Summary
Pankreaskanalinfusjon er en viktig teknikk som kan muliggjøre avledningssporing, genintroduksjon og cellelinjespesifikk målretting. En bukspyttkjertelkanalinfusjonsteknikk for legemiddel og viral levering til bukspyttkjertelceller presenteres her.
Abstract
Bukspyttkjertelen er et bifunksjonelt organ med både endokrine og eksokrine komponenter. En rekke patologier kan ramme bukspyttkjertelen, inkludert diabetes, pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen. Alle disse tre sykdommene markerer aktive studieområder, ikke bare for å utvikle umiddelbar terapi, men også for å bedre forstå deres patofysiologi. Det er få verktøy for å fremme disse studieområdene. Pankreaskanalinfusjon er en viktig teknikk som kan muliggjøre avledningssporing, genintroduksjon og cellelinjespesifikk målretting. Teknikken krever intrikat disseksjon av den andre delen av tolvfingertarmen og ampulla, etterfulgt av okklusjon av gallekanalen og kannulation av bukspyttkjertelkanalen. Selv om teknikken er teknisk utfordrende i begynnelsen, er applikasjonene utallige. Tvetydighet i detaljene i prosedyren mellom grupper fremhevet behovet for en standardprotokoll. Dette arbeidet beskriver uttrykket av et grønt fluorescerende protein (GFP) i bukspyttkjertelen etter pankreaskanalinfusjonen av en viral vektor som uttrykker GFP versus en skamoperasjon. Infusjonen og derfor uttrykket er spesifikt for bukspyttkjertelen, uten uttrykk tilstede i noen annen vevstype.
Introduction
Bukspyttkjertelen er et bifunksjonelt organ, med både endokrine og eksokrine komponenter. En rekke patologier kan ramme bukspyttkjertelen, inkludert diabetes, pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen1. Alle disse tre sykdommene markerer aktive studieområder, ikke bare for å utvikle umiddelbar terapi, men også for å bedre forstå deres patofysiologi.
En målrettet terapeutisk leveringsmetode vil være gunstig. Vi har utviklet en pankreas kanal infusjonsteknikk som er en effektiv og selektiv metode for legemiddel og viral levering til bukspyttkjertelceller. I denne modellen er bukspyttkjertelkanalen selektivt kanylert, og den vanlige gallekanalen er okkludert, noe som gjør det mulig å levere utelukkende til bukspyttkjertelen.
Denne teknikken kan tillate avstamning sporing av bestemte celletyper for å ytterligere belyse utviklingsveiene som er viktige for bukspyttkjertelutvikling og patologi2,3. Ulike promotorer i virale vektorer tillater spesifikk målretting av cellelinjer og for innføring av gener i disse cellelinjene4,5. Dette arbeidet demonstrerer uttrykket av et grønt fluorescerende protein (GFP) i bukspyttkjertelen etter pankreaskanalinfusjonen av en viral vektor som uttrykker GFP versus en skamoperasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Dyreforsknings- og omsorgskomiteen ved Children's Hospital of Pittsburgh og University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preoperativ forberedelse
- Administrer inhalert isofluran (1 - 3% for vedlikehold og opptil 5% for induksjon) via en nesekegle til et passende bedøvelsesnivå. Overvåk tilstrekkeligheten av anestesi ved tåklemme med tang. Mangelen på respons anses som tilstrekkelig, og sørg for ikke å overmedisinere, da respirasjonsdepresjon kan oppstå.
- Plasser dyret på ryggen på dissekeringsmikroskopstadiet, med magen sentrert i lys av målet. Immobiliser dyret med kirurgisk tape. Påfør oftalmisk salve på dyrets øyne for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi.
- Påfør et glatt, tykt lag med hårfjerningskrem og la det være på plass i 3 minutter. Sjekk et lite område for hårfjerning. Tørk forsiktig av krem og hår med 70% etanol-gjennomvåt gasbind.
- Rengjør og desinfiser dyrets underliv ved å tørke det med en 70% etanol-gjennomvåt gasbind etterfulgt av en betadine-gjennomvåt gasbind. Oppretthold sterile forhold gjennom hele den kirurgiske prosedyren.
2. Riktig eksponering
- Lag et midtlinje snitt i huden fra xyphoid-prosessen til navlestrengen ved hjelp av en skalpell. Løft bukhinnen med Adson tang og lag et lite hull i midtlinjen ved hjelp av saks.
- Utvid det bukhinneale snittet til lengden på hudsnittet, pass på å forbli på midtlinjen (linea alba).
MERK: Dette vil produsere en øvre midline abdominal laparotomy. - Løft leveren med stumpe retraktorer for å eksponere den vanlige gallekanalen. Klem den vanlige gallekanalen med en buet bulldog vaskulær klemme.
MERK: Denne manøveren forhindrer uønsket infusjon i leveren.
3. Identifikasjon av bukspyttkjertelen Papilla og Duodenotomy
- Identifiser tolvfingertarmen, og med Arruga-tang trekker du det tilbake for å vise papillaen.
MERK: Papillaen er en hvit flekk på den fremre overflaten av den andre delen av tolvfingertarmen. - Trekk tilbake tolvfingertarmen, slik at du kan identifisere bukspyttkjertelkanalen. Med en 301/2-gauge nål punkterer du veggen av tolvfingertarmen tangentielt, rett overfor papillaen.
MERK: Nålen skal ha samme vinkel som kanalen når den kommer inn i tolvfingertarmen.
4. Infusjon.
- Før kateteret gjennom duodenotomien som ble opprettet i trinn 3.2 til kateteret er synlig i kanalen. Før kateteret inn i kanalen ikke mer enn 1 cm for å forhindre bypass av mindre kanalelver.
- Klem kateteret på plass med en annen buet bulldog vaskulær klemme. Slå på pumpen og fyll på det valgte volumet. Volumet infundert kan variere fra 25 - 250 μL, med et ideelt volum på ca. 150 μL.
- Administrer en intraperitoneal injeksjon på ca. 1,5 ml saltvann for å kompensere for tap. Dekk den eksponerte tarmen med en fuktig gasbind for å forhindre uttørking.
- Ved avslutningen av infusjonen, fjern bulldogklemmen som holdt kateteret på plass. Bruk bulldogklemmen til forsiktig å fjerne kateteret fra bukspyttkjertelen. Løsne klemmen fra den vanlige gallekanalen.
- Lukk bukhinnen og huden i ett eller to lag ved hjelp av en løpende sutur.
MERK: Det er ikke nødvendig å lukke duodenotomien, da den vil forsegle seg selv. - Som postoperativ analgesi, administrer en dose ketofen ved 5 mg / kg under prosedyren og en påfølgende dag.
- Returner musen til buret under en varmelampe til den gjenoppretter. Gi musen mat og vann ad libitum.
- Ikke la dyret være uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal heftelse. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før det er fullstendig gjenopprettet.
5. Prøveforberedelse
- Plasser dyret i et karbondioksidkammer eller utfør cervical dislokasjon.
- Høst bukspyttkjertelen, med milten, leveren og tolvfingertarmen som kontroller. Fest vevet i paraformaldehyd over natten ved 4 °C. Cryoprotect prøven i 30% sukrose over natten, som tidligere beskrevet6.
- Sett i gang prøvene. Seksjon vevet med en tykkelse på 6 μm ved hjelp av en mikrotom. Utfør avbildning på et mikroskop med fluorescensavbildning, som tidligere beskrevet7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med praksis og forsiktig kirurgisk teknikk bør overlevelsesraten til disse musene være større enn 95%. En uke etter infusjonen skal den ønskede effekten være tydelig i bukspyttkjertelen. Mus ved 10 til 12 uker ble brukt til pankreaskanalinfusjoner. Her bruker vi en adeno-assosiert virus serotype 8 (AAV8) med en CMV-promotor for å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP), sammenlignet med en falsk kirurgi. Mus bukspyttkjertelen ble høstet 7 dager etter infusjonene. Deler av bukspyttkjertelen, milten og tolvfingertarmen ble farget med insulinantistoff og Hoescht. Figur 1 viser at det er et omfattende uttrykk for GFP gjennom bukspyttkjertelen hos musene som gjennomgikk pankreaskanalinfusjon med AAV8, i motsetning til de som gjennomgikk sham kirurgi. Det er ikke noe uttrykk i leveren, milten eller tolvfingertarmen i disse musene, og dokumenterer dermed infusjonens selektive natur. Disse dataene kan bekreftes med flere andre metoder, inkludert DNA- og RNA-uttrykksprofiler.
Figur 1. Uttrykk for GFP etter pankreaskanalinfusjon. (a) Sham kirurgi sammenlignet med (b) pankreas kanalinfusjon med AAV8 uttrykke GFP. Skalalinjen representerer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver i detalj metodikken bak pankreaskanalinfusjon, en effektiv musemodell for levering av gener og andre molekyler spesielt og effektivt til bukspyttkjertelen. Tvetydighet i detaljene i prosedyren mellom ulike grupper fremhevet behovet for en standardisert protokoll8,9,10.
Det er flere kritiske trinn i prosedyren, som begynner med valg av unge, sunne mus. Perforering av tolvfingertarmen, men liten og kontrollert, er en traumatisk hendelse i musen som utvilsomt fører til rekruttering av inflammatoriske cytokiner og andre faktorer som ikke har blitt fullstendig karakterisert. Derfor er en delikat disseksjon avgjørende, og det er også å skape den minste duodenotomy mulig for innføring av kateteret. Det viktigste trinnet i hele prosedyren er kannasjonen av bukspyttkjertelkanalen med leveringssystemet.
Vanskeligheter kan oppstå med overdreven forstyrrelse av bukspyttkjertelen papilla, noe som fører til en overveldende systemisk inflammatorisk respons. Bukspyttkjertelen er et delikat organ; i det kirurgiske samfunnet er det kollokvialt beskrevet som et organ å ikke "rote" med. Suksessratene vil variere bare litt med utøver ferdighetsnivå. Så lenge gallekanalen er riktig okkludert, vil infusjonen være 100% spesifikk for bukspyttkjertelen alene.
Læringskurven for prosedyren er ganske bratt, og hovedbegrensningen er overvunnet med praksis. Som tidligere nevnt kan overdreven manipulering av tolvfingertarmen og bukspyttkjertelen føre til en overveldende inflammatorisk respons som må unngås.
Prosedyren har bred anvendbarhet på tvers av mange forskjellige fagområder. Det kan brukes som en metode for målrettet genlevering ved bruk av spesifikke virale vektorer11. Prosedyren kan også tillate spesifikk infusjon av molekyler som hjelper til med belysningen av bukspyttkjertelcellefunksjonen. Den spesifikke leveransen av visse molekyler er en tiltalende metode for å endre signalveiene i holmene for å produsere spredning12. Systemet kan også motvirke behovet for transgen avl ved å direkte produsere en ønsket genotype og fenotype i bukspyttkjertelen. Applikasjonene er utallige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkjennelser. Midler ble mottatt fra Foundation of Health and Family Planning Commission of Zhejiang-provinsen (Grant 20146242) og stiftelsen av Wenzhou Science &Technology Bureau (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
