Summary
여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.
Abstract
측근근 형태 형성과 같은 식물 발달의 여러 측면은 며칠의 시간 간격으로 발생합니다. 기본 세포 및 subcellular 프로세스를 연구하기 위해서는 생리 조건을 보존하는 고해상도 시간 경과 현미경 전략이 필요합니다. 식물 조직은 충분한 양분과 물 공급을 유지하면서 가스 교환이 이루어져야하지만 커버 슬립 아래에 잠겨 고정되어 있으면 특히 무산소에 취약합니다. 성공적으로 사용 된 전략 중 하나는 산소와 영양분의 지속적인 공급을 유지하기 위해 재관류 시스템을 사용하는 것입니다. 그러나 이러한 장치는 복잡하고 성가 시며 특수 장비가 필요합니다. 침지 매질로서 퍼플 루오로 데칼린을 사용하는 단순 이미징 시스템에 대한 대안적인 전략이 제시된다. 이 시스템은 설치가 쉽고 장비가 최소한으로 필요하며 현미경 스테이지에 쉽게 장착 할 수있어 몇 개의 이미징 챔버를 설정하고 동등하게 촬영할 수 있습니다allel. 이 시스템에서 첫 번째 이틀 동안 한천 평판에서 표준 성장 조건과 비교하면 측부 뿌리의 성장률은 구별 할 수 없으며 적어도 하루 후에는 뿌리 뿌리의 성장이 계속 감소합니다. 식물 조직은 한천 슬래브를 통해 영양분과 함께 공급되어 약리학 화합물을 투여 할 수 있습니다. 이 시스템은 측부 뿌리 발달을 모니터하기 위해 설립되었지만, 배축 및 일차 뿌리와 같은 다른 식물 기관을 이미지화하기 쉽습니다.
Introduction
식물 개발의 기초가되는 세포 및 세포 아래의 과정을 연구하기 위해, 고해상도의 장기간 경과 영상 전략에 대한 요구가 증가하고있다. 이러한 영상 실험에서 중요한 과제는 충분한 기체 교환과 물과 영양소 1 , 2 , 3 의 공급을 포함한 생리적 조건의 유지입니다. 최적의 광학 해상도를 위해 높은 개구 수를 가진 대상을 사용하려면, 시편을 coverslip에 근접하여 근접하게 배치해야합니다. x, y, z 방향으로의 움직임은 이상적으로 이미징하는 동안 최소화해야합니다.
묘목은 단기 이미징을 위해 종종 물 또는 수용액에 장착되지만, 물은 CO 2 와 O 2 (20 ℃, 0.1 MPa에서 각각 1.54 mg / mL 및 0.04 mg / mL)를 용해시키는 능력이 낮습니다 4 , 그것은장시간 저속 실험에는 적합하지 않습니다. 산소와 양분의 일정한 수준을 유지하는 관류 시스템은이 문제에 대한 하나의 해결책이며 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 1 , 2 , 3 및 광 시트 현미경 (LSM) 5 용으로 개발 되었습니다. RootChip 2 및 RootArray 3 와 같은 시스템은 뿌리 개발의 시간 경과 이미징을 위해 특별히 설계되었으며 사용자 정의 빌드 멀티 표본 장치에서 씨앗을 발아시킵니다. 이러한 배열은 최소한의 기계적 섭동을 보장하며 여러 묘목의 병행 분석을 위해 설계되었지만 세포 아래 구조의 이미징에 최적화되어 있지 않습니다. Calder와 동료들은 표본이 메쉬에 의해 제 위치에 고정되어있는 세포 아래 구조의 이미징에 최적화 된보다 복잡한 관류 기반 이미징 챔버를 설계했습니다고배율 침지 렌즈 1 의 사용을 허용합니다.
여기에 관류 시스템을 기반으로하지는 않지만 perfluorodecalin (PFD)이라는 퍼 플루오르 카본 (perfluorocarbon)을 사용하는이 문제에 대한 대안적이고 간단한 해결책이 제시되었다.이 퍼 플루오르 카본은 최근 Arabidopsis 영상 6 , 7 , 8 의 장착 매체로 인기를 얻고있다. 이러한 응용에서, CO 2 와 O 2 (물에서 0.04 mg / mL와 비교하여 PFD에서 O 2 에 대해 1.9 g / mL)를 용해시키는 PFD의 높은 용량은 침지 된 조직에 의한 기체 교환을 허용한다. 또한 PFD는 비 형광이며 굴절률 (1.313)은 물 (1.333)과 비슷하며 공기 (1.000)보다 세포질 (~ 1.4)에 가깝다. 퍼플 루오로 카본은 다양한 식물 및 식물에 대해 최소한의 생리적 효과를 나타냄PFD에 잠수 시켰을 때 쉽게 자라는 무우 씨앗과 물 공급시 적어도 2 일 동안 정상적인 성장과 발달을 보이는 문제 6 . 유사한 관찰이 Arabidopsis 종자를 발아 시키기 위해 만들어졌다. 리틀 존 (Littlejohn) 연구팀은 침윤 후 애기 장대 잎 조직에서 PFD의 분포를 직접적으로 이미지화하기 위해 유도 된 라만 산란을 기반으로 PFD가 살아있는 세포에 의해 흡수되지 않을 것이라고 결론 지었다. PFD는 이전에 공중 조직을 이미지화하는 데 주로 사용되어 낮은 표면 장력으로 인해 공기 공간에 쉽게 침투하여 이미징 깊이가 크게 증가합니다. 여기에서, PFD는 개발 측면 뿌리의 장기 공 촛점 이미징에 채택됩니다. 이 구성에서 한 개 이상의 묘목을 한천으로 응고시키고 PFD에 담근 성장 배지의 슬래브 위에 놓습니다. PFD는 g이미징 챔버에서의 비 교적 교환. 무산소 방지. PFD는 매우 휘발성이므로 폴리 (디메틸 실록산) 껌 가스켓 (높은 가스 투과성 (CO 2 의 경우 1.5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11)으로 유지 됩니다. 영양분과 물은 한천으로 고형화 된 배지의 슬래브에 의해 공급됩니다. 동시에,이 한천 슬랩은 coverslip에 대해 뿌리를 부드럽게 가압하여 이미지 챔버에서의 상대적 위치를 고정시키고 고해상도 수침 렌즈의 사용을 허용합니다. 또한 한천 슬라브는 dexamethasone, oryzalin 및 isoxaben을 비롯한 다양한 약리학 적 치료를 관리하는 데 사용할 수 있습니다. 이미징 챔버는 최소한의 장비를 사용하여 표준 현미경 슬라이드에서 대량으로 조립할 수 있습니다. 이미징 챔버는 측부 뿌리 발달을 연구하기 위해 개발되고 특징 지어졌지만 1 차 뿌리 끝과 같은 다른 모종 장기를 이미징하는 데 적용 가능하며배축.
Protocol
1. 챔버 만들기
- 유리 커터를 사용하여 1mm 두께의 현미경 슬라이드 끝에서 3mm 폭 스트립을 자릅니다. 시아 노 아크릴 레이트 수퍼 접착제 또는 양면 테이프를 사용하여 두 번째 현미경 슬라이드 ( 그림 1A ) 너비에 걸쳐 약 45mm 간격으로 이들 유리 스트립을 붙입니다. 챔버 당 하나의 슬라이드가 필요하며, 한천 슬라브를 부는 추가 슬라이드가 필요합니다 (한 슬라이드는 2-3 개의 한천 슬랩을 얻을 수 있습니다). 슬라이드를 다시 사용할 수 있습니다.
- 유리 스트립 사이에 가스 투과성 폴리 (디메틸 실록산) 검에서 동일한 높이의 가스켓을 형성하십시오. 슬라이드 ( 그림 1B )에 폴리 (디메틸 실록산) 껌을 놓고 두 번째 슬라이드에 100 % 절대 에탄올을 약간 묻힌 다음 높이가 될 때까지 두 번째 슬라이드가있는 폴리 (디메틸 실록산) 껌 공을 평평하게 놓습니다 ( 그림 1C ).
- 필요한 경우 과도한 폴리 (다임틸트 실록산) 검을 면도날과 반복하여 평평하게합니다.
- 절대 에탄올로 적신 적절한 커터 또는 면도날을 사용하여 폴리 (디메틸 실록산) 껌의 내부 부분을 제거하여 나중에 모종과 한천 슬랩을 채울 캐비티를 만듭니다 ( 그림 1D ).
- 면도날로 조심스럽게 젤을 트리밍하여 벽 두께가 약 2 mm 인 가스켓을 만듭니다 ( 그림 1E ). 폴리 (디메틸 실라 잔) 배리어를 통한 가스의 투과성은 50 μm 이상의 두께와는 무관합니다.
2. 성장 배지의 한천 응고 슬래브 생성
- 두 개의 유리 스트립이있는 현미경 슬라이드에서 두 개의 유리 스트립에 놓 이도록 coverslip (22 mm x 50 mm)을 놓습니다.
- 피펫은 생성 된 공간에 1 % w / v 수크로오스 및 1.5 % w / v 한천 (½ MS)을 함유하는 반 강도의 무라 시게 (Murashige) 및 Skoog 성장 배지를 녹였다후자가 완전히 채워질 때까지 (약 1 mL 총 부피) 커버 글래스 아래에 놓고 한천이 설정 될 때까지 (약 5 분) 둡니다.
주 : 약리학 적 화합물은 슬래브가 부어지기 전에 액체 배지에 적절한 농도를가함으로써 한천 슬랩을 통해 투여 될 수있다. 이것은 dexamethasone 12 , isoxaben, 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), oryzalin 및 latrunculin B에 대해 성공적으로 테스트되었습니다.
3 . 챔버 설치 완료
- 공기는 튜브에 소량의 PFD를 흔들어 PFD를 평형시킵니다. 공기 평형 PFD를 소량 (약 200 μL) 겔 가스켓의 구멍에 넣고 완전히 채우지 마십시오. 이 PFD는 한천 슬래브가 챔버에 배치 될 때 한천 슬래브 아래에서 기포가 포집되는 것을 방지합니다.
- 한천 슬래브 (위의 2.2 단계에서)에서 coverslip을 제거하고 면도날을 사용하여 de의 일부를 자릅니다크기와 모양을 지친. 그런 다음 젤 개스킷의 우물에 넣으십시오 ( 그림 1F ). 가스켓에 2 ~ 4mm 정도의 간격이 있어야합니다.
- 공기 평형 PFD로 챔버를 완전히 채우십시오.
- 한두 마리의 A. thaliana 묘목 (2-3 일 이상 이미징을위한 묘목 3 개까지)을 한천 슬래브 위에 놓고 자엽과 배축을 가장자리에 매달아 PFD에 띄웁니다 ( 그림 1G ).
- 묘목을 얻으려면 1 % 자당과 0.8 % 한천을 보충 한 1 / 2MS 배지에 70 % 에탄올로 식물을 멸균하고, 4 ℃에서 2 ~ 4 일 동안 층을 형성하고, 22 ° C에서 수직 배향 된 플레이트에서 성장시킵니다 h 광 / 8 시간 어두운 정권. 측부 뿌리를 이미징하기 위해 이미징 챔버로 옮기기 전에 7-10 일 동안 식물을 재배하십시오.
- 챔버를 닫으려면, coverslip 때까지 유리 현미경 슬라이드의 가장자리와 부드럽게 눌러 목표의 광학에 맞는 coverslip을 적용양쪽 유리 스트립에 놓입니다 ( 그림 1H ).
- 원하는 경우 양쪽 끝에 절반 길이로 자른 1.25cm 폭의 미세 구멍 수술 용 테이프로 coverslip을 고정시킵니다 ( 그림 1I ). 이미징하기 전에 약 30 분 동안 표본을 정착시킵니다. 이렇게하면 이미징 중에 표본 이동을 최소화 할 수 있습니다.
- 성장을 위해 제어 된 기판을 유지하기 위해 직립 현미경으로 이미징을 수행하십시오. 20X / 0.7NA 또는 63X / 1.2NA CS2 목표를 사용하십시오.
Representative Results
측근은 영상 실에서 생리 학적 속도로 자랍니다.
이미징 챔버에서 식물의 측근 길이를 시간 간격으로 측정하고 ( 그림 2A , 왼쪽, 영화 1, n = 23), 성장 속도를 동일한 한천 배지를 함유 한 표준 페트리 플레이트에서 성장시킨 외측 뿌리의 성장 속도와 비교 하였다. 2A , 오른쪽, 영화 2, n = 23). 성장률은 뿌리의 길이가 점점 더 길어지는 성장 및 증식 영역 때문에 하나의 결정 요인이되는 외측 뿌리 사이에서 상당히 다를 수 있습니다. 따라서, 측부 뿌리 세트는 이미징 챔버 및 한천 플레이트 모두에서 상이한 초기 길이 (50 ㎛ 내지 1150 ㎛ 범위)의 뿌리를 나타 내기 위해 선택되었다. 실험 시작시 평균 측근 길이각 세트 (439 및 442 μm의 이미징 챔버 및 플레이트 각각)에서 유사했습니다. 분석 된 27 시간의 시간 간격에서, 측부 뿌리 성장은 이미징 챔버 및 플레이트 모두에서 대략 직선이었고, 평균 성장 속도는 플레이트상에서 52㎛ / h (R2 = 0.997) 및 이미징 챔버에서 51㎛ / h였다 R2 = 0.993) ( 도 2B ). 플레이트 및 이미징 챔버 ( 그림 2C ) 모두에서 매우 가변적 인 개별 측면 뿌리의 성장 속도는 이미징 챔버에서 17 μm / h에서 82 μm / h까지, 그리고 플레이트에서 13 μm / h에서 87 μm / h에 이릅니다. 성장률은 일반적으로 뿌리의 길이에 따라 증가하지만, 성장률은 비슷한 길이의 뿌리 사이에서 여전히 다양하지만, 그 차이는 이미징 챔버 및 판에서 유사했다.
측부 뿌리가 영상 실에서 증식하고 안녕을 사용하여 영상화 될 수 있습니다.gh 수치 개구 목표
혈장 막 마커 NPSN12-YFP 14 와 미세 소관 마커 UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 를 공동 발현하는 측근을 1 시간 간격으로 CLSM 10 으로 영상화하여 영상 챔버에서 세포 증식 동안의 미세 소관 거동을 기록 하였다 ( 그림 2D , 영화 3). 이 챔버에서 측부 뿌리는 x, y 및 z 축의 위치에서 매우 안정적이어서 수 시간에 걸쳐 연속 저속 공 촛점 스택을 얻을 수있었습니다. prepriase 밴드 ( 그림 2D , 녹색 화살표), 유사 분열 스핀들 ( 그림 2D , 흰색 화살표) 및 phragmoplasts ( 그림 2D , 파란색 화살표)의 형성에서 분명히 Meristematic 세포가 지속적으로 증식. 페트리 접시에 묘목과 마찬가지로,이미징 챔버에서 완전히 길쭉한 뿌리 세포가 뿌리털을 시작 ( 그림 2A , 그림 2D , 화살 머리), 이는 이미징 챔버에서 예상대로 개발이 진행되었음을 나타냅니다. 넓은 시야를 제공하기 위해, 도 2D 의 이미지는 20x / 0.7NA 목적으로 얻어졌다. 또한 높은 수치 개구 수 63x / 1.2 NA 수 침지 대물 렌즈를 사용하여 측부 뿌리의 고해상도 이미지를 얻을 수있었습니다 ( 그림 2E ).
측근의 성장은 영상 실에서 최대 3 일 동안 지속됩니다.
영상 챔버가 생리 학적 속도에서 측근 성장을 얼마나 오래 유지할 수 있는지 알아보기 위해 영상 챔버 (n = 27)와 판 (n = 33)의 측근 길이를 0 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 정량화했다. 뿌리 쵸sen은 0 시간에서 200 μm보다 짧았으며, 평균 측근 길이는 이미징 챔버에서 117 μm, 플레이트에서 121 μm였다. 짧은 뿌리가 평균적으로 더 천천히 자라기 때문에 ( 그림 2C ), 그들은 한천 슬래브 가장자리에서 자라지 않고 이미지가 더 쉬워졌습니다. 모든 측면 뿌리의 평균 성장은 첫 번째 48 시간 ( 그림 3A )에서 페 트리 플레이트와 비교하여 이미징 챔버에서 크게 차이가 없었다. 그러나 평균 성장은 48 시간에서 72 시간 사이에 현저하게 감소했다 ( 그림 3A ). 성장 속도는 일반적으로 48 시간 후 이미징 챔버에서 느려지는 것처럼 보이지만 개개인 간의 성장률은 매우 가변적이며 ( 그림 3B , 3C ), 이는 플레이트 및 챔버에서 유사한 속도로 성장하는 측면 뿌리의 상당 부분 집합이 있음을 의미합니다 완전한 72 시간의 성장 기간 동안. 재배 된 33 개의 외측 뿌리 중 23 개(69.7 %)는 72 시간 (927과 3,163 μm 사이, 그림 3B , 적색)에서 평균 길이의 표준 편차 내에서 길이에 이른다. 이미징 챔버의 27 개 중 10/27 (37.0 %) 측근이이 간격 내에서 길이에 도달합니다 ( 그림 3B , 빨간색).
이미징 챔버는 구형 측면 뿌리, 일차 뿌리 및 배축에 쉽게 적응할 수 있습니다 .
원래의 이미징 챔버 디자인의 한계 중 하나는 딱딱한 한천 슬래브가 기계적 저항을 제공하는 반면, 중력 학적으로 성장하는 뿌리가 한천 슬래브에 결국 침투하여 이미지 품질이 저하되고 ( 그림 4B ) 높은 NA의 작동 거리 이상으로 성장한다는 것입니다 (0.3mm) 63X / 1.3 NA CS2 대물 렌즈까지도 포함하고 있습니다. 젊은 측근은 결석을 포함하지 않는다columella 세포가 gravitropism 17에 필요한 그래서 처음 그들은 이미징 챔버 ( 그림 2E )에서 coverslip에 평행 성장했다. 그들이 더 오래 성장하고 columella 및 statoliths 형태로, 측면 뿌리는 증가 긍정적 인 gravitropism 반면 기본 뿌리는 발아 이후 강한 gravitropic 응답을 전시하고 있습니다. 이것은 1 차 뿌리가 몇 군데 촬영 될 수있는 기간을 몇 시간으로 제한하며, 48 시간 이상 지속적으로 이미지화 할 수있는 측면 뿌리의 시작 길이를 심각하게 제한합니다. 이 한계를 극복하기 위해 챔버는 한천 슬랩 ( 그림 4A )의 표면에 침투 장벽 역할을 cellulosic 셀로판 막에 의해 coverslip에 평행하게 유지되도록 수정되었습니다. 1.5 % 한천 슬랩을 사용한 초기 시도는 아마도 기계적 스트레스로 인해 처음 24 시간 이내에 뿌리 성장을 감소 시켰습니다. 슬래브에서 한천 농도를 낮추어0.8 % 한천과 셀룰로오스 막이 함유 된 슬래브가있는 챔버에서 젊은 측근 뿌리 성장 속도는 처음 48 시간 동안 기존 챔버의 성장 속도와 크게 다르지 않음을 발견했다. 0-24 시간 동안 셀룰로오스 챔버와 기존 챔버의 평균 뿌리 성장은 각각 242 μm와 262 μm 였고 (p = 0.78 Student 's t-Test), 24-48 h는 330 μm와 355 μm 1 이었다 (p = 0.67 Student 's t- 검정); n = 12 및 n = 11이다. 이 배열은 효과적으로 coverslip에서 한천으로 성장하는 측면 뿌리를 방지하고 또한 최대 48 시간 ( 그림 4C )에 대한 기본 뿌리의 이미징을 허용.
이미징 챔버가 뿌리 이외의 기관에 적용될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 애기 장대 배축이 선택되었습니다. 난 모세 혈관은 뿌리보다 실질적으로 두껍기 때문에 종래의 영상 진단 챔버에서 최상부의 cells는 coverslip에 대해 압착되어 변형을 초래했습니다. 따라서 대체 디자인은 중앙에 타원형 함몰을 포함하는 공동 슬라이드를 사용하여 개발되었습니다 ( 그림 4D ). 이 구성에서 1mm 두께의 한천 한천 (위의 2.2에서 준비)을 슬라이드 캐비티에 몇 mm 씩 돌출시켜 위치 시켰습니다 ( 그림 4D ). 배설물은 슬라이드의 공동 위에 위치하고 뿌리는 수평 부분 위에 위치합니다. 이것은 묘목이 뿌리에 의해 공간에 고정되었지만 배축은 부숴지지 않았다. 판에 비해 챔버에서의 성장률은 체계적으로 정량화되지 않았지만, 이미징 챔버에서의 배축은 배축 ( 그림 4E , 4F ) 16 위로 이동하는 잘 묘사 된 세로 성장의 파동을 나타냈다.
그림 1 : 이미징 챔버 조립. 모든 세부 사항은 텍스트에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 측부 뿌리는 영상 실에서 생리 조건 하에서 성장합니다. ( A ) 영상 챔버 (왼쪽)와 플레이트 (오른쪽)에서 25 시간 이상 (일정한 빛, 수평 인큐베이션, 동시 영상) Arabidopsis lateral root development. 스케일 바 = 200 μm. ( B ) ( A )와 같이 측근 길이가 27 시간 (1 시간 간격으로 측정) 이상인 측근을 나타내는 플롯. 개인회색으로 그려져있는 뿌리 뿌리 (판과 이미징 챔버의 경우 n = 23), 평균 길이는 빨간색 원으로 표시됩니다. 오류 막대 = 1 SD. 빨간색 선은 평균 길이를 통한 선형 적합입니다. ( C ) 초기 길이에 비례하여 ( B )에 표시된 모든 횡근에 대한 평균 성장률을 나타내는 플롯. ( D ) 연속 시점에서 NPSN12 - YFP 및 RFP - TUB6을 표현 측면 뿌리에서 얻은 3D 공 촛점 스택의 최대 강도 예상. Inset : 박스 영역의 확대. 녹색 화살표 : preprophase 밴드; 백색 화살표 : 유사 분열 스핀들; 파란색 화살표 : phragmoplasts; 화살촉 : 뿌리털. ( E ) 63X / 1.2 NA 목적 및 나이 퀴 스트 표본 추출 (픽셀 치수 77 nm x 77 nm)을 사용하여 ( D )에 표시된 트랜스 제닉 라인의 젊은 측근으로부터 얻은 고해상도 이미지의 최대 강도 투영 h; 별표는 각 시점에서 동일한 세포를 찾습니다; 화살표는 0h와 16h 사이에서 나뉘는 셀을 나타냅니다.스케일 바 = 50 μm (AC); 20 ㎛ (E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 이미징 챔버에서의 장기적인 측 방향 루트 현상. ( A ) 플레이트에 비해 이미징 챔버에서 3 연속 24 시간 간격으로 평균 절대 뿌리 성장을 나타내는 플롯. ns는 p> 0.05를 나타낸다. ***는 p <0.001 (학생 t- 검정)을 나타낸다. n = 33 (플레이트) 및 n = 27 (이미징 챔버). ( B ) (A)에서 사용 된 모든 뿌리의 연속 시점에서 측근 길이를 나타내는 플롯. 적색 : 모든 외측 뿌리는 판상에서 자란 모든 외측 뿌리의 평균의 1 SD 내에서 최종 길이를 갖는다 (927에서 3163 μm 사이). ( C ) 최대 값72 시간 이상 연속 된 시점에서 획득 한 측부 뿌리의 혈장 막 마커 NPSN12-YFP의 대표적인 3D 공 초점 스택의 강도 투영. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 이미징 챔버는 다른 식물 기관에 적용 할 수 있습니다. ( A - C ) 기본 뿌리에 대한 이미징 챔버 적응. ( A ) 이미징 챔버 디자인의 도식. 이는 MS medium 슬라브가 1.5 % 한천 대신 0.8 % 한천을 함유하고 성장을 막기 위해 한천과 식물 사이에 셀룰로오스 막 (적색)이 놓여있는 것을 제외하고는 표준 설계 ( 그림 1 )와 동일합니다한천에 넣는다. ( B ) 종래의 이미징에서 0 시간 및 48 시간에 이미징 된 7 일령 모종의 일차 뿌리에서 혈장 - 막 마커 NPSN12-YFP의 대표적인 3D 공 초점 스택의 XY (상부) 및 XZ (하부) 최대 강도 투영 방. 그 뿌리는 중력 영양 반응 때문에 한천으로 자랍니다. ( C ) 이미징에서 0 시간 및 48 시간에 이미징 된 7 일 된 묘목의 주요 뿌리에서 혈장 막 마커 NPSN12-YFP의 대표적인 3D 공 초점 스택의 XY (상부) 및 XZ (하부) 최대 강도 투영 챔버와 셀룰로오스 필름. 적용 전에, 셀룰로스 필름을 80 % 에탄올에서 멸균시키고 액체 ½ MS 배지에 담그었다. 한천에 뿌리가 중력장으로 성장하는 것을 방지합니다. ( D - F ) 배축에 대한 이미징 챔버 적응. 배축 (hypocotyl imaging chamber) 디자인을 보여주는 ( D ) 도식. 폴리 (디메틸 실록산) 고무 가스킷 (회색)은 manufactu두 개의 유리 스트립 (노란색) 사이의 캐비티 슬라이드에 빨간색. 1.5 % 두께의 한천 (베이지 색)의 한천이 슬라이드에 놓여 부분적으로 공동에 도달합니다. 챔버는 PFD (파란색)로 채워져 있습니다. 모종은 한천 슬래브 위에 놓여서 배축이 한천의 수평 부분에 위치하는 동안 배축이 한천 슬래브의 아래쪽으로 기울어 진 영역을 차지하도록합니다. 챔버는 coverslip으로 닫힙니다. ( E ) 2 일 된 모종의 배축에있는 혈장 막 마커 NPSN12-YFP의 대표적인 3D 공 촛점 스택의 최대 강도 예측은 연속적인 시점에서 48 시간 이상 이미지화 하였다. ( F ) ( E )에서 보여지는 배축의 기초에서 꼭두각시의 축 (E로 나타낸 축을 따라 0 시간에서의 상대적 위치)을 따르는 개별 세포의 2 개의 연속적인 시간 간격의 세로 성장. 앞서 묘사 된 배축이 배축 16 위로 옮겨지는 것을 주목하십시오. 스케일 바 = 100 μ엠. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 2 ~ 3 일 동안 외측 근을 개발하는 고해상도 공 촛점 영상을위한 간단한 전략입니다. 최대 48 시간 동안, 측부 뿌리 발달에 대한 영상 시스템의 부작용이 관찰되지 않았다. 48 시간 후, 뿌리의 상당 부분 집합 (37 %)이 평판에서의 평균 뿌리 성장과 비슷한 속도로 계속 성장했지만, 평균 측근근 성장은 느려지기 시작했다. 따라서, 충분히 많은 수의 뿌리를 영상화함으로써, 48 시간 후에 성장이 느려지는 뿌리가 배제 될 수있다. 이미징 챔버의 체계적인 테스트는 72 시간보다 오래 수행되지는 않았지만 연장 된 이미징 기간이 필요한 경우 대체 전략을 권장합니다. 이미징 챔버는 적절한 환경 조건이 제공되거나 성장 시설로 옮겨지고 주기적으로 현미경으로 되돌려지면 현미경 스테이지에 지속적으로 방치 될 수 있습니다. 이것은 다수의 챔버가 평행하게 묘화되도록한다./ p>
여기에 설명 된 챔버의 장점 중 하나는 측부 뿌리가 그 위치에 고정되어 있으며 고해상도 수침 렌즈를 사용하여 이미지화 할 수 있다는 점입니다. 공간 안정성은지지 용 한천 슬랩에 사용 된 한천 농도에 따라 결정됩니다. 처음에는 0.8 % 한천에서 2 % 한천까지 다양한 농도 범위에서 시험했는데이 범위의 고농도는 공간에서 안정적으로 고정되었지만 뿌리 성장은 더디게 느려지 며 일부 뿌리는 감소 된 세포 신장을 포함하여 기계적 스트레스의 징후를 나타냈다. 대조적으로, 한천 농도가 낮 으면 이미징하는 동안 x, y 및 z로 표류하는 뿌리가 필요하지 않습니다. 최적의 1.5 % 한천 슬랩은 부작용없이 시험편의 위치를 고정합니다. 이러한 조건에서 처음 30 분 정도 정착 한 후 몇 시간 동안 뿌리가 안정되어 밤새 데이터 수집이 가능합니다. 4D 데이터를 수집하는 동안 z 스택 범위는 일반적으로 b5 ~ 10 μm의 추가 두께가 있었지만, 이것은 주로 Z- 드리프트 또는 흔들림보다는 측면 뿌리의 면외 성장을 수용하기위한 것이 었습니다. 표준 한천 농도가 침투에 대해 약간의 저항을 제공하지만, 중력에 의해 뿌리가 한천에 침투하게됩니다. 그러나 이미징 챔버의 사소한 수정을 통해 뿌리 성장은 coverslip과 평행하게 유지 될 수 있으므로 오래된 측근과 주 뿌리를 이미지화 할 수 있습니다. 또한 기본 이미징 챔버는 배축에 맞게 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 나팔꽃은이 시스템에서 더 자유롭게 떠 다니므로 이미지 수집을위한 z 축 브래킷이 일반적으로 약 20 μm로 증가합니다. 이 연구에서 직립 현미경을 사용하여 기판 특성을 제어 할 수있었습니다. 이미징 챔버는 거꾸로 현미경 구성에 적응할 수 있지만 요격 인터럽트 기관에 대한 coverslip의 시간 의존 영향을 평가해야합니다. 리틀 존 (Littlejohn) 연구팀은 PFD 자체가 생물학적 분자를 쉽게 용해시키지 못하므로 약리학 적 화합물 전달에 직접적으로 사용될 수 없다는 것을 지적했다. 이 문제는 한천 슬래브가 놓여있는 응고 된 성장 배지의 슬래브를 통해 그러한 화합물을 공급함으로써 극복되었다. 관류 시스템이 세척 실험을위한 선택 방법으로 남아 있지만, 이미징 챔버는 dexamethasone 12 및 기타 화합물의 투여에 성공적으로 사용되었습니다. 한 노트,이 기사는 준비 중이었습니다. Wagenheim과 동료들은 가벼운 시트 현미경을 사용하여 측부 뿌리 발달을 영상화하기위한 챔버를 설명했습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 브리티시 컬럼비아 대학의 Geoffrey Wasteneys 교수에게 RFP-TUB6을 씨앗으로 표현하고 익명의 평론가에게 도움이되는 수정에 대해 감사드립니다. 휴 디킨슨 (Hugh Dickinson) 교수는 셀룰로오스 필름을 기계적 지지물로 사용하고 존 베이커 (John Baker)가 사진 촬영에 사용함을 알려 주신 데 대해 감사드립니다. 이 연구는 BBSRC의 연구 보조금 인 BB / G013993 / 1 및 BB / D004055 / 1의 IM 및 BBSRC 박사 교육 상 및 Clarendon Scholarship of CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
