Presentert her er en enkel teknikk for høyoppløselig konfokal time-lapse avbildning av rot- og hypokotylutvikling i opptil 3 dager ved bruk av høye numeriske blendermål og perfluorodekalin som et nedsenkingsmedium.
Flere aspekter av planteutvikling, som lateral rotmorfogenese, forekommer på tidsrom på flere dager. For å undersøke underliggende cellulære og subcellulære prosesser, kreves mikrologistrategier for høy oppløsning med tidsbesparelse som opprettholder fysiologiske forhold. Plantevev må ha tilstrekkelig nærings- og vannforsyning med vedvarende gassutveksling, men når de er nedsenket og immobilisert under et deksel, er de spesielt utsatt for anoksi. En strategi som har vært vellykket ansatt er bruk av et perfusjonssystem for å opprettholde en konstant tilførsel av oksygen og næringsstoffer. Imidlertid kan slike arrangementer være kompliserte, besværlige og kreve spesialisert utstyr. Presentert her er en alternativ strategi for et enkelt bildebehandling system som bruker perfluorodecalin som et nedsenkingsmedium. Dette systemet er enkelt å sette opp, krever minimalt utstyr, og er enkelt montert på et mikroskop-trinn, slik at flere bildekamre kan settes opp og avbildes i parallel. I dette systemet er laterale rotveksttyper skiller seg ut fra vekstratene under standardbetingelser på agarplater de første to dagene, og lateral rotvekst fortsetter med reduserte hastigheter i minst en annen dag. Plantevev leveres med næringsstoffer via en agarplate som også kan brukes til å administrere en rekke farmakologiske forbindelser. Systemet ble etablert for å overvåke lateral rotutvikling, men er lett å tilpasse seg til andre planteorganer som hypokotyler og primære røtter.
For å studere cellulære og subcellulære prosesser som ligger til grund for planteutviklingen, er det en økende etterspørsel etter langvarige tidsbegrensede bildestrategier. En sentral utfordring i slike bildeeksempler er vedlikehold av fysiologiske forhold, inkludert tilstrekkelig gassutveksling pluss tilførsel av vann og næringsstoffer 1 , 2 , 3 . For å utnytte mål med høye numeriske åpninger for optimal optisk oppløsning, bør prøvene plasseres i umiddelbar nærhet og orientert parallelt med dekselet. Bevegelse i x, y og z retninger bør ideelt sett være minimal under bildebehandling.
Mens kimplanter ofte er montert i vann eller vandig løsning for kortsiktig bildebehandling, har vann en lav kapasitet for oppløsning av CO 2 og O 2 (1,54 mg / ml og 0,04 mg / ml henholdsvis ved 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , som gjørDet er uegnet for utvidede tidsforsinkelsesforsøk. Perfusjonssystemer som opprettholder konstante nivåer av oksygen og næringsstoffer er en løsning på dette problemet og har blitt utviklet for både konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) 1 , 2 , 3 og lysmikroskopi (LSM) 5 . Systemer som RootChip 2 og RootArray 3 er designet spesielt for tidsavbrudd av bilding av utviklende røtter og involverer spiring av frø i en skreddersydd flerprøve enhet. Disse ordningene sikrer minimal mekanisk forstyrrelse og er konstruert for parallell analyse av flere plantinger, men er ikke optimalisert for avbildning av subcellulære strukturer. Calder og kolleger har designet et mer komplisert perfusjonsbasert bildekammer optimalisert for avbildning av subcellulære strukturer der prøven holdes på plass med et nettFor å tillate bruk av høy forstørrelsesdyse linser 1 .
Presentert her er en alternativ, enkel løsning på dette problemet, som ikke er basert på perfusjonssystemer, men benytter perfluorodekalin (PFD), en perfluorkarbon som nylig har blitt populær som et monteringsmedium for arabidopsis-bildebehandling 6 , 7 , 8 . I slike applikasjoner tillater den høye kapasitet av PFD for oppløsning av CO 2 og O 2 (1,9 g / ml for O 2 i PFD sammenlignet med 0,04 mg / ml i vann) 9 , gassutveksling ved det nedsenkede vev. Videre er PFD ikke-fluorescerende, og dens brytningsindeks (1.313) er sammenlignbar med den for vann (1,333) og er nærmere den for cytosol (~ 1,4) enn luft (1,000) 6 . Perfluorokarboner har blitt rapportert å ha minimal fysiologisk effekt på en rekke planter og planterProblem 6 , med røkelsesfrø som sprer seg lett når nedsenket i PFD og utviser normal vekst og utvikling i minst to fulle dager når den leveres med vann 10 . Lignende observasjoner har blitt gjort for germinating Arabidopsis frø 6 . Basert på stimulert Raman-spredning for å direkte bilde fordelingen av PFD i Arabidopsis bladvev etter infiltrering, konkluderer Littlejohn og kolleger at PFD sannsynligvis ikke er tatt opp av levende celler 8 . PFD har tidligere blitt brukt hovedsakelig til luftvev i bildene, hvor det øker bildedybden betydelig, da den lett infiltrerer luftrom på grunn av dens lave overflatespenning 6 . Her er PFD vedtatt for langsiktig konfokal avbildning av utvikling av laterale røtter. I denne konfigurasjonen plasseres en eller flere frøplanter på en plate av vekstmedium størknet med agar og nedsenket i PFD. PFD tillater gAseous utveksling i bildekammeret, forebyggende anoxi. PFD er svært flyktig, slik at den holdes av en pakning av poly (dimetylsiloksan) tannkjøtt som også har høy gasspermeabilitet (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 for CO 2 ) 11 . Næringsstoffer og vann leveres av mediumplaten størknet med agar. Samtidig presser denne agarplaten forsiktig mot roten mot dekselglasset, og dermed fester den relative posisjonen i bildekammeret og tillater bruk av vannoppløsningslinser med høy oppløsning. Videre kan agarplaten brukes til å administrere en rekke farmakologiske behandlinger, inkludert dexametason, oryzalin og isoksaben. Bildekamrene kan monteres i store mengder fra standardmikroskopisk lysbilder ved hjelp av minimalt utstyr. Bildekamrene ble utviklet og karakterisert for å studere lateral rotutvikling, men er tilpassbare til å avdekke andre plantelegemer, som primære rottepenner oghypocotyls.
Metoden som presenteres her er en enkel strategi for høyoppløselig konfokal avbildning av utvikling av laterale røtter i to og opptil tre dager. I perioder på opptil 48 timer ble det ikke observert noen bivirkninger av bildesystemet på sideveisutvikling. Etter 48 timer begynte den gjennomsnittlige laterale rotveksten å sakte, selv om en betydelig delmengde av røttene (37%) fortsatte å vokse med priser som var sammenlignbare med gjennomsnittlig rotvekst på platene. Derfor, gjennom bildebehandling et tilstrekkelig stort antall røtter, kan røtter hvis vekst bremser etter 48 timer, utelukkes. Systematiske tester av bildekamrene ble ikke utført i perioder som var lengre enn 72 timer, men alternative strategier anbefales hvis utvidede avbildningsperioder er ønsket. Imagingkamre kan være igjen på mikroskopetrinnet kontinuerlig, dersom egnede miljøforhold blir tilveiebrakt, eller fjernet til et vekstanlegg og periodisk returnert til mikroskopet. Dette gjør at mange kamre kan avbildes parallelt. </ P>
En fordel med kamrene som beskrives her er at laterale røtter er festet i deres posisjon og kan avbildes ved bruk av vannoppløsningslinser med høy oppløsning. Den romlige stabiliteten avhenger kritisk av agarkonsentrasjonen som anvendes i den støttende agarplaten. I utgangspunktet ble en rekke forskjellige konsentrasjoner fra 0,8% agar til 2% agar testet, noe som viste at høye konsentrasjoner i dette området stabilt fikserte røtter i rommet, men rotveksten senket raskere og noen røtter viste tegn på mekanisk stress, inkludert redusert celleforlenging. I motsetning til dette ga lave agarkonsentrasjoner ikke den nødvendige støtten og røttene drev i x, y og z under bildene. Den optimale 1,5% agarplaten retter posisjonen til prøven uten negative mekaniske effekter. Under disse forholdene, etter oppgjør i de første 30 minuttene, er røttene stabile over mange timer, noe som tillater dataoppkjøp over natten. Under oppkjøpet av 4D-data var z-stakkord vanligvis bRacketed med ytterligere 5-10 μm, men dette var hovedsakelig å imøtekomme ut-av-plan vekst av laterale røtter i stedet for z-drift eller wobble. Selv om standard agar-konsentrasjonen gir noe motstand mot penetrasjon, vil gravitropisk voksende røtter etter hvert trenge inn i agaret. Imidlertid, gjennom en mindre modifikasjon av bildekammeret, kunne rotveksten opprettholdes parallelt med dekselglasset, slik at eldre laterale røtter og primære røtter blir avbildet. Videre kan det grunnleggende bildekammeret lett tilpasses for hypokotyler. Hypokotyler er mer fritt flytende i dette systemet, slik at z-aksen braketten for bildeoppkjøp ble økt vanligvis til ca 20 μm. I denne studien ble et opprettholdt mikroskop brukt over hele, noe som tillot substrategenskapene å bli kontrollert. Imagingkammeret kan være tilpassbart til inverterte mikroskopkonfigurasjoner, men den tidsavhengige innflytelsen av den stive deksel på oppfangingsorganer må vurderes. </p>
Littlejohn og kolleger har påpekt at PFD selv ikke lett oppløser biologiske molekyler, noe som betyr at den ikke kan brukes direkte til levering av farmakologiske forbindelser 7 . Dette problemet ble overvunnet ved å tilveiebringe slike forbindelser gjennom platen av størknet vekstmedium som agarplaten hviler på. Mens perfusjonssystemer vil forbli den valgte metode for utvaskingsforsøk, har imagingkammeret blitt anvendt med suksess for administrering av dexametason 12 og andre forbindelser. Ett notat, mens denne artikkelen var under forberedelse, beskriver Wagenheim og kollegaer 18 et kammer for avbildning av lateral rotutvikling ved bruk av lysmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, for frø-uttrykker RFP-TUB6 og en anonym anmelder for nyttige korreksjoner. Vi er takknemlige for Prof. Hugh Dickinson for å varsle oss om bruken av cellulosefilm som en mekanisk støtte og til John Baker for fotografering. Dette arbeidet ble støttet av BBSRC forskningsstipendier BB / G013993 / 1 og BB / D004055 / 1 til IM, og en BBSRC doktorgradspris og Clarendon Scholarship til CK
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |