Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.
Yanal kök morfogenezisi gibi bitki gelişiminin birkaç yönü, birkaç günün zaman aralıklarında meydana gelir. Altta yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, fizyolojik koşulları koruyan yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı mikroskopi stratejileri gereklidir. Bitki dokularında, sürekli gaz değişimi ile yeterli besin ve su temini olmalıdır; ancak lamel altına batırılmış ve hareketsiz hale getirildiğinde, anoksiye karşı özellikle hassastırlar. Başarılı bir şekilde uygulanan bir strateji, oksijen ve besin maddelerinin sürekli bir şekilde tedarik edilmesi için bir perfüzyon sisteminin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, bu gibi düzenlemeler karmaşık, hantal olabilir ve özel ekipman gerektirir. Burada, daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılan basit bir görüntüleme sistemi için alternatif bir strateji sunulmuştur. Bu sistemin kurulumu kolaydır, minimum ekipman gerektirir ve birkaç görüntüleme haznesinin kurulmasına ve eşit olarak görüntülenmesine imkân tanıyan bir mikroskop sahnesine kolayca monte edilir.allel. Bu sistemde, yanal kök büyüme oranları ilk iki gün boyunca agar plakalarında standart koşullardaki büyüme hızlarından ayırt edilemez ve yanal kök büyümesi en az bir gün daha düşük oranlarda devam eder. Bitki dokuları, aynı zamanda bir dizi farmakolojik bileşimi uygulamak için kullanılabilen bir agar plakası yoluyla besinlerle birlikte verilir. Sistem yanal kök gelişimini izlemek için kurulmuştur ancak hipokotiller ve birincil kökler gibi diğer bitki organlarına kolayca uyarlanabilir.
Bitki gelişiminin altında yatan hücresel ve subselüler süreçleri incelemek için, yüksek çözünürlüklü uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme stratejileri için artan bir talep vardır. Bu tür görüntüleme deneylerinde kilit bir zorluk, yeterli gaz alışverişi artı bir su ve besin maddesi arzı 1 , 2 , 3 artı içeren fizyolojik koşulların bakımıdır. Optimum optik çözünürlük için yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip objektifleri kullanmak için, numuneler lamine camlara paralel olarak yerleştirilmelidir. Görüntüleme sırasında x, y ve z yönlerinde hareket ideal bir şekilde minimum olmalıdır.
Fide genellikle kısa süreli görüntüleme için suya veya sulu çözeltiye monte edilirken, su, CO 2 ve O 2'yi çözmek için düşük kapasiteye sahiptir (sırasıyla 20 ° C, 0.1 MPa'da 1.54 mg / mL ve 0.04 mg / mL) Hangi yaparUzun zaman atlamalı deneyler için uygun değildir. Sürekli oksijen ve besleyici seviyelerini koruyan perfüzyon sistemleri bu sorunun bir çözümündedir ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 1 , 2 , 3 ve ışık levha mikroskopisi (LSM) için geliştirilmiştir. RootChip 2 ve RootArray 3 gibi sistemler, gelişmekte olan köklerin zaman aşımı görüntülemesi için özel olarak tasarlanmış ve özel olarak inşa edilmiş çok örnekli bir aygıta çimlenen tohumları dahil etmiştir. Bu düzenlemeler minimal mekanik bozulmayı sağlar ve birden fazla fidenin paralel analizi için tasarlanmıştır, ancak subselüler yapıların görüntülenmesi için optimize edilmemiştir. Calder ve meslektaşları, alt hücreli yapıların görüntülenmesi için optimize edilmiş daha karmaşık bir perfüzyon tabanlı görüntüleme haznesi tasarladılar; buradaki örnek, bir ağ tarafından konumunda tutulduYüksek büyütmeli daldırma merceklerinin kullanılmasına izin vermek için 1 .
Burada, perfüzyon sistemlerine dayalı olmayan, ancak yakın zamanda Arabidopsis görüntüleme 6 , 7 , 8 için bir montaj aracı olarak popülerlik kazanan bir perflorokarbon olan perflorodekalin (PFD) kullanan, bu probleme alternatif, basit bir çözüm sunulmuştur . Bu tür uygulamalarda, CO 2 ve O 2'yi çözmek için PFD'nin yüksek kapasitesi (PFD'de O 2 için 1.9 g / mL, sudaki 0.04 mg / mL'ye kıyasla) 9 dalmış doku ile gaz değişimine izin verir. Ayrıca, PFD floresan değildir ve refraktif indeksi (1.313) suyun (1.333) ile karşılaştırılabilir ve hava (1.000) 6'ya göre sitosolünkine (~ 1.4) daha yakındır. Perflorokarbonların, çeşitli bitkiler ve bitki türleri üzerinde minimum fizyolojik etkisi olduğu bildirilmiştir.Çay tohumları, PFD'ye batırıldığında kolayca çimlenir ve su ile beslendiğinde en az iki tam gün normal büyüme ve gelişme gösterir. Benzer gözlemler, Arabidopsis tohumlarını çimlemek için yapılmıştır 6 . Littlejohn ve meslektaşları, sedimantasyondan sonra Arabidopsis yaprak dokularında PFD dağılımını doğrudan görüntüleyecek uyarılmış Raman saçılımına dayanarak, PFD'nin canlı hücreler tarafından alınmayacağına karar verir. PFD daha önce, düşük yüzey gerilimi nedeniyle hava boşluklarına kolayca nüfuz ederek görüntü derinliğini önemli derecede arttıran görüntü anten dokuları için ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Burada, PFD, lateral köklerin gelişiminin uzun vadeli konfokal görüntülemesi için benimsenmiştir. Bu konfigürasyonda, bir veya daha fazla fide agar ile katılaşmış ve PFD'ye batırılmış bir büyüme ortamı plakası üzerine yerleştirilir. PFD, gGörüntüleme odasında aseöz değişim, anoksi önleme. PFD, yüksek gaz geçirgenliği olan poli (dimetilsiloksan) zamk contası (CO 2 için 1.5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ) 11 ile tutulduğu için oldukça uçucudur. Besinler ve su, agar ile katılaşmış ortam plakasıyla sağlanır. Aynı zamanda, bu agar plakası nazikçe lamel karşı kök presler, böylece görüntüleme odasında göreli konumu sabitleme ve yüksek çözünürlüklü su daldırma lenslerin kullanımına izin veriyor. Ayrıca, agar kütüğü dexamethasone, oryzalin ve isoksaben dahil bir dizi farmakolojik tedavinin uygulanmasında kullanılabilir. Görüntüleme odaları, asgari ekipman kullanılarak standart mikroskopik slaytlardan çok sayıda monte edilebilir. Görüntüleme odaları, yanal kök gelişimini incelemek üzere geliştirildi ve karakterize edildi, ancak birincil kök ipuçları gibi diğer fide organlarını görüntülemeye vehipokotilleri.
Burada sunulan yöntem, iki ila üç gün boyunca gelişen yanal köklerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için basit bir stratejidir. 48 saate kadar periyodlar için, görüntüleme sisteminin yanal kök gelişimine olumsuz etkisi gözlemlenmemiştir. 48 saat sonra, ortalama yanal kök büyümesi yavaşlamaya başladı, ancak köklerin önemli bir alt kümesi (% 37) plakalardaki ortalama kök büyümesiyle karşılaştırılabilir oranlarda büyümeye devam etti. Bu nedenle, yeteri kadar sayıda kök görüntüleyerek, büyümesi 48 saat sonra yavaşlayan kökler hariç tutulabilir. Görüntüleme odalarının sistematik testleri 72 saatten uzun süreler için gerçekleştirilmedi, ancak uzatılmış görüntüleme periyotları aranıyorsa alternatif stratejiler önerilir. Görüntüleme odaları, eğer uygun çevresel koşullar sağlanırsa veya bir büyüme tesisine kaldırılır ve mikroskopta periyodik olarak geri gönderilirse, mikroskop sahnesinde sürekli olarak bırakılabilir. Bu, sayısız odaların paralel olarak görüntülenmesini sağlar. </ P>
Burada açıklanan odacıkların bir avantajı, yanal köklerin konumlarına sabitlenmesidir ve yüksek çözünürlüklü su daldırmalı lensler kullanılarak görüntülenebilir. Mekansal kararlılık kritik olarak destekleyici agar levhasında kullanılan agar konsantrasyonuna bağlıdır. Başlangıçta bu aralıktaki yüksek konsantrasyonların uzaydaki kökleri sabitlediğini, ancak kök büyümesinin daha hızlı yavaşladığını ve bazı köklerin, azalmış hücre uzaması da dahil olmak üzere mekanik stres belirtileri sergilediğini ortaya koyan başlangıçta% 0.8 agardan% 2 ağza kadar çeşitli konsantrasyonlar test edildi. Buna karşılık, düşük agar konsantrasyonları, gerekli destek sağlamadı ve görüntüleme sırasında x, y ve z'de sürüklenen kökler. Optimum% 1.5 agar kütüğü, olumsuz mekanik etkiler olmadan numunenin konumunu düzeltir. Bu koşullar altında, ilk 30 dakika içerisinde yerleştikten sonra, kökler gece gündüz veri edinimine izin vererek, birçok saat boyunca kararlıdır. 4D verilerinin edinimi sırasında z-yığın aralıkları genelde bEk bir 5-10 um ile raketlenmişti, ancak bu temelde z-drift veya sallantıdan ziyade yanal köklerin düzlem dışı büyümesini barındıracaktı. Standart agar konsantrasyonu penetrasyona karşı bir miktar direnç sağlamasına karşın, gravitropik olarak büyüyen kökler agara nihayet nüfuz eder. Bununla birlikte, görüntüleme odasının ufak bir modifikasyonuyla, kök büyümesi lamel paralel olarak paralel tutulabilir, böylece daha büyük lateral kökler ve birincil kökler görüntülenebilir. Dahası, temel görüntüleme bölmesi, hipokotiller için kolayca özelleştirilebilir. Hypocotyls bu sistemde daha serbestçe yüzer, bu nedenle görüntü yakalama için z ekseni braketi genellikle yaklaşık 20 μm'ye kadar yükselmiştir. Bu çalışmada, substrat özelliklerinin kontrol edilmesine izin veren dik bir mikroskop kullanılmıştır. Görüntüleme odası, ters mikroskop konfigürasyonlarına uyarlanabilir, ancak organları müdahale etmek için katı örtücülerin zamana bağlı etkisi değerlendirilmelidir. </p>
Littlejohn ve meslektaşları, PFD'nin kendisinin biyolojik molekülleri kolayca çözmediğini ve bunun farmakolojik bileşiklerin 7 sağlanması için doğrudan kullanılamayacağı anlamına geldiğini belirtti. Bu problem, bu bileşiklerin agar levhasının üzerinde durduğu katılaşmış büyüme ortamı plakası içinden temin edilerek engellendi. Perfüzyon sistemleri yıkama deneyleri için tercih edilen yöntem olmaya devam ederken, görüntüleme bölmesi deksametazon 12 ve diğer bileşiklerin uygulanması için başarıyla kullanılmıştır. Bir makale, bu makale von Wagenheim ve meslektaşları18 hazırlanırken, ışık saçlı mikroskopi kullanılarak yanal kök gelişimini görüntüleyen bir odayı açıkladı.
The authors have nothing to disclose.
Tohum ekspres RFP-TUB6 ve faydalı düzeltmeler için isimsiz bir inceleme uzmanı olan British Columbia Üniversitesi'nden Prof. Geoffrey Wasteneys'e teşekkür ediyoruz. Profesör Hugh Dickinson'a mekanik bir destek olarak selüloz filmi ve fotoğraf için John Baker'i bizi uyarması için minnettarız. Bu çalışma BBSRC araştırma hibeleri BB / G013993 / 1 ve BB / D004055 / 1 IM tarafından desteklendi ve bir BBSRC Doktora Eğitim Ödülü ve CK Clarendon Bursu
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |