerleştirin.
- Fideler elde etmek için tohumları% 70 etanol, 1% sükroz ve% 0.8 agar ile takviye edilmiş ½ MS ortamında tohum sterilize edin, 4 ° C'de 2-4 gün süreyle tabakalandırın ve 16 ° C'de 22 ° C'de dikey yönlendirilmiş plakalarda büyütün H hafif / 8 saat karanlık rejim. Yanal kökleri görüntüleme için, görüntüleme odalarına aktarılmadan önce 7-10 gün boyunca bitkiler yetiştirin.
- Odası kapatmak için, objektif optik uygun bir lamel uygulayın, hafifçe lamel kadar bir cam mikroskop lamı kenarıyla aşağı bastırıyorHer iki cam şerit üzerine oturmaktadır ( Şekil İH ).
- İstenirse, lamelin her iki ucunda yarım uzunlukta kesilmiş 1.25 cm genişliğinde mikrogözenek cerrahi bant şeritleri ile sabitleyin ( Şekil 1I ). Görüntülemeden önce numunenin yaklaşık 30 dakika yerleşmesine izin verin. Bu görüntüleme sırasında numune hareketini en aza indirir.
- Büyüme için kontrollü bir altlığı korumak için dik bir mikroskop ile görüntüleme gerçekleştirin. 20X / 0.7NA veya 63X / 1.2NA CS2 hedeflerini kullanın.
Representative Results
Yanal kökler görüntüleme odalarında fizyolojik oranlarda büyür.
Görüntüleme odalarındaki bitkilerin yanal kök uzunlukları, saatlik aralıklarla ( Şekil 2A , sol, Film 1, n = 23) ölçülmüş ve büyüme oranları, aynı agar-katılaştırılmış ortamı içeren standart Petri plakalarında yetiştirilen lateral köklerinkiyle karşılaştırılmıştır ( Şekil 2 2A , sağ, Film 2, n = 23). Büyüme oranları, artan oranda büyüme ve çoğalma bölgelerinden dolayı kökün bir belirleyici faktör olduğu uzunlamasına yan kökler arasında büyük farklılıklar gösterebilir. Bu nedenle, lateral kök setleri hem görüntüleme odasında hem de agar plakasında farklı başlangıç uzunluklarının (50 um ila 1150 um aralığında) köklerini temsil edecek şekilde seçilmiştir. Deneyin başlangıcında ortalama yan kök uzunluğuHer sette (sırasıyla görüntüleme bölmeleri ve plakaları için 439 ve 442 μm) benzerdi. Analiz edilen 27 saatlik zaman aralığında yanal kök büyümesi hem görüntüleme odaları hem de plakalar üzerinde yaklaşık olarak lineerdi, plakalarda ortalama 52 um / saat (R2 = 0.997) ve görüntüleme odalarında 51 um / saat'lik bir büyüme oranı vardı R2 = 0.993) ( Şekil 2B ). Hem levhalar üzerinde hem de görüntüleme bölmelerinde ( Şekil 2C ) oldukça değişken olan bireysel yanal köklerin büyüme oranları, görüntüleme odacıklarında 17 μm / saat ila 82 μm / saat arasında ve plakalarda 13 μm / saat ila 87 μm / sa arasındadır. Büyüme oranları genelde kök uzunluğu ile birlikte artarken, büyüme oranları halen benzer uzunlukta olan kökler arasında değişmekle birlikte, görüntüleme odaları ve plakalarda varyans benzerdir.
Yanal kökler görüntüleme odalarında çoğalır ve hiGh sayısal diyafram hedefleri.
Plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP 14 ve mikroplak işaretleyici UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15'u birlikte ifade eden yanal kökler, görüntüleme bölmelerinde hücre proliferasyonu sırasında mikrotübül davranışını belgelemek için CLSM 10 ile 1 saat aralıklarla görüntülendi ( Şekil 2D , Film 3). Bu odacıklarda, yanal kökler, x, y ve z eksenlerindeki konumlarında son derece kararlıydı ve birkaç saat boyunca sürekli zaman atlamalı konfokal yığınların edinilmesine izin verdi. Önceden ortaya çıkan bantların ( Şekil 2D , yeşil oklar), mitotik iğlerin ( Şekil 2D , beyaz oklar) ve fragmoplastların ( Şekil 2D , mavi oklar) oluşumundan anlaşılacağı üzere, meristematik hücreler sürekli çoğalırlar. Petri tabaklarındaki fidanlarda olduğu gibi,Görüntüleme odacıklarında tamamen uzamış kök hücreler kök tüyleri başlattı ( Şekil 2A , Şekil 2D , ok başları), bu gelişmenin görüntüleme odalarında beklendiği gibi ilerlediğini gösteriyordu. Geniş bir görüş alanı sağlamak için Şekil 2D'deki görüntüler 20x / 0.7 NA hedefiyle elde edilmiştir. Yüksek rakamsal açıklık 63x / 1.2 NA suya daldırma objektif kullanarak yüksek oranda yanal kök görüntüleri elde etmek de mümkün olmuştur ( Şekil 2E ).
Yanal kök büyümesi görüntüleme odalarında üç güne kadar sürdürülür.
Görüntüleme odalarının fizyolojik oranlarda yanal kök gelişimini ne kadar süreyle destekleyebileceğini araştırmak için görüntüleme odalarında (n = 27) ve plakalardaki (n = 33) yanal kök uzunluğu 0 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saatte ölçülmüştür. Kökler choSen 0 saatte 200 μm'den daha kısa, ortalama yan kök uzunluğu 117 μm olan görüntüleme bölmelerinde ve 121 μm kalınlığında plakalardı. Daha kısa kökler ortalama olarak daha yavaş büyümesine karşın ( Şekil 2C ), agar levhanın kenarından daha az büyüdüler ve daha kolay görüntü çekiyordu. İlk 48 saatte tüm yanal köklerin ortalama büyümesi Petri plakalarına kıyasla görüntüleme odalarında anlamlı farklılık göstermedi ( Şekil 3A ). Bununla birlikte, ortalama büyüme 48 saat ile 72 saat arasında önemli ölçüde azaldı ( Şekil 3A ). Büyüme oranları genel olarak 48 saat sonra görüntüleme odalarını yavaşlatır gibi görünse de, bireyler arasındaki büyüme oranları oldukça değişkendir ( Şekil 3B , 3C ) ve bu da plakalarda ve odalarda kıyaslanabilir oranlarda büyüyen yanal köklerin önemli bir alt kümesi olduğu anlamına gelmektedir 72 saatlik büyüme dönemi boyunca. Yetiştirilen 33 yan kökün 23'ü(% 69.7) 72 saatte ortalama uzunluğun bir standart sapması (927 ila 3.116 μm, Şekil 3B , kırmızı) arasında bir uzunluğa ulaşmaktadır. Görüntüleme odacıklarının 10'unda (% 37.0) yanal kökler bu aralıkta bir uzunluğa ulaşmaktadır ( Şekil 3B , kırmızı).
Görüntüleme odaları daha yaşlı yanal kökler, birincil kökler ve hipokotiller için kolayca adapte edilebilir .
Orijinal görüntüleme odacığının tasarımının sınırlamalardan biri, sert agar plakası bazı mekanik direnç sağlamasına rağmen gravitropik olarak büyüyen kökler sonunda agar plakasına nüfuz ederek görüntü kalitesinde kayba ( Şekil 4B ) ve yüksek NA'nın çalışma mesafesinin ötesinde büyümesine neden oldu Lensler, nispeten uzun çalışma mesafesi (0.3 mm) 63X / 1.3 NA CS2 hedefi. Genç lateral kökler, statolit içerenGravitropizm için gerekli olan kolumnella hücreleri 17 olduğundan başlangıçta görüntüleme odacıklarındaki lamellerle paraleldirler ( Şekil 2E ). Daha uzun süre büyüdükçe ve kolumnella ve statolitler oluştuğunda, yan kökler artan pozitif yerçekimi etkileri gösterirken, birincil kökler çimlenmeden sonra güçlü bir yerçekimi tepkisi göstermektedir. Bu, birincil köklerin görüntüleneceği birkaç saati sınırlar ve 48 saat veya daha fazla süreyle sürekli olarak görüntülenecek olan yanal köklerin başlangıç uzunluğunu ciddi ölçüde sınırlar. Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için, bölme, büyüme, agar levhanın yüzeyinde bir penetrasyon bariyeri olarak işlev gören bir selülozik selofan zar tarafından lamel paralel tutulacak şekilde değiştirildi ( Şekil 4A ). % 1.5 agar kütüğünü kullanan ilk denemeler, belki de mekanik strese bağlı olarak, ilk 24 saat içinde azalmış kök gelişimine neden oldu. Döşeme altındaki agar konsantrasyonları,D% 0.8 agar ve selüloz film içeren bir levhalı odacıklarda, genç yanal kök büyüme oranları, ilk 48 saat boyunca geleneksel odacıklardaki büyüme hızlarından belirgin olarak farklı olmadığı bulunmuştur. 0-24 saat boyunca, selüloz odaları ve konvansiyonel odacıklardaki ortalama kök büyümesi sırasıyla 242 μm ve 262 μm idi (p = 0.78 Student's t-Testi) ve 24-48 saat boyunca sırasıyla 330 μm ve 355 μm 1 idi (p = 0.67 Student's t-testi); Sırasıyla n = 12 ve n = 11'dir. Bu düzenleme, yanal köklerin lamelden agar içine uzamasını ve ayrıca 48 saat boyunca primer köklerin görüntülenmesine izin vermesini etkili bir şekilde önledi ( Şekil 4C ).
Görüntüleme odalarının kök dışında organlar için uyarlanıp ayarlanamayacağını test etmek için Arabidopsis hipokotilleri seçildi. Hipokotiller, köklerden esas olarak daha kalıntır, bu nedenle, geleneksel görüntüleme odasında en üstteki cEller lameste karşı sıkıştı ve deformasyona neden oldu. Bu nedenle merkezlerinde oval bir depresyon içeren boşluklu slaytlar kullanılarak alternatif bir tasarım geliştirildi ( Şekil 4D ). Bu konfigürasyonda, 1 mm kalınlığında bir agar plakası (yukarıdaki 2.2'de olduğu gibi hazırlanmıştır) bir ucu slayt boşluğuna birkaç mm çıkıntı yapacak şekilde konumlandırılmıştır ( Şekil 4D ). Kök, yatay bölümün üstünde konumlandırılırken, hipokotiller slayttaki oyuğun üzerine yerleştirildi. Bu, fidenin uzayda kök tarafından sabitlenmesini sağlamıştır, ancak hipokotil sıkıştırılmamıştır. Odalardaki büyüme oranları plakalara kıyasla sistematik olarak ölçülmemiş iken, görüntüleme odalardaki hipokotiller, hipokotil ( Şekil 4E , 4F ) 16'ya göçen iyi tanımlanmış uzunlamasına büyüme dalgası sergilemiştir.
Şekil 1 : Görüntüleme haznesi montajı. Tüm ayrıntılar metinde açıklanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Yanal kökler görüntüleme odalarında fizyolojik koşullar altında büyür. ( A ) Görüntüleme odasında (solda) ve plakada (sağda) Arabidopsis lateral kök gelişimi (sabit ışık, yatay inkübasyon, eşzamanlı görüntüleme) 25 saat boyunca. Ölçek çubukları = 200 μm. ( B ) ( A ) 'da gösterildiği gibi lateral kök uzunluklarını 27 saat boyunca (1 saat aralıklarla ölçülmüştür) gösteren yanal kökler. ! TekErgin kökler gri renkte (plakalar ve görüntüleme odaları için n = 23), ortalama uzunluk kırmızı dairesel olarak çizilmiştir. Hata çubukları = 1 SD. Kırmızı çizgi, ortalama uzunluklar boyunca doğrusal olarak uymaktadır. ( C ) ( B ) 'de gösterilen tüm yanal köklerin başlangıç uzunluğuna göre ortalama büyüme oranını gösteren çizim. ( D ) Ardışık zaman noktalarında NPSN12-YFP ve RFP-TUB6'yı ifade eden yanal köklerden elde edilen 3D konfokal yığınların maksimum yoğunluk projeksiyonları. Başlangıç: Kutulu bölgenin büyütülmesi. Yeşil oklar: ön-faz bantları; Beyaz oklar: mitotik iğler; Mavi oklar: phragmoplastlar; Ok uçları: kök tüyleri. ( E ) ( D ) 'de gösterilen transjenik çizginin genç bir yanal kökünden, yüksek çözünürlüklü görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyonları, 63X / 1.2 NA hedefi ve 0 saat ve 16'da Nyquist örneklemesi (77 nm x 77 nm piksel boyutu) kullanılarak elde edildi. h; Yıldız işaretleri her zaman noktasında aynı hücreleri bulur; Ok, 0 saat ila 16 saat arasında bölünen bir hücreyi gösterir.Ölçek çubukları = 50 μm (AC); 20 um (E). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Görüntüleme odalarında uzunlamasına yanal kök gelişimi. ( A ) Plaklara kıyasla, görüntüleme odalarındaki ardışık 24 saatlik aralıklarla ortalama mutlak kök büyümesini gösteren çizelge. Ns, p> 0.05'i; ***, p <0.001 (öğrenci t testi) olduğunu gösterir. N = 33 (plakalar) ve n = 27 (görüntüleme odaları). ( B ) (A) 'da kullanılan tüm köklerde ardışık zaman noktalarında yanal kök uzunluklarını gösteren çizim. Kırmızı: Tabakta yetiştirilen tüm yanal köklerin ortalamasının 1 SD'sinde (927 ve 3163 μm arasında) son uzunluğu olan tüm yanal kökler. ( C ) Maksimum72 saatin üzerindeki ardışık zaman noktalarında elde edilen, yanal köklerde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP'yi temsilen 3D konfokal yığınlarının parlaklık projeksiyonları. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Görüntüleme bölmeleri, diğer bitki organları için uyarlanabilir. ( A - C ) Birincil kökler için görüntüleme odacığı uyarlaması. ( A ) Görüntüleme odası tasarımı şeması. Bu, iki değişikliğin yanı sıra standart tasarımla aynıdır ( Şekil 1 ): MS orta tabaka,% 1.5 agar yerine% 0.8 agar ve agar ile bitki arasında bir selüloz film (kırmızı) içerilmesini önlemek için yerleştirirAğ içine. ( B ) 7 günlük fidenin birincil kökünde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP'nin temsili 3D konfokal yığınlarının ( B ) XY (üst) ve XZ (alt) maksimum yoğunluk projeksiyonları, konvansiyonel bir görüntülemede 0 saat ve 48 saatte görüntülendi bölme. Kök, gravitropik tepki nedeniyle agara büyür. 0 saat ve 48 saatte görüntüleme yapılan yedi günlük fidenin birincil kökünde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP'nin temsilci 3D konfokal yığınlarının ( C ) XY (üst) ve XZ (alt) maksimum yoğunluk projeksiyonları Selüloz filmli oda. Uygulamadan önce, selüloz filmi% 80 etanol içinde sterilize edildi ve sıvı ½ MS ortamında ıslatıldı. Kökün ağara gravitropik büyümesinin önlendiğini unutmayın. ( D - F ) Hipokotiller için görüntüleme odası uyarlaması. ( D ) Hipokotil görüntüleme odası tasarımını gösteren şematik. Bir poli (dimetilsiloksan) sakız contası (gri) üreticidirİki cam şerit arasındaki boşluk slaytında kırmızı (sarı). Eşit kalınlığa (bej) sahip% 1.5 agarlık bir kütük, kısmen boşluğa ulaşan slayt üzerine yerleştirilir. Oda PFD (mavi) ile doludur. Fideler ağar kütüğün üzerine yerleştirilir, böylece hipokotil agar kütüğünün ağzın aşağı doğru eğimli bölgesini kaplar ve kök agarın yatay bölümüne yerleştirilir. Oda lamel ile kapatılmıştır. ( E ) İki gün süren bir fidenin bir hipokotilinde plazma-membran işaretleyici NPSN12-YFP'yi temsilen 3D konfokal yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonları, ardışık zaman noktalarında 48 saat boyunca imgelemiştir. ( F ) ( E ) 'de gösterilen hipokotilin bazal-apikal ekseni boyunca (E'de gösterilen eksende 0 saatlik göreceli pozisyonlar) bireysel hücrelerin iki ardışık zaman aralığında boyuna büyüme. Daha önce açıklanan hipokotil 16'ya göç eden büyüme dalgasına dikkat edin. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Film 1: Bu filmi indirmek için lütfen tıklayın.
Film 2: Bu filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 3: Lütfen cBu filmi indirmek için yalamak.
Discussion
Burada sunulan yöntem, iki ila üç gün boyunca gelişen yanal köklerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için basit bir stratejidir. 48 saate kadar periyodlar için, görüntüleme sisteminin yanal kök gelişimine olumsuz etkisi gözlemlenmemiştir. 48 saat sonra, ortalama yanal kök büyümesi yavaşlamaya başladı, ancak köklerin önemli bir alt kümesi (% 37) plakalardaki ortalama kök büyümesiyle karşılaştırılabilir oranlarda büyümeye devam etti. Bu nedenle, yeteri kadar sayıda kök görüntüleyerek, büyümesi 48 saat sonra yavaşlayan kökler hariç tutulabilir. Görüntüleme odalarının sistematik testleri 72 saatten uzun süreler için gerçekleştirilmedi, ancak uzatılmış görüntüleme periyotları aranıyorsa alternatif stratejiler önerilir. Görüntüleme odaları, eğer uygun çevresel koşullar sağlanırsa veya bir büyüme tesisine kaldırılır ve mikroskopta periyodik olarak geri gönderilirse, mikroskop sahnesinde sürekli olarak bırakılabilir. Bu, sayısız odaların paralel olarak görüntülenmesini sağlar. </ P>
Burada açıklanan odacıkların bir avantajı, yanal köklerin konumlarına sabitlenmesidir ve yüksek çözünürlüklü su daldırmalı lensler kullanılarak görüntülenebilir. Mekansal kararlılık kritik olarak destekleyici agar levhasında kullanılan agar konsantrasyonuna bağlıdır. Başlangıçta bu aralıktaki yüksek konsantrasyonların uzaydaki kökleri sabitlediğini, ancak kök büyümesinin daha hızlı yavaşladığını ve bazı köklerin, azalmış hücre uzaması da dahil olmak üzere mekanik stres belirtileri sergilediğini ortaya koyan başlangıçta% 0.8 agardan% 2 ağza kadar çeşitli konsantrasyonlar test edildi. Buna karşılık, düşük agar konsantrasyonları, gerekli destek sağlamadı ve görüntüleme sırasında x, y ve z'de sürüklenen kökler. Optimum% 1.5 agar kütüğü, olumsuz mekanik etkiler olmadan numunenin konumunu düzeltir. Bu koşullar altında, ilk 30 dakika içerisinde yerleştikten sonra, kökler gece gündüz veri edinimine izin vererek, birçok saat boyunca kararlıdır. 4D verilerinin edinimi sırasında z-yığın aralıkları genelde bEk bir 5-10 um ile raketlenmişti, ancak bu temelde z-drift veya sallantıdan ziyade yanal köklerin düzlem dışı büyümesini barındıracaktı. Standart agar konsantrasyonu penetrasyona karşı bir miktar direnç sağlamasına karşın, gravitropik olarak büyüyen kökler agara nihayet nüfuz eder. Bununla birlikte, görüntüleme odasının ufak bir modifikasyonuyla, kök büyümesi lamel paralel olarak paralel tutulabilir, böylece daha büyük lateral kökler ve birincil kökler görüntülenebilir. Dahası, temel görüntüleme bölmesi, hipokotiller için kolayca özelleştirilebilir. Hypocotyls bu sistemde daha serbestçe yüzer, bu nedenle görüntü yakalama için z ekseni braketi genellikle yaklaşık 20 μm'ye kadar yükselmiştir. Bu çalışmada, substrat özelliklerinin kontrol edilmesine izin veren dik bir mikroskop kullanılmıştır. Görüntüleme odası, ters mikroskop konfigürasyonlarına uyarlanabilir, ancak organları müdahale etmek için katı örtücülerin zamana bağlı etkisi değerlendirilmelidir. Littlejohn ve meslektaşları, PFD'nin kendisinin biyolojik molekülleri kolayca çözmediğini ve bunun farmakolojik bileşiklerin 7 sağlanması için doğrudan kullanılamayacağı anlamına geldiğini belirtti. Bu problem, bu bileşiklerin agar levhasının üzerinde durduğu katılaşmış büyüme ortamı plakası içinden temin edilerek engellendi. Perfüzyon sistemleri yıkama deneyleri için tercih edilen yöntem olmaya devam ederken, görüntüleme bölmesi deksametazon 12 ve diğer bileşiklerin uygulanması için başarıyla kullanılmıştır. Bir makale, bu makale von Wagenheim ve meslektaşları18 hazırlanırken, ışık saçlı mikroskopi kullanılarak yanal kök gelişimini görüntüleyen bir odayı açıkladı.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Tohum ekspres RFP-TUB6 ve faydalı düzeltmeler için isimsiz bir inceleme uzmanı olan British Columbia Üniversitesi'nden Prof. Geoffrey Wasteneys'e teşekkür ediyoruz. Profesör Hugh Dickinson'a mekanik bir destek olarak selüloz filmi ve fotoğraf için John Baker'i bizi uyarması için minnettarız. Bu çalışma BBSRC araştırma hibeleri BB / G013993 / 1 ve BB / D004055 / 1 IM tarafından desteklendi ve bir BBSRC Doktora Eğitim Ödülü ve CK Clarendon Bursu
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
